Questo protocollo fornisce impostazioni sperimentali per eseguire co-colture 2D e 3D controllabili in micro-dispositivi per visualizzare e monitorare le diafonie tumore-cellule immunitarie e analizzare gli effetti dei trattamenti anti-cancro. Questa tecnologia fornisce una visualizzazione semplice e in tempo reale del reclutamento e delle interazioni delle cellule immunitarie e può essere impiegata per campioni umani e derivati dal paziente. È compatibile con la maggior parte delle microscopie all'avanguardia.
A dimostrare la procedura saranno Francesco Noto, dottorando presso il Dipartimento di Oncologia e Medicina Molecolare dell'Istituto Superiore di Sanita, e Nicoleta Manduca ed Esther Maccafeo, dottorande dell'Università Cattolica del Sacro Cuore, Dipartimento di Medicina e Chirurgia Traslazionale. I trucioli sono precedentemente attivati al plasma in un pulitore al plasma o in una macchina reattiva per l'incisione del ferro in camera bianca. Le cellule della milza murina-milza e una linea cellulare tumorale sono utilizzate qui per imitare i protocolli descritti nel testo.
Prima di caricare le sospensioni delle celle, prelevare il fluido da tutti e sei i serbatoi. Quindi caricare lentamente 1 x 10 alle cellule tumorali 5th risospese in 10-50 microlitri di terreno di crescita nel serbatoio superiore sinistro e nel pozzo inferiore. Sul lato destro, pipettare delicatamente 1 x 10 alle 6 cellule immunitarie galleggianti risospese in 50 microlitri di terreno di crescita in due pozzetti.
Quando tutte le cellule sono state aggiunte, riempire tutti e sei i serbatoi di ciascun chip con un massimo di 100-150 microlitri di terreno di coltura e controllare che le cellule siano state distribuite correttamente all'interno di ciascun compartimento di coltura. Incubare il chip per un'ora per consentire al sistema di stabilizzarsi prima della registrazione time-lapse. Per l'imaging delle cellule vive, montare il tumore immune sulla piastra del chip sullo stadio del microscopio.
Personalizzare l'impostazione del flusso di lavoro di acquisizione nell'interfaccia del software del microscopio come il software di analisi delle cellule vive Incucyte. Selezionare le finestre di osservazione, il frame rate ottimale e la durata temporale, a seconda dei parametri appropriati per l'esperimento e dei tipi di cellule in studio. Immagine delle celle per il periodo di tempo sperimentale appropriato.
Preparare due aliquote di matrigel diluite con terreno contenente un farmaco o una combinazione di farmaci per le due condizioni sperimentali utilizzando punte fredde. Pipettare delicatamente cellule tumorali colorate con coloranti fluorescenti compatibili con vivo sospese in soluzione di matrice su ghiaccio per ottenere una distribuzione omogenea delle cellule. Con la piastra del chip su un blocco di raffreddamento o su un cestello con ghiaccio, iniettare lentamente la soluzione di matrice di cellule tumorali trattata con farmaco nelle porte del gel sinistro e destro utilizzando punte di micropipette fredde da 10 microlitri.
Applicare una leggera pressione per spingere la soluzione della matrice da un lato all'altro del canale. Quando tutte le cellule tumorali sono state caricate, posizionare il dispositivo nell'incubatore in posizione verticale per 30 minuti. Al termine dell'incubazione, una volta completata la gelificazione della matrice, riempire i canali medi di tutti e sei i serbatoi con 50 microlitri di terreno di coltura.
Controllare l'integrità del gel polimerizzato e la distribuzione delle cellule tumorali al microscopio. Quindi posizionare i chip in un'incubatrice fino al completamento della preparazione delle cellule immunitarie. Dopo l'incubazione, aspirare il mezzo da ciascun pozzetto.
Posizionare la punta vicino all'ingresso del canale medio e utilizzare una pressione moderata per iniettare delicatamente 10 microlitri di 10 alle 6 cellule immunitarie etichettate con un colorante fluorescente a contrasto. Iniettare da 50 a 100 microlitri del mezzo in ciascuno dei quattro pozzetti dei canali laterali, da 40 a 90 microlitri del mezzo nel pozzo centrale superiore e da 50 a 100 microlitri del mezzo nel pozzo centrale inferiore. Quando tutti i pozzetti sono stati caricati, utilizzare un microscopio per confermare che la distribuzione delle cellule immunitarie è rimasta confinata alla camera centrale.
Quindi posizionare con attenzione il dispositivo su una superficie piana nell'incubatore di coltura cellulare fino all'imaging. Per calcolare l'estensione delle cellule immunitarie vive colorate con fluorescenza che si infiltrano nei compartimenti tumorali, visualizzare il dispositivo in specifici punti di interesse temporale mediante microscopia a fluorescenza e impostare i parametri appropriati della fotocamera nel software di imaging del microscopio, come Nikon NIS-Elements. Imposta anche i parametri per le cellule immunitarie marcate.
Il movimento dei leucociti attraverso ponti a microcanali opportunamente costruiti nella piattaforma microfluidica verso le loro cellule bersaglio può essere monitorato mediante microscopia video. In questa analisi di monitoraggio, le singole PBMC sono state sfidate con cellule tumorali morenti trattate con doxorubicina o trattate con PBS vive. I valori rilevanti della chemiotassi e i grafici di migrazione sono stati generati automaticamente e un diverso profilo migratorio per le cellule immunitarie è stato osservato quando co-caricato con cellule di cancro al seno esposte a doxorubicina o PBS.
Quando le PBMC si sono confrontate con cellule tumorali apoptotiche, hanno attraversato i microcanali verso le cellule morenti e morte, ma non hanno attraversato le cellule vive e non trattate. Una frazione di leucociti con densità crescente nell'arco di 24-48 ore ha mostrato contatti a lungo termine con cellule tumorali trattate con doxo. In questa analisi, è stato utilizzato un nuovo modello tumorale immunocompetente 3D per quantificare il reclutamento di cellule immunitarie in risposta a combinazioni anti-cancro di farmaci epigenetici.
Le PBMC marcate con colorante rosso sono state quindi distribuite in modo omogeneo nella camera fluidica centrale. La capacità delle due masse tumorali di attrarre le PBMC è stata quindi confrontata, con le PBMC reclutate in modo robusto in questo esperimento nel microcanale destro. Per il modello 3D, mescolare la soluzione con idrogel e cellule su ghiaccio, evitando bolle e pre-polimerizzazione.
Iniettarlo lentamente senza eccessiva pressione. Regolare le fasi di polimerizzazione in base alla matrice utilizzata. Possono essere implementati saggi di cellule vive/morte e profili di secrezione di citochine da surnatanti .
L'immunofluorescenza per l'imaging confocale può essere eseguita per classificare i sottotipi immunitari e per i marcatori di espressione di attivazione e maturazione dell'esaurimento.
