Lo scopo della nostra ricerca è comprendere la relazione tra la diffusione di depolarizzazioni e lesioni cerebrali traumatiche lievi utilizzando modelli cerebrali. Il nostro gruppo e altri hanno recentemente dimostrato che la diffusione delle depolarizzazioni si verifica in lievi lesioni del cranio chiuso nei topi. Gli amplificatori di elettrofisiologia in vivo comunemente usati filtrano i lenti spostamenti extracellulari associati alla diffusione delle depolarizzazioni, rendendo quasi impossibile rilevare la diffusione della depolarizzazione.
Il vantaggio di questo protocollo è quello di sfruttare sia l'imaging che l'elettrofisiologia in vivo per confermare l'assenza o la presenza di depolarizzazioni diffuse a seguito di una lieve lesione cerebrale traumatica. Abbiamo iniziato a comprendere il ruolo della diffusione delle depolarizzazioni nel comportamento acuto, nella patologia e nei deficit cognitivi a lungo termine associati agli MTBI. Per iniziare, posizionare l'animale anestetizzato in un telaio stereotassico e mantenere la temperatura corporea dell'animale utilizzando un termoforo.
Utilizzando una lama di bisturi numero 10, praticare un'incisione lungo la linea mediana da rostrale a caudale. E applicare immediatamente la colla cianoacrilica sull'incisione. Quindi, allargare la pelle lateralmente per esporre il cranio.
Aggiungi una o due gocce di colla cianoacrilica sul cranio per fornire una protezione extra. Mentre la colla si asciuga, utilizzare forbici chirurgiche sterili per aumentare le dimensioni dell'incisione sul cervelletto. Successivamente, utilizzando una punta da trapano da 0,8 millimetri, praticare dei fori pilota attraverso il cranio e girare le viti nel cranio.
Avvolgere il filo in eccesso attorno alla vite, lasciando un po' di gioco per il posizionamento del palco di testa in un secondo momento. Una volta che tutte le viti del teschio sono in posizione, collegare tutti i pin dorati al connettore dello stadio della testa desiderato. Tenendo il connettore in posizione con il braccio stereotassico, posizionare i pin del connettore vicino alle teste delle viti senza contatto con il filo.
Sigillare l'intera area con colla cianoacrilica, assicurandosi che l'area di imaging davanti alle viti del cranio sia indisturbata. Costruisci del cemento dentale attorno alla base dei perni d'oro, assicurandoti che i perni d'oro delle viti del cranio non siano collegati a quelli nella fase della testa. Lasciare indurire il cemento dentale prima di rimuovere il connettore dello stadio principale.
Per iniziare, accendi il computer IOS e la scheda del pannello LED. Montare l'animale anestetizzato impiantato con elettrodo in un letto d'impatto sotto la telecamera. E regolare l'anello di messa a fuoco per coprire la superficie corticale.
Dopo aver caricato il segnale ottico intrinseco, o le impostazioni IOS, premere il pulsante Live per visualizzare il mouse e centrare il cranio dell'animale sotto la telecamera. Quindi, premere Acquisizione Multi-D per accedere alle impostazioni di acquisizione e selezionare i punti temporali desiderati. Salva le immagini nel percorso del file designato con il prefisso del nome appropriato.
Collegare i pin dorati dall'animale al connettore del palcoscenico della testa e poi al tavolino della testa. Accendere il computer di elettrofisiologia e collegare il computer all'apparecchiatura di elettrofisiologia. Dopo aver caricato le impostazioni per il software Intan, fare clic sull'icona Scegli formato file e, nella finestra pop-up, selezionare Un file per tipo di segnale Formato.
Quindi, nella scheda BW in Larghezza di banda hardware, selezionare la larghezza di banda dell'amplificatore da 0,13 a 500 hertz. Selezionare Wide in Selettore visualizzazione filtro. Dopo aver impostato i filtri passa-basso e passa-alto, fare clic sull'icona Seleziona nome file per selezionare il percorso del file desiderato per il salvataggio.
Per l'impatto, accendere l'impattatore elettromagnetico e premere la leva per verificare se la punta si ritrae e si estende correttamente. Posiziona rapidamente l'animale su un letto di schiuma e fai scorrere il letto sotto la punta dell'impattatore. Allineare la punta dell'impattatore con la linea mediana e posizionarla a un millimetro di rostrale di bregma.
Quindi, abbassare la punta dell'impattatore fino a toccare saldamente la parte superiore della testa dell'animale. Spingere la leva per ritrarre la punta dell'impattatore, quindi abbassarla manualmente di cinque millimetri prima di attivare la leva di impatto. Rimuovere immediatamente l'animale dal letto di schiuma e posizionarlo sotto la fotocamera per l'imaging entro cinque secondi.
Fare clic su Acquisisci per avviare l'imaging IOS nella finestra Acquisizione multidimensionale. Cattura immagini per quattro minuti per registrare l'intero evento di depolarizzazione che si diffonde. Per avviare la registrazione elettrofisiologica, fare clic sull'icona Registra nel software Intan.
Al termine della registrazione, scollegare l'animale dal tavolino e dal connettore e rimetterlo nella sua gabbia. Per aprire la pila di immagini, fai clic su File, seguito da Importa e Sequenza immagini. Disegna un quadrato usando il cursore, definendo la regione di interesse, per generare il grafico della depolarizzazione di diffusione.
Passare a Immagine, quindi a Pile e Traccia profilo asse Z per tracciare il grafico e fare clic sul pulsante Live. Nel grafico generato, fare clic su Elenco per generare un elenco di valori. Per la visualizzazione, convertire l'immagine in scala di grigi con una tabella di ricerca incendiaria.
Sono state osservate depolarizzazioni diffuse che si propagano attraverso la corteccia e i grandi vasi sanguigni attraverso la finestra. L'attività ad alta frequenza nelle registrazioni elettrofisiologiche ha mostrato un rapido ritorno negli animali fittizi dopo la rimozione dell'isoflurano. Ma negli animali depolarizzati, l'attività ad alta frequenza è rimasta soppressa per diversi minuti prima del recupero.
I grafici di potenza hanno dimostrato un chiaro aumento di potenza dopo il recupero dalla soppressione in entrambe le condizioni.
