Come suggerisce il nome della nostra istituzione, Istituto di Medicina Materno-Fetale, la nostra ricerca si concentra principalmente sulla biologia riproduttiva femminile. Il nostro obiettivo è comprendere il meccanismo dei disturbi riproduttivi e identificare potenziali bersagli per il loro trattamento. Uno dei principali vantaggi di questo approccio è la sostanziale riduzione del tempo e dei costi rispetto ai sistemi di co-coltura disponibili in commercio.
L'impalcatura fatta in casa è costruita con materiali facilmente reperibili, riducendo significativamente il costo dell'installazione. Questi modelli in vitro multicellulari rappresentano meglio una complessa anatomia in vivo della regione di impianto. In futuro, il nostro laboratorio introdurrà altri tipi di cellule in questo modello in vitro multicellulare a semina mista e indagherà maggiormente sia sugli studi di impianto che sulla funzione uterina nella patogenesi di malattie come la lesione endometriale e l'aderenza intrauterina.
Per iniziare, procurati l'impalcatura stampata in 3D per la costruzione del modello. Per la coltura cellulare, posizionare un vetrino coprioggetti quadrato pulito e sterile da 18 millimetri sul fondo di una piastra a 12 pozzetti. Rivestire il vetrino coprioggetti con 200 microlitri di matrice extracellulare a una concentrazione compresa tra 200 e 300 microgrammi per millilitro.
Mantieni la piastra a 37 gradi Celsius per un'ora. Quindi rimuovere la matrice extracellulare dalla piastra. Successivamente, ispezionare le cellule staminali embrionali umane precedentemente coltivate e le cellule di Ishikawa al microscopio per confermare la confluenza appropriata.
Quindi rimuovere il terreno esaurito dai pozzetti e lavare le celle due volte con tre millilitri di PBS. Ora incubare le cellule con due millilitri di enzima di dissociazione a 37 gradi Celsius per due minuti per staccarle. Neutralizzare la reazione utilizzando un terreno di coltura completo.
Quindi creare una sospensione a cellula singola pipettando su e giù. Mescolare ora 100 microlitri di sospensione cellulare con il blu di tripano, mantenendo un fattore di diluizione pari a due. Quindi far scorrere il vetrino coprioggetti sulla camera dell'emocitometro.
Riempire entrambe le camere laterali con la sospensione cellulare mescolata con blu di tripano. Conta il numero di cellule in quadrati su entrambi i lati con un microscopio 20X e calcola la densità delle cellule in base ai conteggi. Ora semina le cellule staminali embrionali umane a una concentrazione di 10 alla potenza di cinque cellule per millilitro nella piastra preparata contenente terreno fresco e incuba a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per 24 ore.
Per la linea cellulare di Ishikawa, seminare le cellule nel pozzetto senza vetrino coprioggetti il giorno successivo. Immergere accuratamente le impalcature con alcol etilico e acqua distillata due volte per due giorni. Dopo l'ammollo, rimuovere l'acqua distillata e sigillare la lattina di metallo.
Quindi sterilizzare gli scaffold utilizzando un'autoclave a 121 gradi Celsius. Dopodiché, lasciali asciugare. Aggiungere circa due millilitri di terreno complementare al pozzetto con le celle di Ishikawa.
Trasferire il vetrino coprioggetti con le cellule staminali embrionali umane attaccate sull'impalcatura, posizionando la cellula con il lato rivolto verso il basso. Collegare l'impalcatura al pozzo contenente le celle di Ishikawa. Per la seconda configurazione, posizionare il vetrino coprioggetti con le cellule di Ishikawa sull'impalcatura e inserirlo nel pozzetto contenente le cellule staminali embrionali.
Incubare i sistemi di co-coltura a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Rimuovere con cura il terreno di coltura dai pozzetti e sciacquare delicatamente le cellule con PBS sterile. Utilizzando una pinza fine o una pinzetta, rimuovere i vetrini coprioggetti con le cellule attaccate dalle piastre di coltura.
Facoltativamente, posizionare i vetrini coprioggetti in un nuovo piatto con PBS per mantenerli idratati durante il processo di trasferimento. Aggiungere una goccia di PBS su un vetrino da microscopio pulito e trasferire delicatamente il vetrino coprioggetti contenente le cellule sulla goccia, assicurandosi che le cellule siano rivolte verso il basso sul vetrino. Posizionare il vetrino preparato sul tavolino di un microscopio invertito.
Selezionare l'obiettivo appropriato e utilizzare le manopole di messa a fuoco grossolana e fine per regolare la messa a fuoco. Imposta i parametri del microscopio, tra cui l'intensità dell'illuminazione e le impostazioni della fotocamera. Utilizzare il software del microscopio per acquisire immagini con gli ingrandimenti e i campi visivi desiderati.
La densità di entrambi i tipi di cellule è rimasta bassa nella condizione di co-coltura dopo 72 ore, mentre le densità cellulari coltivate in modo indipendente sono aumentate in modo significativo. La lunghezza delle cellule staminali embrionali umane co-coltivate era più breve di quelle coltivate in modo indipendente.
