Questo protocollo aiuterà nella determinazione dell'attività delle proteine ATPasi misurando il fosfato libero risultante dall'idrolisi dell'ATP da parte delle proteine. Il test verde malachite è una procedura semplice, sensibile, veloce e poco costosa per la rilevazione del fosfato inorganico. È adatto per l'automazione e lo screening ad alta produttività dei composti rispetto al suo target.
Questa tecnica svolgerà un ruolo importante nella rapida scoperta di inibitori contro la proteina Hsp90, che è un importante bersaglio anti-cancro. Per iniziare, pipettare 40 microlitri di fosfato monomolare standard in 960 microlitri di acqua ultrapura per ottenere una soluzione di fosfato a 40 micromolari. Aggiungere questa soluzione secondo le istruzioni del produttore per formare una diluizione seriale di fosfato da 0 a 40 micromolari.
Quindi, utilizzare otto microlitri di lievito Hsp90 per l'attività misurabile dell'ATPasi. Aggiungere il reagente verde malachite al bianco e al controllo positivo e controllare la differenza di densità ottica tra il bianco e il controllo positivo dopo che l'aggiunta è almeno 0,5 e inferiore a 1. Per preparare l'ATP, trasferire un milligrammo di ATP in una fiala contenente 453,39 microlitri di acqua ultrapura per ottenere una soluzione madre di quattro millimolari.
Preparare l'ATP fresco, in quanto può idrolizzare spontaneamente nel tempo. Aggiungere quattro microlitri di soluzione madre di ATP a ciascun pozzetto per ottenere una concentrazione finale di 0,2 millimolari. Aggiungere ATP come ultimo componente alla reazione utilizzando una pipetta multicanale in modo che tutte le reazioni inizino contemporaneamente.
Quindi, preparare uno stock di 10 millimolari di geldanamicina sciogliendo un milligrammo in 178,37 microlitri di DMSO. Utilizzando la soluzione madre, preparare la soluzione da 4 millimolari, 0,8 millimolari, 0,16 millimolari, 0,032 millimolari, 0,0064 millimolari e 0,00128 millimolari in DMSO mediante diluizione seriale. Aggiungere due microlitri di queste soluzioni madre a ciascun pozzetto per ottenere una concentrazione finale del pozzetto di 0,1 millimolare, 0,02 millimolare, 0,04 millimolare, 0,0008 millimolare, 0,00016 millimolare e 0,000032 millimolare.
Quindi, preparare i pozzetti insieme ai pozzetti contenenti il controllo vuoto e negativo. I pozzetti contenenti geldanamicina servono come controllo positivo. Preparare le piastre a 96 pozzetti e preparare un pozzo separato per i composti che mostrano assorbanza a 620 nanometri per registrare l'assorbanza a questa lunghezza d'onda.
Non mostrare un pozzo separato per la geldanamicina, poiché la geldanamicina non mostra assorbanza a 620 nanometri per la concentrazione utilizzata in questo test. Impostare pozzi di analisi aggiungendo acqua ultrapura a ciascun pozzo. Quindi, aggiungere la quantità richiesta di tampone di analisi e una soluzione composta come la soluzione di geldanamicina.
Aggiungere Hsp90 ai pozzetti appropriati e agitare le piastre per due minuti su uno shaker a temperatura ambiente. Aggiungere quattro microlitri di soluzione di ATP utilizzando una pipetta multicanale. Avvolgere la piastra in un foglio di alluminio e agitare per due minuti su uno scuotitore a temperatura ambiente a 200 giri / min.
Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per tre ore. Interrompere la reazione aggiungendo 20 microlitri di reagente verde malachite nello stesso ordine dell'ATP utilizzando una pipetta multicanale e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Infine, misurare l'assorbanza della piastra a 620 nanometri in un lettore di piastre.
In aggiunta alla piastra A, aggiungere 90 microlitri di tampone di analisi in ciascun pozzetto. In aggiunta alla piastra B, aggiungere 90 microlitri di tampone con Hsp90 in ciascun pozzetto. In aggiunta piastra C, aggiungere 90 microlitri di ATP, e in aggiunta piastra D aggiungere 90 microlitri di reagente verde malachite in ciascun pozzetto.
Utilizzare un sistema di erogazione multicanale automatizzato per trasferire 40 microlitri di soluzione da ciascun pozzetto della piastra di addizione A alle piastre principali uno e due e dalla piastra B alla piastra principale tre e quattro. Trasferire 20 microlitri della soluzione da ciascun pozzetto della piastra composta alle piastre principali uno, piastre principali due, piastre principali tre e piastre principali quattro. Agitare le piastre per un minuto in uno shaker a 200 giri / min.
Trasferire 20 microlitri della soluzione da ciascun pozzetto delle piastre di aggiunta C alle piastre principali uno, due, tre e quattro. Agitare le piastre per un minuto in uno shaker a 200 giri / min. Incubare le piastre a 37 gradi Celsius per tre ore e quindi trasferire 20 microlitri di reagente verde malachite dalla piastra di aggiunta D ai pozzetti delle piastre principali uno, due, tre e quattro.
Dopo un'incubazione di 15 minuti a temperatura ambiente, misurare l'assorbanza della piastra a 620 nanometri in un lettore di piastre. La struttura del verde malachite e le reazioni del reagente verde malachite A con fosfato libero e la successiva reazione con il reagente B sono mostrate qui. In questa figura è rappresentato un grafico standard per la concentrazione standard di fosfato.
Qui, l'asse x rappresenta la concentrazione di fosfato libero o pi greco in micromolare e l'assorbanza a 620 nanometri è rappresentata sull'asse y. Le barre di errore rappresentano la deviazione tra i due numeri campione. La percentuale di attività dell'ATPasi viene utilizzata per misurare l'inibizione dose-dipendente della proteina da parte della geldanamicina.
È stato osservato che la geldanamicina ha inibito la proteina in modo dose-dipendente con un valore IC50 di 0,85 micromolari. Qui, ogni punto è una media di due determinazioni. Lo sviluppo del colore nella piastra principale uno dopo l'aggiunta dell'agente verde malachite è mostrato in questa immagine.
Il colore rosa nel pozzo A11 è dovuto al colore composto. Allo stesso modo, lo sviluppo del colore nella piastra principale due è mostrato qui. Il colore rosa nel pozzo A11 è dovuto alla natura colorata del composto.
Lo sviluppo del colore dopo l'aggiunta del reagente verde malachite nella piastra principale tre e nella piastra principale quattro è mostrato qui. L'aggiunta di ATP e reagente verde malachite allo stesso intervallo di tempo ad ogni pozzetto è una cosa importante da ricordare quando si tenta questa procedura.
