I nostri sforzi sono attualmente focalizzati su una migliore caratterizzazione della correlazione esistente tra cambiamenti epigenetici e ricablaggio metabolico, con l'obiettivo finale di identificare nuovi bersagli terapeutici epigenetici. Data la natura dinamica e reversibile della modificazione epigenetica, recentemente sono stati sviluppati diversi agenti epifarmacologici, che portano al miglioramento del trattamento del cancro e alla riduzione della chemioresistenza. Recentemente, sono stati compiuti progressi significativi nel campo della caratterizzazione delle istanze, grazie all'applicazione della moderna spettrometria di massa, abbinata alle tecniche di separazione, come la cromatografia liquida ad alta prestazione.
La sfida principale nella caratterizzazione degli istoni è l'esistenza di innumerevoli proteoforme istoniche, risultanti dal crosstalk tra enzimi modificati dinamici e disponibilità di metaboliti. Inizia preparando un mini gel TAU per un mini gel verticale di poliacrilammide, sistema di elettroforesi. Per fare ciò, sciogliere sei molari di urea in una soluzione di acrilammide al 15% di bis-acrilammide e un millilitro di acqua ultrapura sotto leggera agitazione a temperatura ambiente.
Quindi aggiungi gli altri componenti e regola il volume. Riempi le piastre di gel preimpostate con questa soluzione, assicurandoti che non si formino bolle d'aria e lasciando 1,5 centimetri dall'alto. Aggiungere un millilitro di isopropanolo sopra per livellare il gel.
Per preparare il gel da impilare sciogliere, sciogliere l'urea in un 6% di acrilammide, bis-acrilammide con un millilitro di acqua ultrapura. Dopo aver aggiunto gli altri componenti, riempire le piastre di gel con questa soluzione e inserire un pettine a 10 pozzetti tra le piastre fino a quando la soluzione non raggiunge la metà dei denti del pettine. Quindi sciogliere sei molari di urea, il 5% di acido acetico glaciale e doppia acqua distillata per preparare 100 microlitri di tampone per campioni TAU.
Quindi sciogliere il campione istone liofilizzato in 30 microlitri di tampone per campioni TAU. Riempire la mini cassetta con tampone di corsa TAU con una concentrazione finale del 5% di acido acetico. Utilizzare una siringa per sciacquare i pozzetti del gel con il tampone scorrevole e caricare il campione nei pozzetti con una micropipetta.
Collegare quindi la camera di elettroforesi all'alimentazione, posizionando l'elettrodo positivo nella parte inferiore. Di tanto in tanto, spegnere l'alimentazione e sciacquare i pozzetti del gel con una siringa per rimuovere le bolle dalla superficie inferiore del gel. Dopo aver rimosso il gel dalle piastre di gel, tagliare la corsia di interesse, utilizzando un bisturi pulito.
Ora lavare la corsia del gel con 15 millilitri di tris cloridrato 0,5 M, pH 8,8 per 15 minuti. Preparare 15 millilitri di tampone di equilibrazione uno e due, utilizzando i componenti mostrati qui. Quindi conservare il tampone di equilibrio due al buio.
Ora, incubare la corsia del gel in 10 millilitri di tampone di equilibrio uno con una leggera agitazione per 15 minuti, quindi decantare. Successivamente, incubare la corsia del gel in 10 millilitri di tampone di equilibrio due sotto leggera agitazione per 15 minuti al buio prima di decantarlo. Successivamente, prepara un gel risolutivo di acrilammide al 15%, utilizzando la composizione mostrata qui.
Prepara la piastra di gel e riempila con la soluzione di gel risolutiva, lasciando 1,5 centimetri dall'estremità della lunga piastra di gel. Aggiungere un millilitro di isopropanolo sopra per livellare il gel e lasciarlo polimerizzare. Una volta che il gel si è polimerizzato, decantare l'isopropanolo e asciugare il pozzetto, utilizzando carta per cromatografia di cellulosa da tre mm.
Inserire la corsia del gel tagliata nel pozzetto del gel risolutivo, utilizzando una pinzetta per evitare bolle d'aria, quindi sigillare la corsia del gel al gel risolutivo, utilizzando l'agarosio a basso punto di fusione allo 0,5% in tris glicina e tampone SDS, con cinque microlitri di blu bromofenolo allo 0,003%. Posizionare le piastre di gel nella cassetta e riempirle con tris glicina e tampone SDS. Far funzionare il gel a 120 volt fino a quando il colorante blu di bromofenolo raggiunge il fondo.
Dopo l'esecuzione, rimuovere delicatamente il gel dalle piastre ed eliminare l'agarosio in eccesso. Per iniziare, eseguire l'elettroforesi dell'acido tritonico con mini gel 2D o TAU su campioni istonici, seguita dalla colorazione con argento. Quindi preparare i reagenti mostrati qui.
Usando un bisturi pulito, asportare i punti istonici di interesse dal gel colorato e posizionare ogni punto in un tubo di silicone fresco da 1,5 millilitri per evitare la contaminazione incrociata delle isoforme. Aggiungere 250 microlitri di bicarbonato di ammonio da 50 millimolari o nitro acetone al 50% in ogni punto di gel e incubare con leggera agitazione in un termomiscelatore a temperatura ambiente. Decantare la soluzione e ripetere questo processo tre volte fino a quando i pezzi di gel non appaiono trasparenti.
Per disidratare le macchie di gel, aggiungere 200 microlitri di acetone nitrol. Durante questo passaggio, i pezzi di gel diventeranno di colore bianco opaco. Decantare l'acetone nitrile e lasciare asciugare le macchie di gel all'aria per 10 minuti.
I pezzi di gel appariranno asciutti nei tubi. Successivamente, reidrata le macchie di gel aggiungendo 20 microlitri di soluzione di tripsina o un volume sufficiente a coprire i pezzi di gel. Incubare le provette in un termomiscelatore a 37 gradi Celsius sotto leggera agitazione per almeno quattro ore e fino a 16 ore.
Trasferire il surnatante, contenente i peptidi del trittico, in una nuova provetta. Aggiungere 50 microlitri di soluzione di estrazione ai pezzi di gel e sonicare due volte in un bagno d'acqua a ultrasuoni per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire il surnatante, contenente i peptidi aggiuntivi del trittico, nella stessa provetta fresca.
Usa un liofilizzatore per essiccare i peptidi estratti a 30 gradi Celsius. Nel tubo si formerà un pellet liofilizzato. Ora, aggiungere 15 microlitri di acido trifluoroacetico allo 0,1% in ciascuna provetta e incubare delicatamente in un termomiscelatore a 25 gradi Celsius.
Trasferire il surnatante in una fiala per cromatografia liquida tandem, analisi con spettrometria di massa.
