La fosfatasi tirosina SHP2, è un mediatore chiave della segnalazione cellulare, promuovendo la sopravvivenza e la proliferazione cellulare. Il mio team si concentra sulla ricerca di inibitori SHP2 a piccole molecole per il trattamento del cancro. La nostra tecnica fornisce un metodo rapido e potente per stabilire penetranti cellulari, così come l'impegno bersaglio di inibitori SHP2 di piccole molecole, nelle cellule.
Questo è assicurato, le risorse di individuazione sono dirette in modo efficiente. SHP2 come obiettivo attraente per la terapia del cancro. E diversi inibitori dell'SHP2, sono in sperimentazione clinica.
La nostra tecnica per facilitare la scoperta di inibitori di nuova generazione con profili di efficacia migliorati. A dimostrare la procedura sarebbero Celeste Romero, assistente di ricerca e Douglas Sheffler, un assistente di ricerca professore, del nostro laboratorio. Per iniziare a staccare le cellule T HEK293 dalle piastre, usando tre millilitri di reagente di distacco cellulare.
Diluire le cellule con 12 millilitri di mezzi di crescita e raccoglierle per centrifugazione a 1.400 volte G, per quattro minuti. Rimorsi il palato cellulare in 10 millilitri di mezzi di crescita e misurare la concentrazione e la vitalità delle cellule con tripano blu e un contatore cellulare. Placca 700.000 cellule in crescita esponenziale in ogni pozzo di una piastra di coltura di sei pozzi e incubale per 24 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.
Il giorno dopo, diluire due microgrammi di DNA plasmatico in 200 microlitri di tampone di trasfezione. Vortice il DNA plasmatico per 10 secondi e centralmentefugarlo a 1.400 volte G per quattro minuti. Aggiungere quattro microlitri di reagente di trasfezione al DNA diluito.
Vortice per 10 secondi, e ripetere la centrifugazione. Incubare il DNA a 23 gradi Celsius per 10 minuti, quindi aggiungere il mix di trasfezione alle cellule HEK293 T attaccate nella piastra dei sei pozzi e riportare le cellule nell'incubatrice per altre 24 ore. Per preparare piastre di dosaggio, diluire le soluzioni inibitorie in DMSO, per una concentrazione di scorte di 10 millimolare e erogarle in una piastra sorgente a volume morto ben bassa 384, per un uso immediato.
Individuare il volume desiderato di inibitori o veicoli, utilizzando un gestore liquido in 384 piastre PCR ben in tempo reale a un volume finale target inferiore allo 0,5%DMSO. Sigillare le piastre utilizzando un sigillare a piastre con spurgo di gas inerte. Per preparare le cellule trasfette pre incubare i mezzi di crescita e vendere reagente di distacco in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius.
Rimuovere le cellule dall'incubatore e aspirare delicatamente il supporto dai pozzi. Aggiungere 0,3 millilitri del reagente di distacco cellulare a ciascun pozzo e scuotere delicatamente la piastra avanti e indietro per coprire accuratamente la superficie del fondo della piastra. Incubare la piastra a 23 gradi Celsius per due minuti.
Aggiungere un millilitro di mezzi di crescita a ciascun pozzo e pipettare delicatamente le cellule nel pozzo. Quindi trasferirli in un tubo di centrifuga Falcon da 15 millilitri Centrifugare le cellule a 1.400 volte G per quattro minuti per raccogliere le cellule. Aspirare delicatamente il supporto, quindi rimospendare il pellet cellulare in due millilitri di mezzi di crescita.
Assicurarsi che la vitalità della cella sia maggiore del 90% utilizzando try pan blue e un contatore di cella. Diluire le cellule a una concentrazione di 125 cellule per microlitro, mantenendo le cellule in sospensione per non più di due ore per una vitalità ottimale. Per l'incubazione con inibitori SHP2, erogare le cellule in un trogolo sterile a canale singolo.
Centrifugare la piastra PCR 384 ben in tempo reale preparata in precedenza a 2.500 volte G per cinque minuti, quindi rimuovere la guarnizione e utilizzare una pipetta multicanale da 125 microlitri, per aggiungere cinque microlitri delle celle diluite ai pozzi desiderati. Centrifugare la piastra a 42 volte G per 30 secondi senza coperchio, quindi attaccare un coperchio e incubare la piastra per un'ora a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Programmare il ciclore Thermo, secondo le indicazioni manoscritte per il gradiente del profilo termico o l'esperimento isotermico.
Avviare il programma di impulsi termici del termociclo e posizionare la piastra di dosaggio sul blocco termico. Al termine del programma, rimuovere la piastra di dosaggio. Integrare ogni pozzo della piastra di dosaggio con cinque microlitri di mix master di rilevamento concesso in licenza.
Centrifugare la piastra a 42 volte G per 30 secondi e conservarla a 23 gradi Celsius nell'oscurità per 30-60 minuti. Misura la chemiluminescenza utilizzando un lettore di micropiatte con il tempo di integrazione ottimizzato. L'esperimento del gradiente termico per il tipo selvaggio SHP2, ha portato a un profilo termico cellulare sigmoidale con una stretta transizione di fusione tipica di una proteina piegata.
Incubazione di tipo selvatico SHP2 con l'inibitore allosterico SHP099, stabilizzato al profilo termico in misura significativa e misurabile. La stabilizzazione di SHP2, monitorata anche con la potenza di SHP099 come composti allosterici. A 10 micromolari, il più potente RMC-4550, produceva un grado di stabilizzazione maggiore rispetto a SHP099 per il tipo selvaggio SHP2.
Grazie al loro meccanismo unico, SHP099 come gli inibitori allosterici sono meno efficaci contro molti mutanti oncogeni SHP2, tra cui SHP2-E76K. Coerentemente con queste proprietà note si osserva solo la stabilizzazione termica marginale di SHP2-E76K da parte di SHP099. Il livello di espressione della proteina tag EPL può influenzare drasticamente l'intensità del segnale.
Profili termici per celle di tipo selvatico transitori e stabilmente integrate. in condizioni patrimoniali identiche. La normalizzazione delle curve disparate offre profili termici comparabili, rivelando l'ampia gamma del sistema di rilevamento EFC.
Sfruttando la capacità del ciclore termico di produrre gradienti termici sull'asse corto di una piastra di pozzo 384. una serie di titolazioni isotermiche può essere eseguita su una singola piastra. Ad una temperatura ottimale, una titolazione isotermica utilizzando una risposta alla dose completa di 10 punti, ha prodotto un utile EC50, per RMC-4550.
I principi di questa risorsa potrebbero essere utilizzati per monitorare la degradazione delle proteine nelle cellule, indotte da composti PROTAC. Stiamo usando la tecnica di spostamento thelma cellulare per scoprire gli inibitori del mutante SHP2 e delle leucemie, farmaci specifici contro i frequenti mutanti oncogenici SHP2 avranno un impatto significativo per il trattamento di questi tumori.
