박테리아 병원체는 독성 인자를 사용하여 숙주 유기체 내의 다양한 틈새를 식민지화합니다. 우리는 박테리아 병원체가 독성 인자 발현을 조절하기 위해 숙주 조직에서 특정 환경 신호를 감지하는 방법을 이해하기 위해 노력하고 있습니다. 인간 병원균 Yersinia pseudotuberculosis는 3형 분비 시스템 독성 인자를 사용하여 숙주 세포에 효과기 단백질을 주입합니다.
3형 분비 시스템은 박테리아가 숙주 방어 메커니즘을 파괴하고 숙주 조직에 군체를 형성할 수 있도록 합니다. 그러나 Yersinia Type III 분비 시스템의 발현은 대사적으로 부담이 되기 때문에 Type 3 분비 시스템 유전자의 발현은 온도와 같은 환경적 단서에 반응하여 엄격하게 조절됩니다. 우리의 이전 간행물은 Yersinia 유형 III 분비 체계의 표정이 ISCR에게 불린 전사 인자를 통해서 철 가용성과 산소 긴장에 의해 통제된다는 것을 보여주었습니다.
이러한 발견은 Yersinia가 철 함량과 산소 장력이 다양한 숙주 조직에 군체를 형성하기 때문에 중요합니다. 예를 들어, 장 내강에는 예르시니아 성장에 충분한 철분이 포함되어 있지만 산소 장력이 낮습니다. 반면, 혈액과 같은 조직은 철분 이용률이 매우 낮지만 산소 장력이 높습니다.
우리의 방법을 통해 사용 가능한 철과 산소의 양이 다양한 배양 조건에서 Yersinia를 성장시켜 이러한 환경적 단서가 유형 3 분비 시스템의 발현에 어떤 영향을 미치는지 연구할 수 있습니다. 이 방법은 철과 산소 가용성이 3형 분비 시스템의 발현을 제어하는 분자 메커니즘을 결정하는 데 도움이 되며, 이것이 예르시니아 감염의 결과를 어떻게 제어하는지 이해하는 데 도움이 됩니다. 시작하려면 Lysogeny 국물 한천 플레이트에 Yersinia Pseudo tuberculosis를 줄무늬로 표시하십시오.
플레이트를 실온에서 48시간 동안 배양합니다. 일단 눈에 보이는 군체가 형성되면, 하나의 고립된 군체에 4ml의 M9 배지를 접종합니다. 섭씨 26도에서 하룻밤 동안 배양하고 250RPM에서 폭기합니다.
배양액이 들어있는 큐벳을 분광계에 놓고 철분 보충없이 14 밀리리터의 멸균 킬레이트 M9 매체로 배양물을 희석하여 OD600 값 0.1을 얻습니다. 플라스크를 섭씨 26도의 셰이커에 넣고 8시간 동안 배양합니다. 배양이 완료된 후 배양을 사용하여 세 가지 새로운 배양을 시작하십시오. 2개는 혐기성 성장용이고 1개는 호기성 성장용입니다.
호기성 배양의 경우, 철분 보충제 없이 14ml의 멸균 킬레이트 M9 배지에서 배양을 OD600 값 0.1로 희석합니다. 그런 다음 섭씨 26도에서 12시간 동안 폭기로 배양합니다. 혐기성 배양의 경우, 14ml의 멸균 킬레이트 M9 배지에서 배양물을 두 개의 산 세척 유리관으로 희석합니다.
첫 번째 튜브에 필터 멸균된 황산철을 최종 농도인 리터당 1mg까지 추가합니다. 두 번째 튜브에 최종 농도 리터당 0.01밀리그램의 황산철을 추가합니다. 두 튜브를 실온의 혐기성 챔버에서 12시간 동안 배양합니다.
그런 다음, 혐기성 배양물을 섭씨 37도로 이동시켜 3형 분비 시스템 활성을 유도하고 4시간 동안 배양을 계속합니다. 다음으로, 2개의 산 세척 플라스크에 14ml의 킬레이트 M9 배지를 첨가하여 호기성 배양물을 OD600 값 0.2로 희석합니다. 필요한 최종 농도의 황산철을 플라스크에 첨가합니다.
두 플라스크를 섭씨 26도, 250RPM에서 2시간 동안 폭기로 배양합니다. 2시간 후, 4시간 동안 250RPM에서 폭기로 배양물을 섭씨 37도로 전환하여 3형 분비 시스템 활동을 유도합니다. Yersinia pseudotuberculosis에서 3형 분비 시스템을 유도한 후, 이 배양액의 정규화된 부피를 15ml 튜브로 전달합니다.
단백질 침전 조절로 각 튜브에 4마이크로리터의 소 혈청 알부민을 추가합니다. 배양물을 3, 200G에서 섭씨 4도에서 15분 동안 원심분리합니다. 주사기에 부착된 0.22미크론 PVDF 필터를 사용하여 상층액을 새 15ml 튜브에 여과합니다.
그런 다음 상등액 부피의 10%에 해당하는 트리클로로아세트산을 첨가합니다. 1분 동안 튜브를 격렬하게 소용돌이치십시오. 튜브를 섭씨 4도의 차가운 방에서 얼음 위에서 하룻밤 동안 배양합니다.
다음으로, 각 샘플의 2 밀리리터를 2 밀리리터 튜브에 첨가 한 다음 21, 000 G에서 섭씨 4 도에서 15 분 동안 원심 분리하십시오. 진공 부착물을 사용하여 상등액을 흡입합니다. 2ml의 샘플을 동일한 튜브에 피펫팅하고 원심분리한 후 상층액을 흡인하는 작업을 반복합니다.
침전 반응을 단일 2 밀리리터 튜브로 통합합니다. 1ml의 얼음처럼 차가운 100% 아세톤으로 펠릿을 세척한 다음 원심분리와 상등액 흡인을 수행합니다. 마지막으로 상등액을 제거한 후 벤치에서 펠릿을 1시간 동안 건조시킵니다.
침전된 단백질은 튜브 측면을 따라 연무처럼 보여야 합니다. 그런 다음 각 펠릿을 50마이크로리터의 F-S-B-DTT 용액에 재현탁합니다. 1분 동안 완전히 소용돌이칩니다.
다음으로, 샘플을 섭씨 95도의 열 블록에서 15분 동안 끓입니다. 그런 다음 실온에서 최대 속도로 잠시 원심분리합니다. 분석을 위해 각 혐기성 시료 15마이크로리터와 각 호기성 시료 10마이크로리터를 12.5% SDS-PAGE 젤에 로드합니다.
겔 실행이 완료된 후 은 염색을 사용하여 겔의 단백질을 시각화합니다. 먼저 Yersinia pseudotuberculosis의 분리된 호기성 샘플이 들어 있는 SDS-PAGE 젤을 이미징 시스템에 배치합니다. 소프트웨어에서 모든 웰에 걸쳐 type three secretion system effector protein, YopE를 나타내는 band를 선택합니다.
참조 YopE 밴드를 적절한 샘플로 설정합니다. 모든 YopE 대역에 대해 소프트웨어에서 계산된 상대 정량화 값을 내보냅니다. 그런 다음 모든 웰에서 모든 BSA 대역을 선택합니다.
참조 BSA 밴드가 참조 YopE 밴드의 샘플과 일치하는지 확인합니다. 모든 BSA 대역에 대한 상대적 정량화 값을 내보냅니다. YopE 값을 각 조건의 BSA 값으로 나누어 정규화된 결과를 생성합니다.
은 염색 SDS-PAGE 겔은 혐기성 샘플에서 고철 샘플에 비해 저철분 샘플에 38배 더 많은 YopE가 존재한다는 것을 밝혔습니다. 호기성 샘플에서 이러한 단백질은 거의 유사한 양으로 분비되었습니다.
