Name: prolonged incubation of acute neuronal tissue for electrophysiology and calcium-imaging
Uploaded: 2017-02-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
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We thank Colin Symons and James Wright for technical assistance. This work was supported by seed funding grant (WSU) to Y.B. and the innovation office at Western Sydney University. M.C. is supported by ARC fellowship (DECRA).

Il protocollo seguente descrive la preparazione di C57BL / 6 e C3H / He (retinally degeneri) tessuto neuronale mouse, ma le tecniche simili possono essere applicati ad altre specie. Tutti gli animali erano sani e maneggiato con condizioni standard di temperatura, umidità, 12 ore di luce / buio ciclo, libero accesso a cibo e acqua, e senza stimoli di stress previsti. Tutti gli esperimenti sono stati approvati ed eseguiti in accordo con il comitato Occidentale Sydney University cura degli animali e etica e secondo l&#39;uso animale e le linee guida per la cura degli animali (Research Autorità # A9452, # A10396 e # A8967). 1. Cervello Fetta Preparazione <ol><li> Anestetizzare l&#39;animale per inalazione di isoflurano (5%) e decapitare utilizzando una ghigliottina roditore. Rimuovere il cervello rapidamente, come descritto in precedenza 9 e posizionarlo nella soluzione ghiacciata fisiologica (aCSF) contenente (in mM): 125 NaCl, KCl 2,5, 1 MgCl 2, 1,25 NaH 2 PO 4, 2 CaCl 2, 25NaHCO 3, 25 destrosio, e saturata con CarboGen (95% O 2/5% della miscela di CO 2; 310 mOsm; pH 7,4). </li><li> Tagliare sezioni di cervello, nella regione di interesse, 300 micron di spessore con un microtomo vibrante. </li><li> Trasferire le fette di un sistema di incubazione su misura che monitora e controlla i livelli di pH (pH 7,2-7,4) da vicino, il flusso di CarboGen, e la temperatura come descritto in precedenza 10, 11. </li><li> Impostare temperatura iniziale della camera a 35 ° C per 15 - 30 min, e poi lentamente ridurre a 15 - 16 ° C, come mostrato nella Figura 1C. Incubare fette nel sistema di incubazione fino a quando necessario, sia per elettrofisiologia o imaging. NOTA: se devono essere utilizzati per il calcio fette imaging, seguire i passi di seguito prima di raffreddamento del tessuto sotto RT. </li></ol> 2. retina Wholemount Preparazione e interna rimozione membrana limitante <ol><li> Preparare wholemounts retina in entrambi i normalicondizioni di illuminazione di laboratorio o fioca luce rossa / infrarossi. </li><li> L&#39;eutanasia degli animali da dislocazione cervicale e immediatamente gli occhi enucleare. Fare un piccolo taglio lungo la serrata, e il luogo in entrambe le Ames dei media, o aCSF contenente (mm): 125 NaCl, 25 NaHCO 3, 3 KCl, 2 CaCl 2, 1 MgCl 2, 10 di glucosio, 0.5 L-glutammina, e saturare con CarboGen (95% O 2/5% CO 2 miscela; ~ 300 mOsm; pH 7,4), a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere immediatamente la cornea, cristallino e vitreo tagliando lungo la serrata con piccole forbici e la rimozione del cristallino e corpo vitreo con una pinza. Posizionare il tessuto nel sistema di incubazione a RT. NOTA: tessuto retinico può essere mantenuta nell&#39;occhio coppa, dopo la riduzione di temperatura lento a 15 - 16 ° C, per&gt; 24 ore nel sistema di incubazione fino a quando necessario. </li><li> Per rimuovere la ILM, trasferire l&#39;occhio-tazza contenente la retina un vasetto di vetro contenente papaina 30 U / mL, 1 mM L-cistina, 0,5 mM EDTA e 0,005% in DNasi Earl&#39;s-Soluzione salina bilanciata (BSS) a 37 ° C per 20 min. Applicare 95% O 2/5% di CO 2 alla soluzione attraverso il coperchio ma non fare bolle. Se si utilizza il tessuto da animali giovani (&lt;6 settimane), diluire la soluzione a mezza forza. <ol><li> Arrestare digestione enzimatica, posizionando il tessuto in una soluzione ovomucoid (10 mg / mL) e BSA (10 mg / ml) per 10 min in BSS Earl. tessuto Lavare accuratamente con aCSF prima del trasferimento al sistema di incubazione e ridurre la temperatura a 15 - 16 ° C. </li></ol></li><li> Mantenere tessuto retinico in un occhio-tazza fino a quando necessario. Per il trasferimento al microscopio, isolare la retina dall&#39;occhio-tazza e tagliato in 4 pezzi con una lametta. Se è richiesta l&#39;intera retina, fare quattro piccoli tagli nella periferia della retina per permettere di distendersi. NOTA: Per gli esperimenti di imaging, carico con calcio-coloranti prima del trasferimento al sistema di incubazione, vedere di seguito. </li></ol> 3. Il mantenimento dei tessuti nell&#39;incubatrice <ol><li&gt; Posizionare tessuto nella camera principale contenente sonde per misure di pH e temperatura (Figura 1A, B). </li><li> Circolare aCSF attraverso una seconda camera (camera UVC, costruito come descritto in precedenza 12) isolata dalla camera principale ed esposti a 1,1 W luce UVC (254 nm, 5W / 2P sterilizzatrice lampada UV) per eradiate batteri galleggiano nella soluzione (Figura 1A). temporizzazione luce controllo UVC tramite un timer programmabile tramite una funzione casuale che si attiva in tempi variabili tra 15 e 26 min ogni 15 - 30 min per evitare eccessivo riscaldamento del aCSF. </li><li> Impostare la portata nella camera UVC a 12 ml / min come riportato in precedenza 12. Coprire la camera UVC con un foglio di alluminio per evitare l&#39;illuminazione UVC di fuori della camera, che può danneggiare il tessuto neuronale. NOTA: per tessuto retinico adattata al buio, applicare una copertura su misura per la camera principale per escludere la luce. </li><li> Utilizzare una pompa peristaltica a circulate la soluzione (aCSF) attraverso le due camere e una piastra termoelettrico Peltier cooler per raffreddarsi o riscaldare la camera principale alle temperature desiderate nell&#39;intervallo 0 - 50 ° C. Per incubazione del tessuto ottimale, utilizzare 15 - 16 ° C per la redditività a lungo termine. </li></ol> 4. Il calcio Dye Caricamento <ol><li> Selezionare coloranti di calcio in base alla preferenza del singolo ricercatore. Qui usiamo Fura-02:00, Fluo-08:00 o Fluo-4 del mattino. Tuttavia, questo metodo può essere applicato ad altri coloranti così: sciogliere coloranti calcio in DMSO ad una soluzione 1 mM e 1% di copolimeri a blocchi (es, acido-127 Pluronic) ad un volume finale di 50 microlitri e ultrasuoni per 10 min. </li><li> Aggiungere la soluzione al aCSF ad una concentrazione finale di 10 mM, 0,01% copolimeri a blocchi di fettine cerebrali, e 20 pM (retina), 0,02% copolimeri a blocchi per la retina. In retinae (papaina trattato) e sezioni di cervello da animali giovani, carico al bagno per 45 min a 37 ° C (Fura-2 AM) o RT (Fluo-4 del mattino; Fluo-08:00). <ol><li> Per gli animali adulti, (&gt; 12 settimane) pipettare i coloranti (50 ml) direttamente sui sezioni di cervello, e mantenere per 75 minuti per consentire una migliore penetrazione del colorante negli strati profondi. </li><li> Per assicurare un&#39;adeguata ossigenazione della fetta sommersa durante l&#39;incubazione colorante, preparare un vetro camera di carico con coperchio chiuso (barattolo circolare del diametro di 2,5 cm, 3,5 cm di altezza) con coloranti calcio diluito in 2,5 mL di aCSF. Ossigenare continuamente con il 95% O 2/5% di CO 2. Non farlo bolla. </li></ol></li><li> Dopo dye carico, lavare il tessuto con aCSF e trasferimento al sistema di incubazione, ridurre lentamente la temperatura a 15 - 16 ° C fino al momento dell&#39;uso sperimentale. </li></ol> 5. elettrofisiologiche Recordings e Imaging <ol><li> Posizionare il tessuto in una camera di registrazione sommerso sotto un microscopio, e profumato con ossigenato aCSF ad una portata di 4 - 5 mL / min sia a RT (~ 22 ° C) o temperatura fisiologica (~ 35 ° C). Hold il tessuto in luogo utilizzando un custom made &#39;&#39; arpa &#39;&#39;, realizzato in nylon o in oro le discussioni tese e incollate su un pezzo a forma di U di oro o filo di platino. </li><li> Per elettrofisiologia: <ol><li> Preparare pipette di registrazione da 1,5 mm (1,19 millimetri ID) in vetro borosilicato con un estrattore micropipetta per ottenere una resistenza finale di 5-6 MW. </li><li> Riempire la pipetta con 3-4 ml di soluzione interna come descritto in precedenza 13 e visualizzare le cellule sotto infrarossi interferenza differenziale contrasto (IR-DIC) utilizzando una telecamera CCD. La soluzione intracellulare deve essere attentamente su misura per ogni esperimento per ottenere risultati sperimentali. </li><li> Posizione pipetta, mantenendo una pressione positiva applicata attraverso una porta di aspirazione sul supporto pipetta, sulla membrana di una cellula con un micromanipolatore. Poiché la ILM è stato rimosso dalla retina, non è richiesta alcuna raschiare membrana prima. Una volta che la pipetta è sulla cella, applicare delicato negativopressione alla pipetta per ottenere una tenuta gigaohm. Poi rompere la membrana cellulare con una breve quantità di pressione negativa. </li><li> Effettuare registrazioni current- o tensione-clamp cellule intere utilizzando tecniche standard a seconda dei casi. </li></ol></li><li> Calcio-immagini: <ol><li> Per l&#39;imaging raziometrico di Fura-2, utilizzare un ultra-alta lunghezza d&#39;onda switcher velocità per offrire lunghezze d&#39;onda di eccitazione di 340 nm e 380 nm. Far passare la luce emessa da singole cellule attraverso un filtro di emissione di 510 ± 20 nm, e catturare con un&#39;elevata sensibilità, fotocamera digitale ad alta velocità. </li><li> Per una singola lunghezza d&#39;onda di eccitazione di Fluo-4, la luce filtro di eccitazione attraverso un 460 - filtro passa banda nm 490 e la luce emessa attraverso un 515 - filtro passa banda nm 550. Per la registrazione più veloce e sensibile utilizzare una fotocamera digitale ad alta velocità tale. Acquisire immagini come richiesto. </li><li> Misurare alterazioni di fluorescenza in funzione del tempo sia ad una sola lunghezza d&#39;onda (Fluo-4) o utilizzando il rapporto di lunghezza d&#39;ondaMetodo (Fura-2), come precedentemente descritto 8, 14. </li></ol></li></ol>

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Yossi Buskila and Paul Breen declare that they are co-owners of PAYO Scientific Pty Ltd, a company specialized in building incubation systems for acute neural tissue. All other authors report no financial interests or potential conflicts of interest related to the current study.

Questo articolo descrive un metodo di incubazione per estendere la vitalità del tessuto neuronale acuta per immagini ed elettrofisiologici esperimenti, riducendo così il numero di animali necessari per completare obiettivi sperimentali. Due processi principali governano il deterioramento del tessuto neuronale nel tempo: i) un aumento dei livelli di batteri, e il conseguente aumento endotossina batterica rilasciato, e ii) eccitotossicità che segue la procedura affettamento traumatica 10. Come t...

Elettrofisiologia e di imaging funzionale (calcio, tensione di coloranti sensibili) sono due delle tecniche sperimentali più comunemente utilizzati nel campo delle neuroscienze. preparati fetta del cervello e della retina wholemount, che sarà esaminato qui, forniscono un mezzo per esaminare le proprietà elettrofisiologiche e connettività sinaptica senza contaminazione da anestetici o miorilassanti. Fettine di cervello e della retina wholemount mantenere la loro integrità strutturale, a differenza di culture o omogenati cellulari, permettendo lo studio di circuiti specifici e reti del cervello 1. Le registrazioni dal tessuto isolato presentano vantaggi rispetto vivo registrazioni i movimenti connessi con il battito cardiaco e la respirazione sono eliminati. Inoltre, la visualizzazione diretta permette specifiche classi di celle da mirati, e l&#39;applicazione locale di strumenti farmacologici 2, 3. registrazioni patch-clamp e calcIUM Dye-carico in wholemount retina è complicato dalla presenza di Inner Limitazione membrana (ILM), che copre lo strato di cellule gangliari della retina (RGC) e impedisce l&#39;accesso diretto alle cellule. Tipicamente, questa membrana è raschiato via con una pipetta di vetro per consentire l&#39;applicazione diretta di una pipetta di patch e la formazione di un sigillo gigaohm su una singola cella. Inoltre, coloranti calcio bagno-applicata non attraversano la ILM e devono o essere iniettato sotto questa membrana 4, retrograda trasportato dopo l&#39;iniezione al nervo ottico o 5 elettroporate attraverso il tessuto 6. Inoltre, quando si utilizza un modello di roditore di retinite pigmentosa, il mouse rd / rd, la ILM è più spessa e più impenetrabile. Qui, si usa una tecnica per rimuovere il ILM con digestione enzimatica 7, per consentire sia onnipresente calcio dye-carico e l&#39;accesso diretto alle cellule gangliari della retina per recordi patch-clampngs 8. registrazioni di successo da entrambi fettine di cervello o wholemount retina dipendono da dissezione e l&#39;incubazione del tessuto neuronale vitali. Tipicamente, il tessuto viene estratto il mattino dell&#39;esperimento ed incubato nel liquido cerebrospinale artificiale (aCSF) fino al suo utilizzo per le registrazioni. Di solito, il tessuto rimane vitale per 6 - 8 ore, con notevole degrado in seguito questa finestra temporale. Tuttavia, entrambe le fettine di cervello e preparati RETINÆ wholemount solito producono più tessuto che può essere registrata all&#39;interno di questo breve periodo di tempo. Di conseguenza, il tessuto è spesso scartata alla fine della giornata e la dissezione è completata nuovamente nei giorni successivi. Questo significa che un altro animale è utilizzato e ~ 2 ore di messa a punto e la dissezione / colorazione ripetuto. Il protocollo che segue descrive un metodo per prolungare la durata del tessuto neuronale per più di 24 ore, il che significa meno animali vengono utilizzati, e il tempo più sperimentale è disponibile. Tissue vitalità wvalutata attraverso la registrazione di proprietà elettrofisiologiche e le dinamiche del calcio, e queste proprietà erano indistinguibili tra &lt;4 ore e&gt; 24 ore postdissection. Questi risultati indicano che non solo sono proprietà delle celle singole intatte e funzionali dopo incubazione prolungata, ma l&#39;attività di rete, come valutato dal calcio-imaging e registrazioni elettrofisiologiche, è invariato&gt; 24 h postdissection. Inoltre, dimostriamo che coloranti calcio possono rimanere nelle cellule per periodi prolungati senza provocare effetti dannosi. L&#39;applicazione di questo protocollo dimostra che l&#39;attività funzionale dei neuroni nel tessuto neuronale acuta può essere mantenuta per lunghi periodi, una volta che l&#39;ambiente esterno è altamente regolata. Inoltre, come la vitalità del tessuto varia notevolmente tra i laboratori a causa di diversi protocolli di incubazione, questo metodo stabilisce un gold standard per i parametri ideali che dovrebbero essere applicati per ridurre la variabilità nella salute di Neu acutatessuto Ronal.

<table><tbody><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma Aldrich VETEC</td><td>V800372</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>N-Methyl-D-glucamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2004&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate monobasic</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2554</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9272&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>Papain Dissociation System</td><td>Worthington&amp;nbsp;</td><td>LK003150</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide anhydrous</td><td>Sigma Aldrich</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127 Low UV absorbance*</td><td>Life technologies</td><td>P-6867</td><td>20% solution in DMSO&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fura-2 AM&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Anaspec</td><td>84017</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>F23917</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-8 AM</td><td>Abcam</td><td>Ab142773</td><td></td></tr><tr><td>Vibrating blade microtome&amp;nbsp;</td><td>Leica Biosystem</td><td>VT1200 S</td><td>Equiped with Leica&amp;rsquo;s Vibrocheck&amp;trade; measurement device&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Antivibration table</td><td>Kinetic Systems Vibraplane&amp;nbsp;</td><td>Vibraplane 9100/9200&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fixed Stage Upright Microscope</td><td>Olympus</td><td>BX51WI&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Objective</td><td>Olympus</td><td>XLUMPlanFLN 20x/1.00w</td><td>20X&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Microscope Objective</td><td>Olympus</td><td>LUMPlanFLN 60x/1.00w</td><td>60X</td></tr><tr><td>CCD Camera</td><td>Andor</td><td>Ixon +</td><td></td></tr><tr><td>High speed wavelength switcher</td><td>Sutter instrument</td><td>Lambda DG-4&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Patch clamp amplifier</td><td>Molecular Devices</td><td>MultiClamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>Data acquisition system</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1440A</td><td>Axon Digidata&amp;reg; System</td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillaries</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>BF150-86-10</td><td></td></tr><tr><td>Microelectrode puller</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>P-97</td><td>Flaming/Brown type micropipette puller</td></tr><tr><td>Recording/perfusion chamber</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-40LP</td><td>Low Profile Open Bath Chambers</td></tr><tr><td>Software</td><td>Molecular Devices</td><td>pClamp 10.2</td><td></td></tr><tr><td>Andor iQ Live Cell Imaging Software</td><td>Andor</td><td>Andor iQ3</td><td></td></tr><tr><td>Braincubator</td><td>Payo Scientific</td><td>BR26021976</td><td>www.braincubator.com.au</td></tr><tr><td>Peltier-Thermoelectric Cold Plate Cooler</td><td>TE Technology</td><td>CP-121</td><td></td></tr><tr><td>Temperature Controller</td><td>TE Technology</td><td>TC-36-25 RS232</td><td></td></tr></tbody></table>

prolonged incubation of acute neuronal tissue for electrophysiology and calcium-imaging

Acuta preparati tessuto neuronale, fettine di cervello e della retina wholemount, di solito può essere mantenuta solo per 6-8 ore dopo la dissezione. Ciò limita il tempo sperimentale, e aumenta il numero di animali che sono utilizzate per studio. Questa limitazione in particolare gli impatti protocolli come l&#39;imaging di calcio che richiedono una prolungata pre-incubazione con coloranti vasca da applicare. crescita batterica esponenziale entro 3 - 4 h dopo il taglio è strettamente correlata con una diminuzione della salute dei tessuti. Questo studio descrive un metodo per limitare la proliferazione di batteri preparati acute per mantenere il tessuto neuronale vitale per periodi prolungati di tempo (&gt; 24 h) senza la necessità di antibiotici, procedure sterili o terreni di coltura contenenti fattori di crescita. Con ciclismo liquido extracellulare tramite irradiazione UV e mantenendo il tessuto in una camera di contenimento personalizzati 15 - 16 ° C, il tessuto non mostra differenze nelle proprietà elettrofisiologiche, o si calciognaling attraverso coloranti intracellulari di calcio a&gt; 24 h postdissection. Questi metodi non solo estendere il tempo di sperimentazione per coloro che utilizzano il tessuto neuronale acuta, ma ridurrà il numero di animali necessari per completare gli obiettivi sperimentali, e stabiliscono un gold standard per l&#39;incubazione del tessuto neuronale acuta.

stretta regolazione della carica batterica e la temperatura del aCSF durante l&#39;incubazione è essenziale per mantenere la vitalità del tessuto neuronale. Questo può essere ottimizzato mediante irraggiamento con luce UVC e mantenendo la temperatura della aCSF a 15 - 16 ° C (Figura 1). Inoltre, il aCSF parametri di bollo (APS; Figura 1C) fornisce lo sperimentatore con un record delle condizioni ambientali (pH e temperatura.), Offrendo così un gold ...

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Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

Una volta rimosso dal corpo, tessuto neuronale è fortemente influenzata dalle condizioni ambientali, con conseguente eventuale degradazione del tessuto dopo 6 - 8 h. Utilizzando un metodo incubazione unica, che monitora e regola l&#39;ambiente extracellulare del tessuto, vitalità del tessuto può essere significativamente prolungata per&gt; 24 h.

L&#39;incubazione prolungata di acuta neuronale tessuto per Elettrofisiologia e Calcio imaging

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.9K Views.  Western Sydney University.  Una volta rimosso dal corpo, tessuto neuronale è fortemente influenzata dalle condizioni ambientali, con conseguente eventuale degradazione del tessuto dopo 6 - 8 h. Utilizzando un metodo incubazione unica, che monitora e regola l'ambiente extracellulare del tessuto, vitalità del tessuto può essere significativamente prolungata per> 24 h. 

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Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

Vibrodissociation di neuroni da fettine di cervello di roditore studio di trasmissione sinaptica e Immagine terminali presinaptici

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

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Neuroscienze

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in regulating the intracellular calcium concentration. Changing environmental conditions, such as the light-dark cycle, can modify neuronal and neural network activity and the expression of a family of circadian clock genes within the suprachiasmatic nucleus (SCN), the location of the master circadian clock in the mammalian brain. Excitatory synaptic transmission leads to an increase in the postsynaptic Ca2+ concentration that is believed to activate the signaling pathways that shifts the rhythmic expression of circadian clock genes. Hypothalamic slices containing the SCN were patch clamped using microelectrodes filled with an internal solution containing the calcium indicator bis-fura-2. After a seal was formed between the microelectrode and the SCN neuronal membrane, the membrane was ruptured using gentle suction and the calcium probe diffused into the neuron filling both the soma and dendrites. Quantitative ratiometric measurements of the intracellular calcium concentration were recorded simultaneously with membrane potential or current. Using these methods it is possible to study the role of changes of the intracellular calcium concentration produced by synaptic activity and action potential firing of individual neurons. In this presentation we demonstrate the methods to simultaneously record electrophysiological activity along with intracellular calcium from individual SCN neurons maintained in brain slices.

Procedures are described to perform simultaneous recordings of membrane potential or current and changes of intracellular calcium concentration. Suprachiasmatic nucleus neurons are filled with the calcium indicator bis-fura-2 using a patch clamp electrode in the whole cell patch clamp configuration.

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high spatial and temporal resolution. Combined with electrophysiology, it is widely used to study activity-related calcium signals in small subcellular compartments such as dendrites and dendritic spines. In addition to calcium transients, synaptic activity also induces postsynaptic sodium signals, the properties of which are only marginally understood. Here, we describe a method for combined whole-cell patch-clamp and multi-photon sodium imaging in cellular micro domains of central neurons. Furthermore, we introduce a modified procedure for ultra-violet (UV)-light-induced uncaging of glutamate, which allows reliable and focal activation of glutamate receptors in the tissue. To this end, whole-cell recordings were performed on Cornu Ammonis subdivision 1 (CA1) pyramidal neurons in acute tissue slices of the mouse hippocampus. Neurons were filled with the sodium-sensitive fluorescent dye SBFI through the patch-pipette, and multi-photon excitation of SBFI enabled the visualization of dendrites and adjacent spines. To establish UV-induced focal uncaging, several parameters including light intensity, volume affected by the UV uncaging beam, positioning of the beam as well as concentration of the caged compound were tested and optimized. Our results show that local perfusion with caged glutamate (MNI-Glutamate) and its focal UV-uncaging result in inward currents and sodium transients in dendrites and spines. Time course and amplitude of both inward currents and sodium signals correlate with the duration of the uncaging pulse. Furthermore, our results show that intracellular sodium signals are blocked in the presence of blockers for ionotropic glutamate receptors, demonstrating that they are mediated by sodium influx though this pathway. In summary, our method provides a reliable tool for the investigation of intracellular sodium signals induced by focal receptor activation in intact brain tissue.

We describe the combination of focal UV-induced photo-activation of neuro-active compounds with whole-cell patch-clamp and multi-photon imaging of intracellular sodium transients in dendrites and spines of hippocampal neurons in acute tissue slices of the mouse brain.

Multi-fotone intracellulare di sodio Imaging Combinato con UV-mediata uncaging focale di glutammato in neuroni piramidali CA1

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high ...

Investigation of Synaptic Tagging/Capture and Cross-capture using Acute Hippocampal Slices from Rodents

Synaptic tagging and capture (STC) and cross-tagging are two important mechanisms at cellular level that explain how synapse-specificity and associativity is achieved in neurons within a specific time frame. These long-term plasticity-related processes are the leading candidate models to study the basis of memory formation and persistence at the cellular level. Both STC and cross-tagging involve two serial processes: (1) setting of the synaptic tag as triggered by a specific pattern of stimulation, and (2) synaptic capture, whereby the synaptic tag interacts with newly synthesized plasticity-related proteins (PRPs). Much of the understanding about the concepts of STC and cross-tagging arises from the studies done in CA1 region of the hippocampus and because of the technical complexity many of the laboratories are still unable to study these processes. Experimental conditions for the preparation of hippocampal slices and the recording of stable late-LTP/LTD are extremely important to study synaptic tagging/cross-tagging. This video article describes the experimental procedures to study long-term plasticity processes such as STC and cross-tagging in the CA1 pyramidal neurons using stable, long-term field-potential recordings from acute hippocampal slices of rats.

This video article describes experimental procedures to study long-term plasticity and its associative processes such as synaptic tagging, capture and cross-tagging in the CA1 pyramidal neurons using acute hippocampal slices from rodents.

Indagine di Synaptic Tagging / Cattura e Cross-cattura utilizzando acuta fettine di ippocampo da Roditore

Synaptic tagging and capture (STC) and cross-tagging are two important mechanisms at cellular level that explain how synapse-specificity and associativity ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network dynamics in neuronal cultures. In contrast with more traditional methods, such as patch-clamping, which can only record activity from a single cell, MEAs can record simultaneously from multiple sites in a network, without requiring the arduous task of placing each electrode individually. Moreover, numerous control and stimulation configurations can be easily applied within the same experimental setup, allowing for a broad range of dynamics to be explored. One of the key dynamics of interest in these in vitro studies has been the extent to which cultured networks display properties indicative of learning. Mouse neuronal cells cultured on MEAs display an increase in response following training induced by electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neuronal cells on MEAs; successfully record from over 95% of the plated dishes; establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation; and sort, plot, and interpret the results from such experiments. The use of a proprietary system for stimulating and recording neuronal cultures is demonstrated. Software packages are also used to sort neuronal units. A custom-designed graphical user interface is used to visualize post-stimulus time histograms, inter-burst intervals, and burst duration, as well as to compare the cellular response to stimulation before and after a training protocol. Finally, representative results and future directions of this research effort are discussed.

Mouse neuronal cells cultured on multi-electrode arrays display an increase in response following electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neurons, how to record activity, and how to establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation.

Aumento del tempo della risposta alla rete alla stimolazione delle colture cellulari neuronali sulle matrici di microelettrodi

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Two-photon Imaging of Microglial Processes' Attraction Toward ATP or Serotonin in Acute Brain Slices

Microglial cells are resident innate immune cells of the brain that constantly scan their environment with their long processes and, upon disruption of homeostasis, undergo rapid morphological changes. For example, a laser lesion induces in a few minutes an oriented growth of microglial processes, also called &#34;directional motility&#34;, toward the site of injury. A similar effect can be obtained by delivering locally ATP or serotonin (5-hydroxytryptamine [5-HT]). In this article, we describe a protocol to induce a directional growth of microglial processes toward a local application of ATP or 5-HT in acute brain slices of young and adult mice and to image this attraction over time by multiphoton microscopy. A simple method of quantification with free and open-source image analysis software is proposed. A challenge that still characterizes acute brain slices is the limited time, decreasing with age, during which the cells remain in a physiological state. This protocol, thus, highlights some technical improvements (medium, air-liquid interface chamber, imaging chamber with a double perfusion) aimed at optimizing the viability of microglial cells over several hours, especially in slices from adult mice.

Microglia, the resident immune cells of the brain, respond quickly with morphological changes to modifications of their environment. This protocol describes how to use two-photon microscopy to study the attraction of microglial processes toward serotonin or ATP in acute brain slices of mice.

Imaging del due-fotone di attrazione dei processi Microglial verso ATP o serotonina nelle fette del cervello acuto

Microglial cells are resident innate immune cells of the brain that constantly scan their environment with their long processes and, upon disruption of ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from parallel fibers (PF) to Purkinje cells (PC) is considered the basis for motor learning, and deficiencies of both LTD and motor learning are observed in various gene-manipulated animals. Common motor learning sets, such as adaptation of the optokinetic reflex (OKR), the vestibular-ocular reflex (VOR), and rotarod test were used for evaluation of motor learning ability. However, results obtained from the GluA2-carboxy terminus modified knock-in mice demonstrated normal adaptation of the VOR and the OKR, despite lacking PF-LTD. In that report, induction of LTD was only attempted using one type of stimulation protocol at room temperature. Thus, conditions to induce cerebellar LTD were explored in the same knock-in mutants using various protocols at near physiological temperature. Finally, we found stimulation protocols, by which LTD could be induced in these gene-manipulated mice. In this study, a set of protocols are proposed to evaluate LTD-induction, which will more accurately allow examination of the causal relationship between LTD and motor learning. In conclusion, experimental conditions are crucial when evaluating LTD in gene-manipulated mice.

In some gene-manipulated animals, using a single protocol may fail to induce LTD in cerebellar Purkinje cells, and there may be a discrepancy between LTD and motor learning. Multiple protocols are necessary to assess LTD-induction in gene-manipulated animals. Standard protocols are shown.

Valutazione dell'induzione della depressione a lungo termine nelle fette di cerebellar adulto

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...

Measuring Neural Activity in a Mouse Brain Slice after Prolonged Incubation

Source: Cameron, M. A., et al., <a href="https://app.jove.com/v/55396">Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging.</a> J. Vis. Exp. (120), (2017)
This video demonstrates a technique for measuring neuronal activity in mouse brain slices using calcium imaging and electrophysiological recordings. By perfusing the tissue with potassium ions and recording intracellular calcium changes through high-speed digital imaging, this method reveals real-time neuronal responses.

Misurazione dell'attività neurale in una fetta di cervello di topo dopo un'incubazione prolungata

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.
1. Calcium Dye Loading

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JoVE Encyclopedia of Experiments

Neurophysiology

Imaging and Optical Techniques

A Technique for the Prolonged Incubation of Neuronal Tissue of the Retina

For retinal whole mount preparation, immediately enucleate the eyes from a euthanized animal. Make a small cut along the ora serrata, and place the eyes in either Ames Media or aCSF with carbogen supply at room temperature. After that, immediately remove the cornea, lens, and vitreous by cutting along the ora serrata with small scissors, and remove them with forceps. Place the tissue in the incubation system at room temperature.
To remove the inner limiting membrane, transfer the eye cup containing the retina to a small glass jar containing papain, L-cysteine, EDTA, and DNAse at 37 degrees Celsius for 20 minutes. Apply carbogen to the solution through the lid, but do not bubble. Stop the enzymatic digestion by placing the tissue in an ovomucoid and BSA solution for 10 minutes in Earl&#39;s BSS. Then, wash the tissue thoroughly with aCSF.
Subsequently, transfer the tissue to the incubation system and reduce the temperature to about 15 to 16 degrees Celsius. Following that, transfer the retinal tissue to the microscope; isolate the retina from the eye cup, and cut it into four pieces with a razor blade. If the entire retina is required, make four small cuts in the periphery of the retina to allow it to lie flat.
This tissue can now be transferred to the microscope for electrophysiology, or maintained in the Braincubator. The tissue is maintained in the main chamber containing the probes for pH and temperature measurements. A second chamber is isolated from the main chamber and is exposed to 1.1 watts UVC light in order to irradiate bacteria floating in the solution. Use a peristaltic pump to circulate aCSF through the two chambers, and a Peltier thermoelectric cold plate to either cool or heat the main chamber.

L'incubazione prolungata di acuta neuronale tessuto per Elettrofisiologia e Calcio imaging

Riepilogo

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