Questi metodi possono fornire informazioni meccaniche sulla citotossicità delle cellule tumorali mediate dalle cellule immunitarie e sul comportamento invasivo in un ambiente 3D. Il principale vantaggio di questa tecnica è che questo modello di co-coltura 3D sferoide non richiede il trasferimento di sferoidi per più saggi successivi. A dimostrare questa procedura sarà Apsra Nasir, dottoranda del nostro dipartimento.
Per generare gli sferoidi usando la tecnica aseptica in una cappa di coltura cellulare aggiungere 500 microlitri di agarosio fuso in uno stampo in gomma da 81 microwell facendo attenzione ad evitare bolle. Quando l'agarosio si è solidificato flettere con cura lo stampo di gomma per far uscire i getti di agarosio in singoli pozzi di una piastra di 12 pozza. Per equilibrare le calchi aggiungere 2,5 millilitri di mezzo di coltura cellulare integrato con siero bovino fetale al 10% in ogni pozzo e posizionare la piastra in un incubatore di coltura cellulare per un'ora.
Alla fine dell'incubazione inclinare la piastra per rimuovere il mezzo di coltura cellulare nel primo circostante, quindi nella camera di semina e seminare con cura 190 microlitri della sospensione delle cellule preparate a tumorale dropwise in ogni camera di semina cellulare. Dopo 15 minuti di incubazione nell'incubatore di coltura cellulare aggiungere a 2,5 millilitri di mezzo all'esterno del cast e riportare la piastra all'incubatrice per 48 ore. Per impostare una co-coltura di cellule T ha rimostrato il numero appropriato di cellule T in 190 microlitri di coltura inappropriata di cellule T, mezzo per pozzo fino alla piastra di 12 pozzi per consentire la rimozione del mezzo di coltura cellulare che circonda per primo il cast di agarosio.
Quindi nella camera di semina, senza rimuovere gli sferoidi utilizzare un microscopio leggero per verificare se alcuni sferoidi sono stati aspirati e tenendo la pipetta caricata P200 circa mezzo centimetro sopra ogni getto semendo attentamente le cellule T sui calchi in modo dropwise senza slogare gli sferoidi. Quando tutti i calchi sono stati seminati, la piastra è stata accuratamente restituita all'incubatrice di coltura cellulare per 15 minuti prima di aggiungere un mezzo di coltura cellulare fresco integrato con siero bovino fetale all'esterno di ogni colata per un'altra incubazione di 48 ore. Per incorporare le co-colture 3D nel collagene diluito di tipo uno collagene con mezzo base privo di siero a una concentrazione di lavoro finale di tre milligrammi per millilitro e aggiungere 11 microlitri di PBS 10X, aggiungere 1,2 microlitri di un idrossido di sodio molare per 100 microlitri di collagene.
Dopo aver neutralizzato la soluzione di collagene sul ghiaccio per un'ora, rimuovere il mezzo di coltura cellulare circostante e all'interno di ogni colata come dimostrato. Aggiungere con cura il collagene neutralizzato una miscela ad ogni colata in modo dropwise e restituire immediatamente la piastra all'incubatore di coltura cellulare per cinque minuti prima di invertire la piastra per un'ora aggiuntiva nell'incubazione. Alla fine dell'incubazione posizionare il lato destro della piastra verso l'alto nella cappa di biosicurezza e aggiungere lentamente un mezzo di coltura cellulare fresco lungo il lato di ogni pozzo.
Quindi riportare la piastra all'incubatore di coltura cellulare per 48 ore. Per la colorazione immunofluorescente delle co-colture 3D incorporate fissare ogni intero cast di agarosio compresi gli sferoidi in formalina al 5,4% durante la notte a temperatura ambiente in una camera umidificata. Il giorno successivo, rimuovere la formalina che circonda il cast di agarosio e utilizzare un'elegante pinzetta a punta per afferrare l'angolo di ogni matrice di collagene per consentire ai calchi di essere sbucciati dalle camere di semina in un unico movimento fluido.
Posizionare ogni cerotto di collagene in un unico pozzo di uno scivolo a camera di otto pozza e aggiungere 250 microlitri dello 0,5% di ottossinolo tutti ad ogni pozzo. Dopo un'ora a temperatura ambiente sostituire l'ottossinolo con 250 microlitri di soluzione di blocco. Dopo un'ora a temperatura ambiente aggiungere a ciascun pozzo 250 microlitri del cocktail di anticorpi primari di interesse e posizionare uno scivolo in una camera umidificata scura durante la notte a temperatura ambiente.
La mattina successiva rimuovere l'anticorpo primario da ogni pozzo e lavare i pozzi tre volte con 300 microlitri di tampone IF per cinque minuti a temperatura ambiente per lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere a ciascun pozzo 250 microlitri di soluzione anticorpale secondaria inappropriata per un'incubazione di un'ora a temperatura ambiente protetta dalla luce. Al termine dell'incubazione rimuovere l'anticorpo e lavare ogni campione tre volte con tampone IF come dimostrato.
Dopo l'ultimo lavaggio sciacquare i campioni con 300 microlitri di PBS per pozzo e rimuovere con cura le pareti dello scivolo della camera. In modo che rimanga solo lo scivolo di vetro nella parte inferiore. Aggiungere 200 microlitri di mezzo di montaggio allo scivolo di vetro e far cadere con cura il coperchio scivolare sul campione senza creare bolle, quindi conservare i campioni montati in un luogo buio e asciutto durante la notte prima dell'imaging mediante microscopia a fluorescenza confocale Qui è possibile osservare configurazioni sperimentali tipiche per i test e producono campioni rappresentativi e aalizzabili alla fine dell'esperimento per ogni protocollo.
Incorporare la coltura 3D nel collagene di tipo uno all'interno dei micro pozzi di un cast di agarosio consente il monitoraggio e l'analisi dell'invasione per immagine J.In questa analisi di due linee cellulari primarie murine, del cancro al pancreas, sono state osservate diverse forme sferoidi e comportamenti invasivi. La prima linea cellulare dimostrò una formazione sferoide più compatta e un'invasione appuntita simile a quella osservata per le invasioni di singole cellule. Mentre la seconda linea cellulare formava sferoidi più sciolti e dimostrava un modello di invasione collettiva.
La co-coltura può essere eseguita con due diverse linee cellulari clonali tumorali sementi contemporaneamente o con cellule tumorali e T sulla formazione di sferoidi tumorali o successive valutazioni di interazione tumorale delle cellule T. Per una valutazione dettagliata del comportamento invasivo, la colorazione immunofluorescente e l'imaging focale possono essere eseguite in modo ad alta produttività. Il cast di agarosio consente l'incorporamento dell'intero sistema di coltura 3D in paraffina per il sessamento seriale e la colorazione immunoistochimica per quantificare la relazione spaziale tra tumore e cellule T.
Ad esempio, l'infiltrazione di cellule T può essere identificata e caratterizzata dalla colorazione del marcatore della superficie cellulare. Questa tecnica consente l'analisi di campioni di pazienti e l'uso di farmaci stimolanti e bloccanti per sondare le interazioni delle cellule T delle cellule tumorali.
