We would like to thank Dr. Hiroshi Miyazaki, Dr. Scott Henderson, Dr. Todd Kitten, Dr. Justin Hutcherson, Dr. Catherine Jauregui, and Collin R. Berry. This work was supported by NIH NIDCR grants R01DE016124, R01DE018039, and R01DE023304 to J.P. Lewis.
Microscopy was performed at the VCU Department of Anatomy and Neurobiology Microscopy Facility, supported, in part, with funding from NIH-NINDS Center core grant (5P30NS047463).

I seguenti protocolli descrivono i metodi per la coltura e lo studio l&#39;invasione da parte della specie anaerobiche, P. gingivalis; Tuttavia, possono essere utilizzati tali protocolli per un certo numero di agenti patogeni anaerobici. Anche se vengono utilizzati HUVECs, questo protocollo può essere utilizzato per altre cellule eucariotiche sia immunitarie e non immuni. 1. anaerobica Camera uso e manutenzione Nota: P. gingivalis è un anaerobio sensibile ai normali livelli di ossigeno riscontrati nell&#39;aria ambiente. Un ambiente anaerobico controllato è di vitale importanza per la coltivazione del P. gingivalis. <ol><li> Qui, mantenere un&#39;atmosfera artificiale designato come gas anaerobico misto (80% N 2, 10% H 2, 10% CO 2) in una camera di vinile anaerobica (Figura 1A). Utilizzare una camera di compensazione (Figura 1B) per trasferire oggetti dall&#39;ambiente di laboratorio alla camera anaerobica. La camera di compensazione opera manualmente, twspurgo ghiaccio con N 2 gas prima di introdurre il gas misto anaerobico. </li><li> Utilizzare una colonna di rimozione dell&#39;idrogeno solforato (Figura 1C) per la rimozione del solfuro di idrogeno indesiderabile senza manutenzione. Collocare un deumidificatore entro la camera per rimuovere H 2 O creato dal catalizzatore e per evitare aerosol che facilitano la diffusione della contaminazione. Nota: L&#39;idrogeno solforato è un sottoprodotto metabolico naturale di molti batteri anaerobici e l&#39;accumulo è tossica per i batteri e può provocare danni all&#39;elettronica e diminuire la durata di un catalizzatore. </li><li> Utilizzare una scatola ventilatore per far circolare l&#39;atmosfera della camera attraverso un catalizzatore di palladio, che rimuove l&#39;ossigeno in presenza di idrogeno (Figura 1D). Nota: Un atmosferico (HEPA) ricircolo rimuove i contaminanti presenti nell&#39;aria con una dimensione di 0,22 micron o più grandi. </li><li> Batteri anaerobici cultura a 37 ° C incubatore che si trova all&#39;interno del anaerobicacamera. Utilizzare tecniche asettiche standard, quando si lavora all&#39;interno della camera anaerobica. </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53408/53408fig1.jpg" /> Figura 1. camera anaerobica vinile e dei suoi componenti. (A) Una camera anaerobica vinile sigillato completamente dall&#39;ossigeno atmosferico fornisce spazio di lavoro per due persone alla volta (32 in x 78 in). Contiene un incubatore a 37 ° C (posteriore centrale). (B) una camera di compensazione è utilizzato per il trasferimento di articoli dalla ambiente di laboratorio alla camera anaerobica. Nell&#39;immagine è una camera di compensazione automatica gestito tramite un controller che può essere programmato per eseguire automaticamente le procedure di vuoto e spurgo necessarie per creare un ambiente anaerobico. (C) Un acido solfidrico Colonna rimozione fornisce rimozione elevata capacità esente da manutenzione di indesiderabile idrogeno solforato. (D) Due contenitori di fan catalizzatore sonoposto in tutta la camera anaerobica per favorire la circolazione dell&#39;atmosfera della camera attraverso il palladio catalizzatore, che, in presenza di idrogeno, rimuove l&#39;ossigeno. La camera di anaerobico è impostato secondo le istruzioni del produttore. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53408/53408fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> 2. Preparazione di batteri anaerobici Nota: P. gingivalis è aerotolleranti e può essere conservato in condizioni aerobiche, ma non crescerà in presenza di ossigeno a livelli superiori a 6% 17,18. Una camera anaerobica è necessario per il corretto coltivazione di P. gingivalis e altre specie anaerobiche (Figura 1). È necessaria una formazione adeguata e di educazione sull&#39;uso camera anaerobica prima di lavorare con microanaerobes 19. <ol><li> Equilibrare tutti i liquidi e le piastre a condiz anaerobicaioni per almeno 12 ore prima della sperimentazione per rimuovere l&#39;ossigeno residuo. </li><li> Trasferimento P. gingivalis da -80 ° C freezer alla camera anaerobica, lasciate disgelo. </li><li> Streak P. gingivalis su piastre di agar sangue soia Trypticase (TSA II con il 5% di sangue di montone). Wrap piastre in parafilm e conservare a 37 ° C in un incubatore anaerobico per 4-7 giorni. </li><li> Seminare P. gingivalis in 3 ml di Brain Heart Infusion (BHI) brodo integrate con emina e menadione, un arricchiti terreni liquidi non selettivi per l&#39;isolamento e la coltura di anaerobi e microrganismi esigenti, usando i loop sterili. Nota: Per la conservazione a lungo termine, mescolare colture batteriche preparate in BHI con glicerolo o DMSO (concentrazione finale 10-20%) e posto in una -80 ° C freezer. </li><li> Preparare una coltura starter di P. gingivalis facendo una diluizione 1:10 e permettendo ai batteri di crescere fino a metà fase di log. </li></ol> Nota: La densità ottica del bacsospensione riale è determinato e la concentrazione di batteri per ogni ceppo da esaminare viene regolata. Per P. gingivalis una sospensione a OD 660 di 0,7 corrisponde alla fase di mid-log e ~ 7 x 10 8 cellule / ml. Condizioni di crescita descritte nel protocollo di cui sopra sono specifici per P. gingivalis e potrebbero dover essere adattato per altri ceppi batterici. 3. Endothelial Cell Culture Nota: Acquisto pool HUVECs primarie e cultura a medio basale contenenti fattori di crescita endoteliale vascolare (VEGF) a 37 ° C in 5% di CO 2 in base alle istruzioni del produttore. <ol><li> HUVECs Seed in T-75 palloni a 2.5 x 10 5 cellule / fiasco in 15 ml mezzi VEGF. Nota: Controllare la redditività attraverso una diluizione 1: 1 con il 4,0% trypan blu. Le cellule con una membrana compromessa manterrà trypan blu, le cellule sane con membrana è ancora intatta appariranno bianco se visti al microscopio ottico binoculare. Count 100 cellule, in modo che oltre l&#39;80% delle cellule sono vitali 20. </li><li> Sostituire i media ogni 2 giorni con pre-riscaldato supporti VEGF fresco fino a cellule raggiungono ~ 80% di confluenza. </li><li> Lavare le cellule una volta con PBS preriscaldata. Liberate cellule dal matraccio T75 incubando con 2 ml di tripsina-EDTA (0,25%) per 5 min seguita da soluzione neutralizzante 2 ml di tripsina. </li><li> Raccogliere HUVECs sospesi in un tubo da 50 ml. Lavare le cellule in più dal T-75 palloni con PBS e trasferire 50 ml provette coniche. </li><li> Cellule centrifugare a 200 xg per 10 min. </li><li> Rimuovere il surnatante, sospendere pellet cellulare in 10 ml di media VEGF pre-riscaldato. </li><li> Determinare la concentrazione cellulare mediante un emocitometro o un dispositivo simile conteggio delle cellule. </li><li> Calcola quantità di sospensione cellulare per aggiungere a uno 6-pozzetti (400.000 / pozzetto) o 12-pozzetti con coprioggetto (50.000 / pozzetto). HUVECs sarà pronto per la sperimentazione del giorno successivo. </li></ol> 4. La sopravvivenza Assay Invasion / Interazione(Placcatura) Nota: Quando si esegue questo test, preparare due 6 pozzetti delle cellule endoteliali seminate a 400.000 cellule / pozzetto. Una piastra sarà utilizzato per valutare batteri attaccati da e interiorizzati da cellule ospiti. L&#39;altra piastra rappresenterà per i batteri intracellulari. La piastra da 6 pozzetti consente triplicato di due campioni da eseguire in un esperimento. Per una descrizione di questo protocollo fare riferimento al diagramma di flusso del test di sopravvivenza (Figura 2). <ol><li> Preparare batteri anaerobici come sopra descritto (vedi capitolo 1) fino a raggiungere una crescita mid-log (OD 660 0,5-0,7). </li><li> Batteri centrifugare a 5.000 g per 10 min. Nota: se centrifuga è al di fuori della camera anaerobica, trasportare i campioni batterici in un tubo ben chiuso da 15 ml, avvolgere il tappo con parafilm per evitare perdite di ossigeno. </li><li> Posizionare pellettato P. gingivalis indietro nella camera, scartare il surnatante. Lavare con PBS, batteri pellet di nuovo prima di risospendere in VEGF media. Preparare sospensioni per tutti i ceppi batterici da testare a OD 660 di 0,7 che corrisponde alla fase di mid-log (~ 7 x 10 8 cellule / ml). I batteri sono ora pronti per l&#39;infezione. </li><li> Trasferimento 6-pozzetti contenenti HUVECs dal tessuto cultura incubatore nella camera anaerobico. Rimuovere i supporti e lavare tre volte con PBS anaerobica. Aggiungere 2 ml di media VEGF anaerobica in ciascun pozzetto e posizionare le piastre a 37 ° C in incubatore anaerobico per 20 min per equilibrare la temperatura per l&#39;infezione. Nota: i batteri piastra su piastre di agar sangue per garantire quelli utilizzati per le infezioni sono omogenei e non contaminati dopo l&#39;infezione. </li><li> Infect cellule ospiti con batteri ad una molteplicità di infezione (MOI batteri: host) di 100: 1. Nota: numero di cellule HUVEC è determinato eseguendo un test di esclusione del trypan una singola ben prima dell&#39;infezione. Numero di cellule batteriche viene determinata mediante densità ottica (ad esempio, 0,5 OD = 5 x 10 8 cellule / ml). Bconcentrazione acterial viene regolato alla corretta MOI basato sulla concentrazione HUVECs 21. </li><li> Mettere 6 pozzetti con HUVECs infetti in incubatrice anaerobica e permettono ai batteri di interagire con le cellule ospiti per 30 min. </li><li> Preparare saponina in BHI (1,0% w / v) all&#39;interno della camera anaerobica e filtrata attraverso un filtro da 0,2 micron. </li><li> La sopravvivenza di entrambi i batteri attaccati e interiorizzato. <ol><li> Rimuovere le piastre dal termostato, i media aspirare, lavare tre volte con anaerobica PBS e aggiungere 2 ml di filtrati 1,0% saponina (preparato come descritto al punto 4.8). Incubare per 15 minuti per consentire la lisi della cellula ospite. </li><li> Raschiare fondo di ogni pozzetto con raschietto cellulare. Raccogliere la miscela di cellule da ciascun pozzetto e fare una diluizione 1: 1 in BHI. </li><li> Procedere per fare diluizioni seriali del campione. A seconda delle specie batteriche e concentrazione, regolare diluizioni seriali. Iniziare con 1: 100 o 1: 1.000 diluizioni. </li><li> Piatto 200 ml di diluizione desiderata su piastre di agar sangue. Wrap tegli piastre in parafilm e posto in incubatrice anaerobica a 37 ° C. </li><li> A seguito di sette giorni di incubazione a 37 ° C, rimuovere le piastre e contare unità formanti colonie (CFU) utilizzando una scatola luminosa di contare manualmente colonie. Nota: CFU vengono enumerati. Per grandi quantità di CFU, le immagini possono essere prese e software possono essere utilizzati per facilitare l&#39;enumerazione di CFU. </li></ol></li><li> La sopravvivenza dei batteri interiorizzato. <ol><li> Rimuovere le piastre dal termostato. Lavare tre volte con PBS e anaerobica aggiungere media 2 ml di VEGF con integrate antibiotici (300 mg / ml di gentamicina e 400 ug / ml di metronidazolo). </li><li> Incubare per 1 ora. Assicurati di testare gli antibiotici in modo che siano al 100% efficace nell&#39;uccidere il ceppo batterico desiderato e fare in modo che essi non penetrano le cellule ospiti 22,23. </li><li> Aspirare il terreno, aggiungere 2 ml di filtrato 1,0% saponina. Incubare per 15 minuti per consentire la lisi della cellula ospite. </li><li> Raschiare inferiore di ogni well con raschietto cellulare. Raccogliere la miscela di cellule da ciascun pozzetto e rendere diluizione 1: 1 in BHI. </li><li> Preparare diluizioni seriali del campione (1: 100, 1: 1000). </li><li> Piatto 200 ml di diluizione desiderata su piastre di agar sangue. Avvolgere piastre in parafilm e posto in incubatrice anaerobica. </li><li> Dopo sette giorni di incubazione a 37 ° C togliere piastre e contare CFU. </li></ol></li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53408/53408fig2.jpg" /> Figura 2. Rappresentazione schematica di un protocollo utilizzato per la sopravvivenza dei batteri anaerobici con cellule eucariotiche. Entrambi i test per una sopravvivenza batterica totale e la sopravvivenza di batteri internalizzati possono essere eseguite contemporaneamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53408/53408fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> 5. internalizzazione di batteri in Ce HostLLS (Fluorescent Microscopy) Nota: P. gingivalis è etichettato con 2 &#39;, 7&#39;-Bis- (2-carbossietil) -5- (e-6) -Carboxyfluorescein, acetossimetil Ester (BCECF-AM). BCECF-AM è un colorante membrana permeabile non fluorescente; la sua conversione a BCECF fluoresceina tramite l&#39;azione di esterasi intracellulari può indicare la vitalità cellulare. P. gingivalis è etichettato con il BCECF-AM colorante e poi utilizzato per infettare le cellule eucariotiche. A seguito di infezione, le cellule vengono fissate ed etichettati con DAPI e TRITC-falloidina. La macchia DAPI utilizzato per colorare il nucleo della cellula eucariotica anche etichettare nucleo della cellula batterica, che fornisce una contromisura per identificare i batteri non vitali che non possono metabolicamente fendere BCECF-AM. Cellule ospiti sono evidenziati con TRITC-falloidina, un actina colorante rosso. <ol><li> Coprioggetti Autoclave. Aggiungere asetticamente coprioggetti a piastre da 12 pozzetti prima della semina cellule endoteliali a 5 x 10 4 cellule / pozzetto. (Giorno preparati prima dell&#39;esperimento) </li><li&gt; hanno cellule endoteliali preparati su 18 mm (# 1.5) spessore coprioggetto circolari in piastre da 12 pozzetti come descritto sopra. </li><li> Preparare batteri anaerobici cresciuti a metà fase di log (OD 660 = 0,5-0,7), come descritto nella sezione 1. </li><li> Batteri Lavare 2x con PBS anaerobica per centrifugazione a 5.000 xg e sospende pellet in PBS a 5-7 x 10 8 cellule / ml. </li><li> Aggiungere 20 ml di 0,2 mM BCECF-AM a 2 ml di sospensione batterica (5-7 x 10 8 cellule / ml) ad una concentrazione finale di BCECF-AM di 2 mM. </li><li> Incubare a 37 ° C per 30 minuti al buio. </li><li> Piastre di trasferimento con le cellule endoteliali seminate su 18 mm (# 1.5 spessore) lamelle circolari dal coltura tissutale incubatore nella camera anaerobico. Lavare con PBS e scambio con i media VEGF anaerobica. Nota: Verificare che HUVECs sono sani al microscopio ottico. HUVECs dovrebbe essere ~ 80% confluenti, morfologia dovrebbe essere paragonabile ai produttori. </li><li> Centrifuga etichettato batteri a5.000 xg per 10 min per rimuovere residui di colorante BCECF-AM. Sospendere in 2 ml di mezzi VEGF anaerobica. </li><li> Infettare le cellule ospiti con batteri etichettati a MOI di 100: 1 (batteri: host). </li><li> Incubare in ambiente anaerobico a 37 ° C per 30 min. </li><li> Dopo che le cellule lavare infezione con PBS per tre volte e fissare in preparati al momento 4,0% paraformaldeide per 10 min. Nota: Dopo aver fissato le cellule, esperimento può essere condotto all&#39;esterno della camera anaerobica. </li><li> Lavare coprioggetto con PBS per tre volte. </li><li> Aggiungere 1 ml di 0,2% Triton X-100 per 10 min. </li><li> Lavare coprioggetto con PBS per tre volte. </li><li> Aggiungere 50 ml di TRITC falloidina (50 mg / ml) per vetrini per 45 min. </li><li> Lavare coprioggetto tre volte, togliere dal 12-pozzetti e posto su un vetrino con mezzo di montaggio morbido-set contenente DAPI. Sigillare i lati con smalto. Nota: vetrini possono essere conservati per un paio di mesi al buio. Evitare l&#39;esposizione alla luce per evitare che foto-sbiancamento. </li><li> Vista diapositiveutilizzando un microscopio confocale. <ol><li> Qui, utilizzare un sistema di 34 canali spettrali (rivelatore a serie di 32 canali e due rivelatori PMT lato, oltre a un rilevatore di luce trasmessa) configurato attorno ad un AxioObserver (invertito) stare con uno stadio XY motorizzato. Il sistema dispone di cinque laser: diodo blu (405 nm), multi-linea Argon (458, 488, 514 nm), LED verde (561 nm), rosso HeNe (633 nm) e un laser pulsato 440 nm. Dotare di un sistema di imaging a vita a fluorescenza con 2 rilevatori GaAsP ibridi (per FRET-FLIM). </li><li> Rileva la fluorescenza da DAPI e TRITC in un canale usando un filtro dual-band con lunghezze d&#39;onda di eccitazione di 340-380 nm e 540-560 nm, ed un filtro per le emissioni di 435-485 nm e 570-590 nm, rispettivamente. Rileva la fluorescenza da BCECF-AM utilizzando un filtro di eccitazione con lunghezza d&#39;onda di 440-500 nm e un filtro di emissione di 510-590 nm. Nota: Controlli per BCECF-AM dovrebbe essere fatto su ogni ceppo batterico in fase di studio per garantire la corretta etichettatura dei batteri vitali. In primo luogo verificare che nonviabbatteri LE sono DAPI-positivi e BCECF-negativi. In secondo luogo, in modo che batteri vivi possono metabolizzare BCECF-AM in fluoresceina BCECF. Concentrazioni variabili dei batteri o BCECF-AM dye possono avere bisogno di essere testati per l&#39;etichettatura ottimale. </li></ol></li></ol>

Authors have nothing to disclose.

Tutti i metodi di cui sopra possono essere utilizzati per progettare saggi specifici per valutare l&#39;interazione di batteri anaerobici con cellule eucariotiche. Tuttavia, ci sono diverse considerazioni per eseguire con successo gli esperimenti. Innanzitutto sono i ceppi microbici essere utilizzati in uno studio. E &#39;fondamentale nel confronto di due ceppi sia con il saggio di sopravvivenza come anche per microscopia che sono in fase di crescita simili e raggiungono concentrazioni cellu...

Batteri anaerobici colonizzano quasi tutte le superfici del corpo umano. Sebbene predominante nella flora dei tratti intestinali e genito-urinario in cui le concentrazioni di ossigeno sono bassi, esistono anche ad alti livelli sulla pelle, bocca, naso e gola 1. I batteri anaerobici sono una causa comune di infezioni endogene e sono spesso isolati da siti malati. Tuttavia, a causa della loro natura esigente, anaerobi possono essere difficili da isolare e cultura. Gli studi che coinvolgono batteri anaerobi devono essere effettuate in condizioni ristrette. Tecniche anaerobico-cultura moderna permettono ai ricercatori di imitare le impostazioni anaerobici necessarie per studiare molti ceppi di laboratorio anaerobica o addirittura isolati clinici 2,3. Batteri anaerobi patogeni hanno sviluppato un rapporto dinamico e co-evoluzione con le cellule ospiti in cui risiedono. La maggior parte degli anaerobi sono suscettibili di aver ucciso dalla risposta immunitaria dell&#39;ospite prima di raggiungere infectii livelli di unità organizzative. Tuttavia, alcuni batteri patogeni hanno sviluppato meccanismi per sfuggire o sovvertire la risposta immunitaria dell&#39;ospite. Compiono questo obiettivo attraverso meccanismi quali l&#39;evasione del riconoscimento immunitario, la neutralizzazione dei mediatori immunitari, alterazione di immunità cellulo-mediata, l&#39;invasione delle cellule ospiti e l&#39;alterazione delle immunitario segnalazione 4. Porphyromonas gingivalis, un anaerobio gram-negativi implicati sia orale e malattie extraorali, è un esempio di un batterio patogeno altamente adattato in grado di provocare cambiamenti patogeni nell&#39;ospite 5-7. Sacche di biofilm placca accantonati in profonde fessure formatesi tra i denti e tessuto mucoso gengivale può ospitare batteri anaerobici che sono protetti dall&#39;ossigeno atmosferico 8. Queste tasche parodontali servono come una nicchia per vari patogeni anaerobici, come P. gingivalis 9. P. gingivalis è un patogeno chiave di volta che è in grado di rimodellareing comunità microbica orale in modo da promuovere lo sviluppo e la progressione delle malattie parodontali 10. Produce un gran numero di fattori di virulenza che sono attivi contro un ampio spettro di proteine ​​dell&#39;ospite e fornisce meccanismi per evasione di difese dell&#39;ospite 11. È anche in grado di invadere epiteliali, endoteliali, fibroblasti e cellule del legamento parodontale in vitro e in vivo 12-14 15. Con efficacemente invadere cellule ospiti, P. gingivalis può sfuggire immunità dell&#39;ospite. Invasione efficace delle cellule ospiti non solo permette al batterio di sfuggire difese dell&#39;ospite ma serve anche da serbatoio per il futuro reinfezione e altera la cellula ospite. Sono necessari studi sui meccanismi molecolari coinvolti nella adesione e internalizzazione del batterio da cellule ospiti. La ricerca in diversi laboratori è focalizzata sulla comprensione degli eventi molecolari associati con l&#39;internalizzazione di P. gingivalis da parte delle cellule ospitinonché i meccanismi utilizzati per sopprimere e dirottare la risposta immunitaria e sopravvivere i meccanismi di difesa dell&#39;ospite ostili. Ci sono molti saggi in grado di identificare e caratterizzare agenti patogeni che sono in grado di invadere cellule ospiti. Tuttavia, studi in vitro con patogeni anaerobici presentano molti problemi sperimentali per il ricercatore principalmente perché è difficile da eseguire studi che si basano su strumenti ingombranti in assenza di ossigeno. La situazione è aggravata dal fatto che le cellule eucariotiche hanno bisogno di ossigeno per crescere e quindi devono essere preparati separatamente in incubatori di coltura dei tessuti. Un modo per evitare tali ostacoli sarebbe quella di effettuare gli studi sotto ossigeno atmosferico, ma che avrebbe fatto la crescita di batteri anaerobi impossibile. Un altro metodo sarebbe quello di utilizzare i batteri ucciso al calore di infettare e studiare le interazioni ospite-cellulari. Tuttavia, esistono delle differenze tra batteri ucciso al calore e vitali che diminuiscono la pertinenza della dello s ospite-patogenosu 16. E &#39;centrale per studiare batteri vitali con l&#39;espressione inalterata l&#39;interazione con le cellule ospiti; quindi, i metodi per la coltura di P. gingivalis in un ambiente anaerobico sono dati. Inoltre, sono dimostrati due protocolli convenienti semplici per valutare la capacità di P. gingivalis da interiorizzato da vena cellule umane endoteliali (ombelicali HUVECs). Il primo protocollo si basa sul popolare protection assay antibiotico. Anche se il test è semplice, le considerazioni quando si utilizza microrganismi anaerobi sono dati. Il secondo protocollo richiede l&#39;uso di un microscopio a scansione a fluorescenza per visualizzare interagire e internalizzata P. gingivalis. Ogni test ha i suoi limiti e vantaggi che verranno discusse a rilasciare al ricercatore uno schema per studiare l&#39;invasività dei batteri anaerobici. Anche se il manoscritto corrente studia P. gingivalis e HUVEC, questi protocolli possono essere usati per molti altri batteri anaerobici ecome per altri tipi di cellule ospiti.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Vinyl Anaerobic Chamber-Type B</td>
			<td>Coy Laboratory Products</td>
			<td></td>
			<td>Model 2000 incubator&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSA II Trypticase Soy Agar w/5% Sheep Blood</td>
			<td>BBL</td>
			<td>221261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Umbilical Vein Endothelial Cells 10-donor Pool</td>
			<td>LifeLine Technology</td>
			<td>FC-0044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VascuLife VEGF Medium Complete Kit</td>
			<td>LifeLine Technology</td>
			<td>LL-0003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypKit</td>
			<td>LifeLine</td>
			<td>LL-0013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Riedel-de Haen</td>
			<td>16109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin Sulfate Salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G-1264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metronidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-3761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCECF-AM</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>B1150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITC Phalloidin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 mm Circular Coverslips</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72222-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VectaShield Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

porphyromonas gingivalis as a model organism for assessing interaction of anaerobic bacteria with host cells

I batteri anaerobici lontano superano aerobi in molte nicchie umani, come l&#39;intestino, bocca e vagina. Inoltre, infezioni anaerobiche sono comuni e spesso di origine indigena. La capacità di alcuni agenti patogeni anaerobici di invadere le cellule umane dà loro misure di adattamento per sfuggire immunità innata nonché per modulare il comportamento della cellula ospite. Tuttavia, garantire che i batteri anaerobici sono vivo durante un&#39;indagine sperimentale degli eventi che può porre problemi. Porphyromonas gingivalis, un anaerobio Gram-negativi, è in grado di invadere una varietà di cellule non fagocitiche eucariotiche. In questo articolo viene descritto come con successo la cultura e valutare la capacità di P. gingivalis di invadere le cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC). Sono stati sviluppati due protocolli: uno per misurare batteri che possono con successo invadere e sopravvivere all&#39;interno dell&#39;ospite, e l&#39;altro per visualizzare i batteri interagiscono con le cellule ospiti. Queste tecniche richiedono l&#39;uso di un anaeRobic camera per la fornitura di P. gingivalis con un ambiente anaerobico per la crescita ottimale. Il primo protocollo si basa sulla misurazione di protezione antibiotico, che è ampiamente utilizzato per studiare l&#39;invasione delle cellule ospiti da batteri. Tuttavia, il saggio di protezione antibiotico è limitata; solo i batteri intracellulari che sono coltivabili a seguito di trattamento antibiotico e lisi della cellula ospite sono misurati. Per valutare tutti i batteri interagiscono con le cellule ospiti, sia vivi e morti, abbiamo sviluppato un protocollo che utilizza il microscopio a fluorescenza per esaminare l&#39;interazione ospite-patogeno. I batteri sono fluorescente con 2 &#39;, 7&#39;-Bis- (2-carbossietil) -5- (e-6) -carboxyfluorescein acetossimetil estere (BCECF-AM) e utilizzato per infettare cellule eucariotiche in condizioni anaerobiche. Dopo fissazione con paraformaldeide e permeabilizzazione con 0,2% Triton X-100, cellule ospiti sono etichettati con TRITC falloidina e DAPI etichettare citoscheletro cellulare e nucleo, rispettivamente. Molteplici images prelevati in differenti punti focali (Z-stack) sono ottenuti per la visualizzazione spazio-temporale dei batteri. I metodi utilizzati in questo studio possono essere applicati a qualsiasi anaerobio coltivabili e qualsiasi tipo di cellula eucariotica.

Protocolli di cui sopra sono stati utilizzati nello studio interazione ospite-patogeno tra P. gingivalis e cellule endoteliali. P. gingivalis W83 e un P. gingivalis V3150 portando una delezione di PG0228 stati utilizzati nello studio. Il PG0228 è previsto per codificare una proteina che può alterare i livelli di RNA e proteine, che possono incidere in definitiva interazione di P. gingivalis con cellule ospiti. Per studiare l&#39;effetto di PG0228 su P. capacità di interagi...

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Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

This article presents two protocols: one to measure anaerobic bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize anaerobic bacteria interacting with host cells. This study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Porphyromonas gingivalis come organismo modello per la Valutazione Interazione di batteri anaerobici con cellule ospiti

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

porphyromonas-gingivalis-as-model-organism-for-assessing-interaction

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

26.1K Views.  Virginia Commonwealth University. This article presents two protocols: one to measure anaerobic bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize anaerobic bacteria interacting with host cells. This study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type. 

Video: Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral cytokine production1,2. In order to colonize the host, viruses are obligate to evade host antiviral responses and manipulate signaling pathways. Unraveling the host-virus interaction will shed light on the development of novel therapeutic strategies against viral infection.
Murine &gamma;HV68 is closely related to human oncogenic Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus and Epsten-Barr virus3,4. &gamma;HV68 infection in laboratory mice provides a tractable small animal model to examine the entire course of host responses and viral infection in vivo, which are not available for human herpesviruses. In this protocol, we present a panel of methods for phenotypic characterization and molecular dissection of host signaling components in &gamma;HV68 lytic replication both in vivo and ex vivo. The availability of genetically modified mouse strains permits the interrogation of the roles of host signaling pathways during &gamma;HV68 acute infection in vivo. Additionally, mouse embryonic fibroblasts (MEFs) isolated from these deficient mouse strains can be used to further dissect roles of these molecules during &gamma;HV68 lytic replication ex vivo.
Using virological and molecular biology assays, we can pinpoint the molecular mechanism of host-virus interactions and identify host and viral genes essential for viral lytic replication. Finally, a bacterial artificial chromosome (BAC) system facilitates the introduction of mutations into the viral factor(s) that specifically interrupt the host-virus interaction. Recombinant &gamma;HV68 carrying these mutations can be used to recapitulate the phenotypes of &gamma;HV68 lytic replication in MEFs deficient in key host signaling components. This protocol offers an excellent strategy to interrogate host-pathogen interaction at multiple levels of intervention in vivo and ex vivo.
Recently, we have discovered that &gamma;HV68 usurps an innate immune signaling pathway to promote viral lytic replication5. Specifically, &gamma;HV68 de novo infection activates the immune kinase IKK&beta; and activated IKK&beta; phosphorylates the master viral transcription factor, replication and transactivator (RTA), to promote viral transcriptional activation. In doing so, &gamma;HV68 efficiently couples its transcriptional activation to host innate immune activation, thereby facilitating viral transcription and lytic replication. This study provides an excellent example that can be applied to other viruses to interrogate host-virus interaction.

We describe a protocol to identify key roles of host signaling molecules in lytic replication of a model herpesvirus, gamma herpesvirus 68 (&gamma;HV68). Utilizing genetically modified mouse strains and embryonic fibroblasts for &gamma;HV68 lytic replication, the protocol permits both phenotypic characterization and molecular interrogation of virus-host interactions in viral lytic replication.

Dissezione Host-virus Interazione in replica litico di un Herpesvirus modello

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral ...

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Immunologia e infezioni

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

L&#39;introduzione di shear stress nello studio di adesione batterica

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory mucosa 1; 2. To study the mechanisms by which these organisms survive on and inside respiratory tissues, a model in which successful long-term co-culture of bacteria and human cells can be performed is required. We use primary human respiratory epithelial tissues raised to the air-liquid interface, the EpiAirway model (MatTek, Ashland, MA). These are non-immortalized, well-differentiated, 3-dimensional tissues that contain tight junctions, ciliated and nonciliated cells, goblet cells that produce mucin, and retain the ability to produce cytokines in response to infection. 
This biologically relevant in vitro model of the human upper airway can be used in a number of ways; the overall goal of this method is to perform long-term co-culture of EpiAirway tissues with NTHi and quantitate cell-associated and internalized bacteria over time. As well, mucin production and the cytokine profile of the infected co-cultures can be determined. This approach improves upon existing methods in that many current protocols use submerged monolayer or Transwell cultures of human cells, which are not capable of supporting bacterial infections over extended periods3. For example, if an organism can replicate in the overlying media, this can result in unacceptable levels of cytotoxicity and loss of host cells, arresting the experiment. The EpiAirway model allows characterization of long-term host-pathogen interactions. Further, since the source for the EpiAirway is normal human tracheo-bronchial cells rather than an immortalized line, each is an excellent representation of actual human upper respiratory tract tissue, both in structure and in function4.
For this method, the EpiAirway tissues are weaned off of anti-microbial and anti-fungal compounds for 2 days prior to delivery, and all procedures are performed under antibiotic-free conditions. This necessitates special considerations, since both bacteria and primary human tissues are used in the same biosafety cabinet, and are co-cultured for extended periods.

This method allows characterization of extended bacterial co-culture with EpiAirways, primary human respiratory epithelial tissue grown at the air-liquid interface, a biologically relevant in vitro model. The approach can be used with any microbe that is amenable to long-term co-culture.

L&#39;uso del Modello EpiAirway per Caratterizzare a lungo termine interazioni ospite-patogeno

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans commonly employ infection of mammalian hosts or host cells (i.e. macrophages) followed by yeast quantification using colony forming unit analysis or flow cytometry. While colony forming unit enumeration has been the most commonly used method in the field, this technique has disadvantages and limitations, including slow growth of some fungal species on solid media and low and/or variable plating efficiencies, which is of particular concern when comparing growth of wild-type and mutant strains. Flow cytometry can provide rapid quantitative information regarding yeast viability, however, adoption of flow cytometric detection for pathogenic yeasts has been limited for a number of practical reasons including its high cost and biosafety considerations. Here, we demonstrate an image-based cytometric methodology using the Cellometer Vision (Nexcelom Bioscience, LLC) for the quantification of viable pathogenic yeasts in co-culture with macrophages. Our studies focus on detection of two human fungal pathogens: Histoplasma capsulatum and Candida albicans. H. capsulatum colonizes alveolar macrophages by replicating within the macrophage phagosome, and here, we quantitatively assess the growth of H. capsulatum yeasts in RAW 264.7 macrophages using acridine orange/propidium iodide staining in combination with image cytometry. Our method faithfully recapitulates growth trends as measured by traditional colony forming unit enumeration, but with significantly increased sensitivity. Additionally, we directly assess infection of live macrophages with a GFP-expressing strain of C. albicans. Our methodology offers a rapid, accurate, and economical means for detection and quantification of important human fungal pathogens in association with host cells.

Here, we demonstrate how image cytometry can be used for quantification of pathogenic fungi in association with host cells in culture. This technique can be used as an alternative to CFU enumeration.

L&#39;uso di Citometria immagine per la quantificazione dei funghi patogeni in associazione con cellule ospiti

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans ...

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and replicates within alveolar macrophages. Its virulence depends on the Dot/Icm type IV secretion system (T4SS), which is essential to establish a replication permissive vacuole known as the Legionella containing vacuole (LCV). L. pneumophila infection can be modeled in mice however most mouse strains are not permissive, leading to the search for novel infection models. We have recently shown that the larvae of the wax moth Galleria mellonella are suitable for investigation of L. pneumophila infection. G. mellonella is increasingly used as an infection model for human pathogens and a good correlation exists between virulence of several bacterial species in the insect and in mammalian models. A key component of the larvae&#39;s immune defenses are hemocytes, professional phagocytes, which take up and destroy invaders. L. pneumophila is able to infect, form a LCV and replicate within these cells. Here we demonstrate protocols for analyzing L. pneumophila virulence in the G. mellonella model, including how to grow infectious L. pneumophila, pretreat the larvae with inhibitors, infect the larvae and how to extract infected cells for quantification and immunofluorescence microscopy. We also describe how to quantify bacterial replication and fitness in competition assays. These approaches allow for the rapid screening of mutants to determine factors important in L. pneumophila virulence, describing a new tool to aid our understanding of this complex pathogen.

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

The larva of the wax moth Galleria mellonella was recently established as an in vivo model to study Legionella pneumophila infection. Here, we demonstrate fundamental techniques to characterize the pathogenesis of Legionella in the larvae, including inoculation, measurement of bacterial virulence and replication as well as extraction and analysis of infected hemocytes.

Uso di<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Come organismo modello per studiare<em&gt; Legionella pneumophila</em&gt; Infezione

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of the host depends on the involvement of an adapted immune response against the pathogen1. Immune response is complex and results from interaction of the pathogens and several immune or non-immune cellular types2. In vitro studies cannot characterise these interactions and focus on cell-pathogen interactions. Moreover, in the airway3, particularly in patients with suppurative chronic lung disease or in mechanically ventilated patients, polymicrobial communities are present and complicate host-pathogen interaction. Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans are both problem pathogens4, frequently isolated from tracheobronchial samples, and associated to severe infections, especially in intensive care unit5. Microbial interactions have been reported between these pathogens in vitro but the clinical impact of these interactions remains unclear6. To study the interactions between C. albicans and P. aeruginosa, a murine model of C. albicans airways colonization, followed by a P. aeruginosa-mediated acute lung infection was performed.

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

While in vitro study of host-pathogen interactions allow the characterization of specific immune responses, in vivo models are required to observe the effects of complex responses. Using Candida albicans exposure followed by Pseudomonas aeruginosa-mediated lung infection, we established a murine model of microbial interactions involved in ventilator-associated pneumonia pathogenicity.

Studiare comunità microbiche<em&gt; In Vivo</em&gt;: Un modello di interazione ospite-mediata tra<em&gt; Candida Albicans</em&gt; E<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Nei Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

Biomimetic Materials to Characterize Bacteria-host Interactions

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The biochemical and functional characterization of adhesins mediating these initial bacteria-host interactions is often compromised by the presence of other bacterial factors, such as cell wall components or secreted molecules, which interfere with the analysis. This protocol describes the production and use of biomimetic materials, consisting of pure recombinant adhesins chemically coupled to commercially available, functionalized polystyrene beads, which have been used successfully to dissect the biochemical and functional interactions between individual bacterial adhesins and host cell receptors. Protocols for different coupling chemistries, allowing directional immobilization of recombinant adhesins on polymer scaffolds, and for assessment of the coupling efficiency of the resulting &#8220;bacteriomimetic&#8221; materials are also discussed. We further describe how these materials can be used as a tool to inhibit pathogen mediated cytotoxicity and discuss scope, limitations and further applications of this approach in studying bacterial - host interactions.

Bacterial attachment to host cells is a key step during host colonization and infection. This protocol describes the generation of polymer-coupled recombinant adhesins as biomimetic materials which allow analysis of the contribution of individual adhesins to these processes, independent of other bacterial factors.

I materiali biomimetici per caratterizzare le interazioni batteri-ospite

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The ...

Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-&#947; Responses

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been highly informative on the role of innate and adaptive immune cells and specific cytokines in host immunity against intracellular pathogens. Production of IFN-&#947; by innate cells during sublethal infection with L. monocytogenes is important for activating macrophages and early control of the pathogen1-3. In addition, IFN-&#947; production by adaptive memory lymphocytes is important for priming the activation of innate cells upon reinfection4. The L. monocytogenes infection model thus serves as a great tool for investigating whether new therapies that are designed to increase IFN-&#947; production have an impact on IFN-&#947; responses in vivo and have productive biological effects such as increasing bacterial clearance or improving mouse survival from infection. Described here is a basic protocol for how to conduct intraperitoneal infections of C57BL/6J mice with the EGD strain of L. monocytogenes and to measure IFN-&#947; production by NK cells, NKT cells, and adaptive lymphocytes by flow cytometry. In addition, procedures are described to: (1) grow and prepare the bacteria for inoculation, (2) measure bacterial load in the spleen and liver, and (3) measure animal survival to endpoints. Representative data are also provided to illustrate how this infection model can be used to test the effect of specific agents on IFN-&#947; responses to L. monocytogenes and survival of mice from this infection.

Experimental Infection with &lt;em&gt;Listeria monocytogenes&lt;/em&gt; as a Model for Studying Host Interferon-&amp;#947; Responses

This protocol describes how to inoculate C57BL/6J mice with the EGD strain of Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) and to measure interferon-&#947; (IFN-&#947;) responses by natural killer (NK) cells, natural killer T (NKT) cells, and adaptive T lymphocytes post-infection. This protocol also describes how to conduct survival studies in mice after infection with a modified LD50 dose of the pathogen.

Infezione sperimentale con<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Come modello per lo studio Host Interferone-gamma Risposte

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of 10 - 30% of adults. In immune-compromised individuals, including neonates, pregnant women, and the elderly, GBS may switch to an invasive pathogen causing sepsis, arthritis, pneumonia, and meningitis. Because GBS is a leading bacterial pathogen of neonates, current prophylaxis is comprised of late gestation screening for GBS vaginal colonization and subsequent peripartum antibiotic treatment of GBS-positive mothers. Heavy GBS vaginal burden is a risk factor for both neonatal disease and colonization. Unfortunately, little is known about the host and bacterial factors that promote or permit GBS vaginal colonization. This protocol describes a technique for establishing persistent GBS vaginal colonization using a single &#946;-estradiol pre-treatment and daily sampling to determine bacterial load. It further details methods to administer additional therapies or reagents of interest and to collect vaginal lavage fluid and reproductive tract tissues. This mouse model will further the understanding of the GBS-host interaction within the vaginal environment, which will lead to potential therapeutic targets to control maternal vaginal colonization during pregnancy and to prevent transmission to the vulnerable newborn. It will also be of interest to increase our understanding of general bacterial-host interactions in the female vaginal tract.

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

The purpose of this protocol is to imitate human group B Streptococcus (GBS) vaginal colonization in a murine model. This method may be used to investigate host immune responses and bacterial factors contributing to GBS vaginal persistence, as well as to test therapeutic strategies.

Un modello murino di Gruppo B<em&gt; Streptococcus</em&gt; Colonizzazione vaginale

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. However, these screens are typically conducted in cells that are naturally permissive to the viral pathogen under study. Therefore, the robust replication of viruses in control conditions may limit the dynamic range of these screens. Furthermore, these screens may be unable to easily identify cellular defense pathways that restrict virus replication if the virus is well-adapted to the host and capable of countering antiviral defenses. In this article, we describe a new paradigm for exploring virus-host interactions through the use of screens that center on naturally abortive infections by arboviruses such as vesicular stomatitis virus (VSV). Despite the ability of VSV to replicate in a wide range of dipteran insect and mammalian hosts, VSV undergoes a post-entry, abortive infection in a variety of cell lines derived from lepidopteran insects, such as the gypsy moth (Lymantria dispar). However, these abortive VSV infections can be &#34;rescued&#34; when host cell antiviral defenses are compromised. We describe how VSV strains encoding convenient reporter genes and restrictive L. dispar cell lines can be paired to set-up screens to identify host factors involved in arbovirus restriction. Furthermore, we also show the utility of these screening tools in the identification of virally encoded factors that rescue VSV replication during coinfection or through ectopic expression, including those encoded by mammalian viruses. The natural restriction of VSV replication in L. dispar cells provides a high signal-to-noise ratio when screening for the conditions that promote VSV rescue, thus enabling the use of simplistic luminescence- and fluorescence-based assays to monitor the changes in VSV replication. These methodologies are valuable for understanding the interplay between host antiviral responses and viral immune evasion factors.

Here, we present the protocols to identify 1) virus-encoded immunomodulators that promote arbovirus replication and 2) eukaryotic host factors that restrict arbovirus replication. These fluorescence- and luminescence-based methods allow researchers to rapidly obtain quantitative readouts of arbovirus replication in simplistic assays with low signal-to-noise ratios.

Infezioni da arbovirus come strumenti di Screening per l'identificazione di fattori virali immunomodulatori e Host antivirale

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...