Questo protocollo consente la fabbricazione di analoghi ossei senza richiedere riscaldamento o sostanze chimiche tossiche. In questo modo, si formano strutture ossee con il potenziale per riparare un difetto osseo in contesti clinici utilizzando le cellule di un paziente. Il vantaggio principale della tecnica è che l'inchiostro osseo può essere stampato con cellule viventi per formare qualsiasi struttura complessa simile all'osso e per dirigere la differenziazione verso il lignaggio di formazione ossea.

Inoltre, i farmaci possono essere caricati nell'inchiostro osseo per migliorare contemporaneamente la guarigione delle ferite, la rigenerazione ossea e per trattare patologie come il cancro. A dimostrare la procedura saranno Gagan Jalandhra, un dottorando nel mio laboratorio, e la dottoressa Sara Romanazzo, che ha lavorato con me e la dottoressa Jalandhra su vari progetti, incluso lo sviluppo di questa tecnologia. Inizia aggiungendo la miscela di polvere di calcio idrogeno fosfato e carbonato di calcio a un crogiolo di zirconia in modo che non sia pieno più del 75%.

Trasferire il crogiolo in una fornace, riscaldarlo a 1.400 gradi Celsius ad una velocità di cinque gradi Celsius al minuto e tenere premuto per tre ore. Estinguere la reazione rimuovendo il crogiolo dal forno e lasciandolo in cima al blocco refrattario. Lasciare raffreddare completamente prima di manipolarlo.

Utilizzare un mortaio e un pestello per rompere e macinare la torta di fosfato alfa-tricalcico in modo che i granuli risultanti abbiano una dimensione massima di 200 micrometri. Aggiungere tre palline di zirconia stabilizzate all'ittrio millimetriche alla miscela macinata, seguite da etanolo al 100%. Chiudere il coperchio e macinare per due ore a 180 rotazioni al minuto.

Raccogliere la sospensione e separare le palline, utilizzando etanolo al 100% per il lavaggio. Asciugare la sospensione in forno a 120 gradi Celsius per 24 ore. Aggiungere la polvere essiccata ai barattoli di macinazione con sfere di zirconia da un millimetro e etanolo al 100% negli stessi rapporti di peso del primo stadio.

Macinare per due ore a 180 rotazioni al minuto. Quindi separare e asciugare nel forno. Togliere il campione dal forno.

Per fare l'inchiostro all'osso, aggiungere 630 microlitri di glicerolo e 130 microlitri di polisorbato 80 in un barattolo di palline mil. Quindi aggiungere 100 milligrammi di fosfato bibasico di ammonio e due grammi di polvere di fosfato alfa-tricalcico alla soluzione e mescolare continuamente con una spatola per combinare. Aggiungere una sfera di zirconia da 25 millimetri, fissare il coperchio e posizionarlo all'interno di un mulino planetario per 60 minuti a 180 rotazioni al minuto, fermandosi a metà strada per raschiare i lati del barattolo con una spatola usando una spatola.

Caricare l'inchiostro in una siringa da un millilitro. Preparare una soluzione al 10% di gelatina di tipo A in 1X PBS come descritto nel manoscritto testuale. Posizionare il matraccio conico sull'agitatore.

Quindi aggiungere 5.796 millilitri di anidride metacrilica e continuare a mescolare al buio a 50 gradi Celsius per 90 minuti. Estinguere la reazione diluendo il contenuto dei palloni conici due volte con PBS. Decantare in tubi da 50 millilitri e rimuovere l'anidride metacrilica non reagita mediante centrifugazione a 3000 RCF a temperatura ambiente per tre minuti e raccogliendo il surnatante.

Dializzare il surnatante all'interno di tubi di dialisi di cellulosa tagliati da 14 kilodalton contro acqua deionizzata a 40 gradi Celsius per cinque giorni mescolando delicatamente. Sostituire l'acqua deionizzata ogni giorno. Preparare per la conservazione travasando in tubi da 50 millilitri, fissando il tappo e mettendolo in frigorifero per 12 ore.

Quindi congelare i campioni utilizzando azoto liquido e immediatamente liofilizzare per cinque giorni a meno 54 gradi Celsius e 0,4 millibar. Conservare la schiuma risultante in un congelatore a meno 20 gradi Celsius. Per sintetizzare i microgel GelMA, fare una soluzione di GelMA del 10% peso in peso in PBS pesando il GelMA liofilizzato, aggiungendolo a un tubo con PBS e riscaldandolo a bagnomaria a 50 gradi Celsius fino a completa idratazione.

Aggiungere 37 millilitri di olio per un millilitro di soluzione GelMA a un becher, assicurandosi che non sia pieno più del 65%. Impostare un sistema a doppio becher su una piastra riscaldante con agitazione magnetica posizionando il becher contenente olio all'interno di un becher più grande. Riscaldare a 40 gradi Celsius mescolando.

Caricare la soluzione di GelMA in una siringa e aggiungerla a goccia nell'olio di agitazione attraverso un filtro da 0,45 micrometri. Lasciare equilibrare l'emulsione per 10 minuti. Ridurre la temperatura dell'emulsione a 15 gradi Celsius a livello termico.

Stabilizzare le sfere aggiungendo ghiaccio tritato nello spazio tra i due becher. Aggiungere acetone all'emulsione GelMA rotante. Decantare il contenuto del becher in tubi da 50 millilitri, assicurandosi di lavare le pareti del becher con acetone.

Lasciate riposare per 20 minuti per permettere ai micro gel disidratati di depositarsi sul fondo. Scartare il surnatante e lavare i microgel due volte con acetone. Consolidare in un tubo, rabboccare con acetone e sonicare per 10 secondi.

Ancora una volta, lavarlo con acetone due volte. Conservare in acetone a temperatura ambiente fino a quando necessario per la stampa. Per preparare la sospensione di microgel GelMA per la stampa, formulare una soluzione 1% peso/peso di GelMA in DMEM come descritto nel manoscritto testuale.

Far evaporare l'acetone dai microgel disidratati e pesare la polvere risultante in un tubo. Aggiungere acetone e trasferire in un ambiente sterile. Per formare la sospensione di microgel, far evaporare l'acetone dalla polvere all'interno dell'armadio di biosicurezza.

Dopo l'evaporazione, aggiungere DMEM, soluzione 1% GelMA in DMEM e 2,5% soluzione iniziatore LAP per ottenere una frazione finale di confezionamento del 30% Lasciare idratare completamente per almeno 12 ore a temperatura ambiente. Coltura delle cellule staminali mesenchimali derivate dal tessuto adiposo in DMEM a basso contenuto di glucosio integrate con 10% FBS e 1% penicillina-streptomicina a 37 gradi Celsius e 5% anidride carbonica fino a confluente. Rimuovere le cellule staminali mesenchimali di derivazione adiposa dal pallone di coltura tissutale rimuovendo il terreno e lavando con PBS sterile.

Pellettare le celle centrifugando a 150 RCF a temperatura ambiente per cinque minuti. Contare le celle e calcolare almeno 5 x 10 alle cinque celle per ogni millilitro di microgel GelMA. Allocare il volume richiesto della sospensione cellulare a un tubo separato e pellet come dimostrato in precedenza.

Rimuovere con attenzione quanto più surnatante possibile usando una pipetta, lasciando solo il pellet cellulare. Aggiungere il volume richiesto di sospensione di microgel al pellet e pipettare delicatamente su e giù per garantire una distribuzione uniforme. Caricare la sospensione di microgel carica di celle in un reattore usando una pipetta.

Utilizzando una siringa da un millilitro dotata di un ago da 23 gauge, depositare l'inchiostro osseo, reticolare la cellula e i costrutti di microgel GelMA carichi di inchiostro osseo con una lampada reticolante UV a 405 nanometri per 90 secondi. Trasferire immediatamente la sospensione di microgel in una piastra del pozzetto di dimensioni appropriate contenente DMEM completo. Incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.

Sostituire il terreno di coltura dopo 24 ore, quindi ogni 48-72 ore secondo necessità. L'inchiostro osseo è stato analizzato mediante microscopia elettronica a scansione per determinare la sua microstruttura, che ha mostrato la formazione di cristalli di idrossiapatite dopo l'impostazione dell'inchiostro, particolarmente visibile in condizioni asciutte. In questo studio, le cellule sono state miscelate con microgel GelMA e mantenute in coltura per un massimo di cinque giorni, solo in sospensione di micro gel o nel sistema COBICS.

Le cellule hanno mostrato una buona vitalità in presenza dell'inchiostro osseo, sia il primo giorno che il quinto giorno, confermando che i prodotti di lisciviazione dell'inchiostro non erano dannosi per le cellule. È fondamentale controllare la velocità dell'agitazione mentre sintetizza il microgel poiché un leggero cambiamento può causare differenze di dimensioni. È anche importante garantire una distribuzione omogenea delle cellule all'interno della sospensione di microgel.

Lo stesso protocollo può essere utilizzato per stampare all'interno sospensioni di microgel di gelatina, che fungono da supporti sacrificali, lasciando dietro di sé costrutti ossei autonomi. Ma l'uso di GelMA apre la strada a costrutti multifasici di un piatto, come le interfacce osteocondrali o tendinee ossee.