Questo lavoro è stato sostenuto in parte da una ricerca di sostegno i fondi delle sovvenzioni (RSFG) da Indiana University-Purdue University, Indianapolis, e in parte da un premio dalla American Heart Association 14GRNT20390154, di ARK

1. Espressione batterica. Nota: plasmidi di espressione utilizzati in questo studio sono descritti nella Tabella 1. Soluzioni, media e tamponi utilizzati in questo studio sono descritti nella tabella 2. La clonazione di geni proteasoma subunità archeali e la generazione di plasmidi di espressione sono descritte altrove 18,20. In breve, i plasmidi per coexpression ricombinante di subunità impiegano una strategia operone bicistronico che aiuta a ottenere livelli di espressione comparabili di singole subunità 18,20. I parametri di espressione elencati di seguito sono stati empiricamente determinato per essere ottimale per le subunità del proteasoma in questo studio. Potrebbe essere necessario ottimizzare espressione per altri mutanti proteasoma, per proteasomi da altre specie archeali, o per altri complessi di proteine ​​ricombinanti (vedi la discussione). <ol><li> Trasforma plasmide di espressione di interesse in chimicamente competente E. coli BL21 (DE3) cellule. </li><li> Aggiungere 1 - 2 microlitri di plasmide (tipicamente 50 - 100 ng) ad una aliquota di cellule DE3 che sono stati appena scongelati su ghiaccio, e continuano ad incubare su ghiaccio per 20 min. </li><li> shock termico le cellule a 42 ° C per 45 s e tornare tubo di ghiaccio per 2 minuti aggiuntivi. </li><li> Aggiungere 1 ml di terreno LB e incubare a 37 ° C con agitazione (150 rpm) per 1 h. </li><li> Distribuire 100 - 200 ml di miscela trasformazione su LB-kan piastre (piastre contenenti mezzi LB solidi, integrati con kanamicina (tutti plasmidi utilizzati in questo studio di resistenza a questo antibiotico encode)). Incubare le piastre a 37 ° C O / N. </li><li> La mattina dopo, inoculare una singola colonia dalla piastra LB-kan in 3 ml di liquido mezzi LB-kan in un tubo di vetro cultura. Incubare a 37 ° C con agitazione (150 rpm) per circa 2,5 - 3 h, o fino a quando si osserva torbidità. </li><li> Misurare la densità ottica della coltura a 600 nm (OD 600) in uno spettrofotometro. Diluire il culto delle celluleure con una quantità appropriata di mezzi LB-kan preriscaldata ad una OD 600 di 0,4 in un volume finale di 6 mL. Riprendere agitazione a 37 ° C per 40 min. </li><li> Indurre l&#39;espressione della proteina nelle colture liquide aggiungendo IPTG da una soluzione madre ad una concentrazione finale di 1 mM. Incubare a 37 ° C con agitazione (150 rpm) per circa 6-7 ore. </li><li> Raccolto colture di cellule batteriche nella loro interezza in provette da 1,5 ml microcentrifuga. </li><li> Aggiungere 1,5 ml di una cultura in provetta. Centrifugare a 10.000 g per 1 min. </li><li> Eliminare il surnatante e aggiungere altri 1,5 ml di una stessa cultura al pellet. Centrifugare a 10.000 g per 1 min. </li><li> Ripetere il passaggio 1.11 fino a quando l&#39;intera coltura è raccolta nella provetta. </li><li> Conservare il pellet indotti a -80 ° C fino lisi. </li></ol> 2. batterica Lisi e lisato di miscelazione. Nota: </strong&gt; Per i campioni studiati tramite coexpression, seguire la sezione 2.1 (e le sue sottosezioni). Per i campioni che richiedono lisato di miscelazione, seguire la sezione 2.2 (e le sue sottosezioni). L&#39;analisi TSP (Total, solubile, pellet) che è incluso nel protocollo è utile per ottimizzare l&#39;espressione della proteina che può aiutare a garantire che circa la stessa quantità di alfa e beta subunità sono unite durante lisato di miscelazione (vedi la discussione). Fornisce inoltre un controllo importante, se non sono come previsto risultati a valle (cioè verifica che la proteina era espresso e solubile). Così, si consiglia vivamente compresa l&#39;analisi TSP inizialmente. Una volta che un protocollo ottimale è stato raggiunto per una particolare combinazione subunità, analisi TSP non è richiesto rigorosamente è per questo che è descritto come optional di seguito. <ol><li> Lisi delle cellule batteriche e la preparazione di frazioni solubili. <ol><li> Scongelare il pellet cellulare indotta in ghiaccio per 5 min. Risospendere il pellet in 600 ml di tampone di lisi. </li><li> IncUbate la sospensione a 30 ° C con agitazione (150 rpm) per 30 min per generare lisato grezzo totale. Nota: Il passo successivo e la sottosezione che segue sono opzionali. </li><li> Rimuovere due aliquote 25 microlitri dal lisato grezzo totale in provette da microcentrifuga da 1,5 ml separati ed effettuare analisi TSP come segue. <ol><li> Per una delle due aliquote 25 microlitri, aggiungere tampone campione SDS 5X ad una concentrazione finale di 1X. Etichettare la provetta con &quot;T&quot; per &quot;lisato grezzo totale&quot;. </li><li> Incubare il campione &quot;T&quot; a 100 ° C per 5 minuti per denaturare le proteine ​​completamente. </li><li> Nel frattempo, prendere la seconda aliquota 25 microlitri e centrifugare è a 10.000 g per 10 min. rimuovere con attenzione il surnatante senza disturbare la piccola pallina, e trasferirlo ad un nuovo 1,5 ml provetta. Etichettare questo nuovo tubo &quot;S&quot; per &quot;frazione solubile&quot;. </li><li> Per i behi piccola pallina di sinistraND nel passaggio precedente, aggiungere 25 ml di tampone di lisi e vortex per risospendere. Etichettare questo tubo &quot;P&quot; per &quot;frazione pellet&quot;. </li><li> Aggiungere 6 tampone campione ml di 5X SDS ai tubi e &quot;S&quot; &quot;P&quot; e incubare a 100 ° C, come descritto sopra. Nota: se non saranno utilizzati i campioni TSP quel giorno per analizzare l&#39;espressione, possono essere congelati a -20 ° C fino al momento dell&#39;uso. Una volta scongelate, devono essere reincubate a 100 ° C, come descritto sopra, immediatamente prima di essere caricati su un gel SDS-PAGE standard di 12% e / o del 15%. </li></ol></li><li> Mentre l&#39;analisi TSP viene effettuata, centrifugare il restante 550 ml di lisato grezzo totale (o l&#39;intero 600 ml di lisato grezzo totale se l&#39;analisi TSP non viene effettuata) a 10.000 g per 10 min. Raccogliere il surnatante in una fresca 1,5 ml provetta. Questo è il lisato solubile che verrà utilizzato per la purificazione. </li></ol></li><li> Lisato miscelazione. <ol><li> Effettuare lisi come descritto ai punti 2.1.1 e 2.1.2 di cui sopra. </li><li> Mescolare 600 ml di lisato grezzo totale dai batteri che esprimono la subunità α desiderato con 600 ml di lisato grezzo totale dai batteri che esprimono la subunità β desiderato. Incubare a 37 ° C con lenta agitazione per 30 min. Nota: Potrebbe essere necessario ottimizzare il tempo di incubazione per ottenere il massimo assemblaggio durante lisato di miscelazione (vedi la discussione). Il tempo e la temperatura qui presentati sono ottimali per le proteine ricombinanti in questo studio e sono stati determinati altrove 18. </li><li> Centrifugare il lisato mista a 10.000 g per 10 minuti per separare materiale solubile da pellet insolubili. Trasferire il surnatante in un nuovo 1,5 ml provetta. Utilizzare questo lisato solubile mista per la purificazione della proteina. </li></ol></li></ol> 3. purificazione della proteina tramite Immobilized Cobalt Affinity Resina(ICAR). <ol><li> Equilibrare la resina. <ol><li> Accuratamente risospendere la resina capovolgendo il flacone e trasferire 50 ml di liquame di una provetta da microcentrifuga da 1,5. Centrifugare a 700 g per 2 minuti per resina pellet. Con attenzione aspirare il surnatante. Nota: Effettuiamo aspirazione pipetta utilizzando una punta blu 1 ml pipetta per rimuovere la massa del liquido. Un bianco tip 2 microlitri viene utilizzato per la regolazione fine della rimozione del surnatante rimanente, lasciando uno strato molto sottile di liquido che copre le perline. </li><li> Aggiungere 1 ml di tampone A. Mescolare delicatamente per risospendere resina e centrifugare a 700 g per 2 minuti per far sedimentare resina. Con attenzione aspirare il surnatante e ripetere questo passaggio di lavaggio ancora una volta. </li></ol></li><li> Applicare lisato solubile ottenuto in precedenza nella sezione 2.1 o 2.2 alla resina equilibrata. Incubare la provetta con rotazione dolce a 4 ° C per 60 min. Centrifugare la provetta a 700 × g &lt;/ Em&gt; per 5 minuti e con attenzione aspirare il surnatante. </li><li> Lavare la resina come segue per rimuovere le proteine ​​non specifico legato. <ol><li> resina risospendere con 1 ml di tampone A e incubare con dolce dondolio a 4 ° C per 10 min. Centrifugare la provetta a 700 g per 5 minuti ed aspirare accuratamente il surnatante. Ripetere questa fase di lavaggio ancora una volta. </li><li> resina risospendere con 1 ml di tampone B (tampone A con 5 mM imidazolo) e incubare con dolce dondolio a 4 ° C per 5 min. Centrifugare la provetta a 700 g per 5 minuti ed aspirare accuratamente il surnatante. Ripetere questa fase di lavaggio ancora una volta. </li><li> resina risospendere con 1 ml di tampone C (tampone A con 10 mM imidazolo) e incubare con dolce dondolio a 4 ° C per 5 min. Centrifugare la provetta a 700 g per 5 minuti ed aspirare accuratamente il surnatante. </li></ol></li><li> Eluire la proteina con l&#39;aggiunta di 400 ml di tampone E (tampone A con 200 mm imidazolo) to la resina. Incubare con dolce dondolio a 4 ° C per 5 min. Centrifugare a 700 g per 5 min. </li><li> Trasferire il surnatante contenente proteina purificata in un 1,5 mL provetta da centrifuga. </li><li> Dissalare la proteina purificata mediante centrifugazione seriale come segue. <ol><li> Per 400 ml di proteina purificata, aggiungere 100 microlitri tampone A (questo riduce la concentrazione Imidazole da 200 mm a 160 mm). Applicare proteina purificata a 0,5 ml filtri ultracentrifugo con un 10 peso molecolare kDa cut-off. Centrifugare a 14.000 g per 5 min. </li><li> Eliminare il filtrato e aggiungere 400 microlitri tampone A per diluire il retentato e centrifugare di nuovo. Continuare i cicli di centrifugazione / diluizione fino concentrazione imidazolo scende al di sotto di 4 mm. Ad esempio, se ogni centrifugazione concentra 500 microlitri fino a ~ 70 microlitri (o circa 7 volte), poi due cicli ridurrà l&#39;avvio 160 mM imidazolo concentrazione (7 x 7 = 49 volte) per approximately 3,3 mm. </li><li> Misurare la concentrazione di proteine del campione dissalato utilizzando il saggio BCA 21. Nota: Dissalazione è necessaria per ridurre i livelli imidazolici di sotto del limite di tolleranza per il saggio BCA, come descritto nelle istruzioni del produttore. Il nostro laboratorio preferisce il saggio BCA perché è sensibile, ha un ampio range dinamico, e presenta molto meno variazione proteina-to-proteine. Tuttavia, altri metodi per determinare la concentrazione di proteine ​​possono essere sostituiti per il saggio BCA. La chiave è essere consapevoli dei vantaggi e dei limiti di ciascun metodo. </li></ol></li><li> Aggiungere 5X tampone campione nativo ad una concentrazione finale di 1X e procedere ad elettroforesi. In alternativa, conservare i campioni a -20 ° C per una successiva analisi. </li></ol> 4. nondenaturing SDS-PAGE (PAG). Attenzione: secondo le normative vigenti acrilamide è una neurotossina. Indossare adeguata protezione gear. <ol><li> Preparare il gel PAGE nondenaturing come segue. <ol><li> Preparare la cassetta del gel per la fusione con lastre di vetro puliti e la colata stand. Mettere produttore di pendenza sulla cima di un piccolo agitatore magnetico e posizionare una piccola ancoretta in ciascuna camera. </li><li> Utilizzando 40% (w / v) acrilammide e 2% (w / v) soluzioni stock bisacrylamide, preparano 5% e il 10% (w / v) soluzioni gel di acrilammide in un buffer risoluzione nativa. Assicurarsi che il rapporto di acrilamide totale bisacrylamide è 37,5: 1. Freddo sul ghiaccio prima di versare. Nota: Il sistema nondenaturing PAGE usato qui è sostanzialmente identico al sistema SDS-PAGE Laemmli, con SDS omessa 22. </li><li> Aggiungere persolfato di ammonio (da 10% (w / v) soluzione madre preparata in acqua) alle soluzioni di acrilammide per iniziare la polimerizzazione. concentrazione finale di ammonio persolfato è 0,1% (w / v). </li><li> Versare le soluzioni di acrilamide nelle due camere del creatore di gradiente. Con il tubo di uscita b inseritara le piastre della cassetta gel, attivare l&#39;agitatore magnetico e si aprono le valvole gradiente creatore. Versare il 5 - gel non denaturante pendenza del 10%. </li><li> Una volta versato, sovrapporre il gel con un sottile strato di isopropanolo e consentire il gel polimerizzare per 30 min. Durante questo tempo, preparare la soluzione di gel di acrilammide fresco 5% in tampone risoluzione nativa. Dopo i set di gel, travasare isopropanolo e sciacquare la parte superiore del gel con acqua deionizzata da una spruzzetta. </li><li> Per la soluzione di gel 5% preparata sopra, aggiungere ammonio persolfato (esattamente come descritto in 4.1.3) e versare sulla superficie del gel polimerizzato fino lastre di vetro sono pieni. Inserto in gel pettine. Lasciare il gel sovrapposto polimerizzare per altri 30 min. </li><li> Una volta che il gel è polimerizzato, assemblare cassette gel in apparato di elettroforesi. In alternativa, conservare il gel a 4 ° C, avvolti in tovaglioli di carta inumidito e l&#39;involucro di plastica fino al momento dell&#39;uso. </li></ol></li><li> Una volta nondenaturing gel PAGE è assemblato in eletApparecchio trophoresis, riempire il serbatoio con 1X tampone esecuzione nativa preparato fresco da un buffer in esecuzione nativa 10X magazzino. </li><li> Carico 10 ug di proteina purificata, ottenuto alla fine della sezione 3, in ogni pozzetto usando una siringa di vetro. </li><li> Carico 2 ml di alto livello peso molecolare nativa delle proteine ​​(diluito in 1X buffer di esecuzione nativa) in uno dei pozzi. </li><li> Eseguire gel a 55 V e 4 ° C fino a quando il fronte del colorante scappa il gel (circa 4-4,5 ore). </li><li> In aggiunta al gel non denaturante, analizzare aliquote della proteina purificata dalla norma SDS-PAGE 22. <ol><li> Mescolare aliquote (10 ug) dei campioni di proteine ​​purificate, ottenuti alla fine della sezione 3, con tampone 5X SDS-campione ad una concentrazione finale di 1X. </li><li> Incubare a 100 ° C per 5 minuti e caricare su standard di 12% e / o del 15% gel SDS-PAGE 22. </li><li> Eseguito a 80V per 20 minuti e poi a 120 V fino a quando il fronte del colorante corre il gel (questo è approssimativamente un addtransi- 75 min per un gel al 12%, e 120 min per un gel 15%). </li></ol></li></ol> 5. Visualizing attività e proteine ​​di colorazione. <ol><li> Dopo elettroforesi, lastre di vetro accuratamente separati e trasferire il gel non denaturante ad un vassoio gel contenente 50 mL di acqua deionizzata. Risciacquare gel con dolce dondolio per 5 min. Eliminare l&#39;acqua e ripetere l&#39;operazione di lavaggio per tre volte. </li><li> Eseguire test overlay substrato come segue. <ol><li> Aggiungere 1 mL di sviluppare tampone contenente il peptide substrato fluorogenico Suc-LLVY-AMC e diffondere uniformemente su gel. Incubare a 37 ° C per 30 min. Nota: Una bacchetta di vetro o un releaser gel (piccolo cuneo di plastica usata per lastre di vetro separate) possono essere utilizzati per diffondere il liquido sul gel. </li><li> Trasferire accuratamente il gel sul transilluminatore UV del gel sistema di imaging e osservare la fluorescenza a causa del substrato peptidico spaccati. immagine Record. trasferire accuratamente l&#39;ba gelck al vassoio gel. </li><li> Lavare il gel due volte con 50 ml di acqua deionizzata per 5 minuti con dolce dondolio. </li><li> Colorare il gel con 10 ml di una colloidale reattivo Coomassie macchia per 60 minuti con il dolce dondolio. Gel Decolorare con 50 ml di acqua fino a sfondo diventa chiara. Questa fase di colorazione applica ai gel SDS-PAGE standard così. </li></ol></li></ol>

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R., Wong, P., Emili, A., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-Subunit+appendages+promote+20S+proteasome+assembly+by+overcoming+an+Ump1-dependent+checkpoint.">beta-Subunit appendages promote 20S proteasome assembly by overcoming an Ump1-dependent checkpoint.</a> EMBO J. 26, 2339-2349 (2007).</li><li>Kusmierczyk, A. R., Kunjappu, M. J., Funakoshi, M., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multimeric+assembly+factor+controls+the+formation+of+alternative+20S+proteasomes.">A multimeric assembly factor controls the formation of alternative 20S proteasomes.</a> Nat Struct Mol Biol. 15, 237-244 (2008).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Dimostriamo il vantaggio di un approccio combinato di analizzare il montaggio proteasoma da nondenaturing pagina utilizzando proteasomi archeali ricombinanti. Il metodo usuale 9,11 di coexpression batterica subunità del proteasoma permette una rapida analisi, ma non può rivelare intermedi chiave di montaggio. Vi proponiamo la combinazione coexpression con lisato di miscelazione per sviluppare un quadro più ampio di eventi di assemblaggio. Il vantaggio di questo approccio combin...

Complessi multiproteici svolgono numerose attività cellulari critiche 1. Per molti di questi complessi, molto di più si sa sulla loro struttura e la funzione di circa il loro montaggio 2,3. Il proteasoma è un tale complesso e si trova in tutti i campi della vita. In eucarioti, questa macchina molecolare è alla base del sistema Proteasome / ubiquitina (UPS) e fornisce la principale via di degradazione delle proteine intracellulari 4. Il proteasoma eucarioti (indicato come il proteasoma 26S) è composto da due grandi gruppi di sub: un proteasoma 20S, o Core Particle (CP) 5, che può essere limitato a una o entrambe le estremità da una particella regolamentazione 19S (RP) 6. Il proteasoma 20S è un grande proteasi compartimenti stagni. La sua struttura quaternaria è assolutamente conservata in tutti i domini della vita e consiste in una pila di quattro anelli di sette membri contenente due tipi di subunità strutturalmente correlati, α; e ß 5,7,8. Negli eucarioti, i due anelli esterni sono ciascuna costituite da sette subunità alfa distinti e due anelli interni sono ciascuna costituite da sette subunità beta distinti; attività proteolitica risiede entro tre delle subunità beta. Per contro, gli anelli di CP archaea e batteri sono generalmente costituiti da un solo tipo di α e un tipo di subunità β. Proteasomi archaeal hanno fornito un sistema importante modello per lo studio di montaggio proteasoma sia per la loro semplicità compositiva e la loro condivisione di un meccanismo di montaggio comune con le loro controparti eucariotiche 9-13. In breve, subunità alfa assemblano in anelli alfa prima, che servono da impalcatura su cui beta subunità assemblare. I risultanti mezze proteasomi (α β 7 7) dimerizzano, dando luogo ad assemblare completamente CP (α β 7 7 β α 7 7). Durante dimerizzazione, i propeptidi presenti su subunità betasono autocatalytically rimossi, esponendo i catalitici threonines N-terminale. L&#39;uso dei proteasomi archeali per modellare il montaggio prende frequentemente vantaggio della produzione di proteine ricombinanti proteasoma archeali in Escherichia coli. Questo è un approccio interessante perché consente subunità essere prodotte in varie combinazioni, sia come WT e versioni mutanti, in un organismo ospite che non produce i propri proteasomi. Monitorare l&#39;assemblaggio di complessi multi-proteina richiede biochimicamente un qualche tipo di metodo di frazionamento che separa i complessi completamente assemblati da intermedi di assemblaggio e precursori. Grazie alla sua capacità di risoluzione superiore, nondenaturing SDS-PAGE (PAGINA) ha dimostrato di essere particolarmente utile nel frazionamento di varie grandi complessi multiproteici 14-17. La combinazione di produzione proteasoma archaeal ricombinante e PAGE nondenaturing è diventato un approccio potente dissecting assemblaggio proteasoma 9,11,12,18. Tuttavia, il metodo usuale con cui questo approccio viene applicato (es. Tramite la coespressione ricombinante di alfa e beta subunità) ha un importante inconveniente. Le reazioni di montaggio sono cooperativa e fortemente dipendente dalla concentrazione 3. Dato che la concentrazione di proteine all&#39;interno delle cellule è molto alta 19, a causa di effetti di volume escluso, reazioni di assemblaggio siano effettuati rapidamente in vivo. Quindi è possibile perdere importanti intermedi di montaggio quando alfa e beta subunità sono coexpressed. Qui, sosteniamo un approccio combinato nello studio di assemblaggio proteasoma usando ricombinanti subunità del proteasoma archeali. In questo approccio, entrambi i metodi di miscelazione coespressione e lisato sono impiegati. Il primo permette per l&#39;analisi rapida di assemblaggio, perché coexpression è meno laborioso. Quest&#39;ultimo dipende espressione separata di alfa e beta subunità, seguita da miscelazione. Anche se questo requires un po &#39;più sforzo che coexpression, è più che compensata dalla capacità di individuare prodotti intermedi che sono mancati durante coexpression. Insieme, questi due metodi in grado di fornire un quadro più completo di montaggio proteasoma.

<table><tbody><tr><td>Acrylamide (40%) solution</td><td>Biorad</td><td>1610104</td><td>Unpolymerized acrylamide is a neurotoxin. Wear proper protective gear</td></tr><tr><td>Amicon ultra 0.5 mL centrifugal filters</td><td>EMDMillipore</td><td>UFC501024</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Persulfate</td><td>Sigma</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>BCA assay kit</td><td>Pierce</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Bisacrylamide (2%) solution</td><td>Biorad</td><td>1610142</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol blue</td><td>Sigma</td><td>B8026</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Sigma</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP172</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; BL21 competent cells</td><td>EMD Millipore</td><td>69450</td><td></td></tr><tr><td>GelCode Blue</td><td>Thermo Fisher</td><td>24592</td><td>Colloidal coomassie stain reagent for gels</td></tr><tr><td>Gel doc EZ system</td><td>Biorad</td><td>1708270</td><td>Gel documentation system</td></tr><tr><td>Gel releasers</td><td>Biorad</td><td>1653320</td><td>Wedge shaped plastic used to separate gel plates; useful for spreading liquid.</td></tr><tr><td>Glass rod</td><td>Thermo Fisher</td><td>11-380B</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>49767</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP3865</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton syringe</td><td>Thermo Fisher</td><td>14-813-38</td><td>Glass syringe for loading gels</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>US Biologicals</td><td>H2010</td><td></td></tr><tr><td>HMW Native calibration kit</td><td>GE Healthcare</td><td>170445-01</td><td>High molecular weight protein standards</td></tr><tr><td>Hoefer SG30</td><td>Thermo Fisher</td><td>03-500-277</td><td>Gradient maker</td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>US Biologicals</td><td>280671</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>US Biologicals</td><td>I8500</td><td>For induction of protein expression</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP26181</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin sulfate</td><td>US Biologicals</td><td>K0010</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Sigma</td><td>L6876</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fluka analytical</td><td>630680</td><td></td></tr><tr><td>Mini Protean Tetra Cell</td><td>Biorad</td><td>1658002EDU</td><td>Gel electrophoresis apparatus</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Thermo Fisher</td><td>S640-3</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Thermo Fisher</td><td>S318-1</td><td></td></tr><tr><td>Pefabloc SC</td><td>Roche</td><td>11429876001</td><td>Protease inhibitor</td></tr><tr><td>pET42</td><td>EMD Millipore</td><td>70562</td><td>Expression plasmid</td></tr><tr><td>Precision plus all blue standard</td><td>Biorad</td><td>1610373</td><td>Molecular protein standard for SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Quickchange mutagenesis kit</td><td>Agilent technologies</td><td>200521</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP166</td><td></td></tr><tr><td>Suc-LLVY-AMC</td><td>Enzo lifesciences</td><td>BML P802-0005</td><td>Fluorogenic substrate</td></tr><tr><td>Talon Metal Affinity Resin</td><td>Clontech</td><td>635502</td><td>Immobilized Cobalt Affinity Resin</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma</td><td>T7024</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>US Biologicals</td><td>T8600</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Sigma</td><td>93426</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Bacto BD</td><td>211699</td><td></td></tr><tr><td>UV sample tray</td><td>Biorad</td><td>1708271</td><td>For UV imaging of gels</td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Bacto BD</td><td>212720</td><td></td></tr></tbody></table>

examining proteasome assembly with recombinant archaeal proteasomes and nondenaturing page:  the case for a combined approach

Proteasomi si trovano in tutti i campi della vita. Essi forniscono la principale via di degradazione delle proteine ​​intracellulari negli eucarioti, anche se il loro montaggio non è completamente noto. Tutti i proteasomi contengono una particella strutturalmente conservato nucleo (CP), o 20S proteasoma, contenente due anelli subunità beta heptameric a sandwich tra due anelli α subunità heptameric. Archaeal 20S proteasomi sono compositivo semplice rispetto alle loro controparti eucariotiche, ma entrambi condividono un meccanismo di montaggio comune. Di conseguenza, archaeal 20S proteasomi continuano ad essere modelli importanti per il montaggio del proteasoma eucariotica. In particolare, l&#39;espressione ricombinante della 20S archeali proteasomi accoppiato con nondenaturing gel di poliacrilammide (PAGE) ha prodotto molti importanti intuizioni proteasoma biogenesi. Qui, si discute un mezzo per migliorare la solita strategia di coexpression di α proteasoma archeali e subunità beta prima nondenaturing PAGINA. Abbiamo dimostrato che, anche se rapido ed efficace, un approccio coexpression solo può mancare intermedi chiave di montaggio. Nel caso del proteasoma, coexpression potrebbe non consentire il rilevamento del semi-proteasoma, una contenente una α-anello completo intermedio e una β-anello completo. Tuttavia, questo intermedio è facilmente rilevata tramite lisato di miscelazione. Si suggerisce che la combinazione coexpression con lisato di miscelazione produce un approccio più completo per l&#39;analisi di assemblaggio, ma rimane non intensiva del lavoro. Questo approccio può essere utile per lo studio di altri complessi multiproteici ricombinanti.

Assemblaggio proteasoma (Figura 1) inizia quando subunità alfa si combinano per anelli di forma 9. Ciò può essere illustrato quando alfa subunità dalla archaeon Methanococcus maripaludis S2 sono espressi in E. coli come C-terminale hexahistidine tag (His-tag) derivati (Tabella 1). Quando la α-la proteina ricombinante è stata purificata dall&#39;ICAR e analizzata mediante nondenaturing PAGE, due bande sono state osservate (Figura 2A, co...

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Examining Proteasome Assembly with Recombinant Archaeal Proteasomes and Nondenaturing PAGE:  The Case for a Combined Approach

Questo protocollo utilizza sia coexpression subunità e postlysis subunità miscelazione per un esame più approfondito di assemblaggio proteasoma ricombinante.

Esaminando Assemblea Proteasome con ricombinante archeali proteasomi e nondenaturing PAGINA: il caso di un approccio combinato

Proteasomes are found in all domains of life. They provide the major route of intracellular protein degradation in eukaryotes, though their assembly is ...

examining-proteasome-assembly-with-recombinant-archaeal-proteasomes

Research

JoVE Journal

Biochemistry

6.6K Views.  Indiana University-Purdue University, Indianapolis (IUPUI).  Questo protocollo utilizza sia coexpression subunità e postlysis subunità miscelazione per un esame più approfondito di assemblaggio proteasoma ricombinante. 

Video: Examining Proteasome Assembly with Recombinant Archaeal Proteasomes and Nondenaturing PAGE:  The Case for a Combined Approach

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique applications for OMV where traditional nanoparticles are proving too difficult to synthesize. To date, all Gram-negative bacteria have been shown to produce OMV demonstrating packaging of a variety of cargo that includes small molecules, peptides, proteins and genetic material. Based on their diverse cargo, OMV are implicated in many biological processes ranging from cell-cell communication to gene transfer and delivery of virulence factors depending upon which bacteria are producing the OMV. Only recently have bacterial OMV become accessible for use across a wide range of applications through the development of techniques to control and direct packaging of recombinant proteins into OMV. This protocol describes a method for the production, purification, and use of enzyme packaged OMV providing for improved overall production of recombinant enzyme, increased vesiculation, and enhanced enzyme stability. Successful utilization of this protocol will result in the creation of a bacterial strain that simultaneously produces a recombinant protein and directs it for OMV encapsulation through creating a synthetic linkage between the recombinant protein and an outer membrane anchor protein. This protocol also details methods for isolating OMV from bacterial cultures as well as proper handling techniques and things to consider when adapting this protocol for use for other unique applications such as: pharmaceutical drug delivery, medical diagnostics, and environmental remediation.

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

A protocol for the production, purification, and use of enzyme packaged outer membrane vesicles (OMV) providing for enhanced enzyme stability for implementation across diverse applications is presented.

Packaging proteine ​​diretto all&#39;interno della membrana esterna vescicole da<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Progettazione, produzione e purificazione

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Ricerca

Biochimica

Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, particle size and shape, and surface-to-volume ratio of macromolecules. The technique is applicable to a very wide variety of solution conditions spanning a broad range of concentrations, pH values, ionic strengths, temperatures, additives, etc., but the sample is required to be monodisperse. This caveat led to the implementation of liquid chromatography systems on SAXS beamlines. Here, we describe the upstream integration of size-exclusion (SEC) and ion-exchange chromatography (IEC) on a beamline, different methods for optimal background subtraction, and data reduction. As an example, we describe how we use SEC- and IEC-SAXS on a fragment of the essential vaccinia virus protein D5, consisting of a D5N helicase domain. We determine its overall shape and molecular weight, showing the hexameric structure of the protein.

The determination of the solution structure of a protein by small angle X-ray scattering (SAXS) requires monodisperse samples. Here, we present two possibilities to ensure minimal delays between sample preparation and data acquisition: online size-exclusion chromatography (SEC) and online ion-exchange chromatography (IEC).

In linea Size-esclusione e cromatografia a scambio ionico su una SAXS Beamline

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, ...

Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by networks of interacting protein complexes, which are often difficult to investigate because their binding is non-covalent and easily perturbed by purification techniques. This work describes a method of stabilizing and separating native protein complexes from unmodified tissue using two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. Tissue lysate is loaded onto a non-denaturing blue-native polyacrylamide gel, then an electric current is applied until the protein migrates a short distance into the gel. The gel strip containing the migrated protein is then excised and incubated with the amine-reactive cross-linking reagent dithiobis(succinimidyl propionate), which covalently stabilizes protein complexes. The gel strip containing cross-linked complexes is then cast into a sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel, and the complexes are separated completely. The method relies on techniques and materials familiar to most molecular biologists, meaning it is inexpensive and easy to learn. While it is limited in its ability to adequately separate extremely large complexes, and has not been universally successful, the method was able to capture a wide variety of well-studied complexes, and is likely applicable to many systems of interest.

A method for stabilizing and separating native protein complexes from unmodified tissue lysate using an amine-reactive protein cross-linker coupled to a novel two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) system is presented.

Multimer-PAGE: Un metodo per acquisire e risolvere i complessi proteici nei campioni biologici

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by ...

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications (PTMs). They are newly identified species with unknown means of establishment and functional implications. Current analytical methods are inadequate to detect the copy-specific occurrence of PTMs on the nucleosomal sister histones. This protocol presents a biochemical method for the in vitro reconstitution of nucleosomes containing differentially isotope-labeled sister histones. The generated complex can be also asymmetrically modified, after including a premodified histone pool during refolding of histone subcomplexes. These asymmetric nucleosome preparations can be readily reacted with histone-modifying enzymes to study modification cross-talk mechanisms imposed by the asymmetrically pre-incorporated PTM using nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. Particularly, the modification reactions in real-time can be mapped independently on the two sister histones by performing different types of NMR correlation experiments, tailored for the respective isotope type. This methodology provides the means to study crosstalk mechanisms that contribute to the formation and propagation of asymmetric PTM patterns on nucleosomal complexes.

This protocol describes the reconstitution of nucleosomes containing differentially isotope-labeled sister histones. At the same time, asymmetrically post-translationally modified nucleosomes can be generated after using a premodified histone copy. These preparations can be readily used to study modification crosstalk mechanisms, simultaneously on both sister histones, by using high-resolution NMR spectroscopy.

Ricostituzione dei nucleosomi con differenzialmente marcati con isotopi sorelle istoni

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the disordered and protease labile C-terminus of the protein. This manuscript describes the methods to purify recombinant Nsa1 from S. cerevisiae for structural analysis by both X-ray crystallography and SAXS. X-ray crystallography was utilized to solve the structure of the well-ordered N-terminal WD40 domain of Nsa1, and then SAXS was used to resolve the structure of the C-terminus of Nsa1 in solution. Solution scattering data was collected from full-length Nsa1 in solution. The theoretical scattering amplitudes were calculated from the high-resolution crystal structure of the WD40 domain, and then a combination of rigid body and ab initio modeling revealed the C-terminus of Nsa1. Through this hybrid approach the quaternary structure of the entire protein was reconstructed. The methods presented here should be generally applicable for the hybrid structural determination of other proteins composed of a mix of structured and unstructured domains.

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

This method describes the cloning, expression, and purification of recombinant Nsa1 for structural determination by X-ray crystallography and small-angle X-ray scattering (SAXS), and is applicable for the hybrid structural analysis of other proteins containing both ordered and disordered domains.

Combinando la cristallografia a raggi x con piccolo angolo x-ray Scattering per modellare le regioni non strutturate di Nsa1 da S. Cerevisiae

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, they are important drug targets. We have developed a magnetic-agarose-bead-based assay platform for the investigation of proteolytic activity, which is based on the use of recombinant fusion protein substrates. In order to demonstrate the use of this assay system, a protocol is presented on the example of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) protease. The introduced assay platform can be utilized efficiently in the biochemical characterization of proteases, including enzyme activity measurements in mutagenesis, kinetic, inhibition, or specificity studies, and it may be suitable for high-throughput substrate screening or may be adapted to other proteolytic enzymes.
In this assay system, the applied substrates contain N-terminal hexahistidine (His6) and maltose-binding protein (MBP) tags, cleavage sites for tobacco etch virus (TEV) and HIV-1 proteases, and a C-terminal fluorescent protein. The substrates can be efficiently produced in Escherichia coli cells and easily purified using nickel (Ni)-chelate-coated beads. During the assay, the proteolytic cleavage of bead-attached substrates leads to the release of fluorescent cleavage fragments, which can be measured by fluorimetry. Additionally, cleavage reactions can be analyzed by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). A protocol for the in-gel renaturation of assay components is also described, as partial renaturation of fluorescent proteins enables their detection based on molecular weight and fluorescence.

Here, we present the detailed procedure of a recently developed protease assay platform utilizing N-terminal hexahistidine/maltose-binding protein and fluorescent protein-fused recombinant substrates attached to the surface of nickel-nitrilotriacetic acid magnetic agarose beads. A subsequent in-gel analysis of the assay samples separated by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis is also presented.

Uso delle proteine di fusione ricombinante in una piattaforma di analisi fluorescente proteasi e loro rinaturalizzazione In-gel

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled protein polymerization process is always a challenge. Here, we have developed an enzymatic methodology for constructing polymerized protein step by step in a rationally-controlled sequence. In this method, the C-terminus of a protein monomer is NGL for protein conjugation using OaAEP1 (Oldenlandia affinis asparaginyl endopeptidases) 1) while the N-terminus was a cleavable TEV (tobacco etch virus) cleavage site plus an L (ENLYFQ/GL) for temporary N-terminal protecting. Consequently, OaAEP1 was able to add only one protein monomer at a time, and then the TEV protease cleaved the N-terminus between Q and G to expose the NH2-Gly-Leu. Then the unit is ready for next OaAEP1 ligation. The engineered polyprotein is examined by unfolding individual protein domain using atomic force microscopy-based single-molecule force spectroscopy (AFM-SMFS). Therefore, this study provides a useful strategy for polyprotein engineering and immobilization.

Here, we present a protocol to conjugate protein monomer by enzymes forming protein polymer with a controlled sequence and immobilize it on the surface for single-molecule force spectroscopy studies.

Sintesi enzimatica mediata OaAEP1 e immobilizzazione delle proteine polimerizzate per la spettroscopia a singola molecola

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

High-throughput Purificazione di affinità-tagged proteine ​​ricombinanti

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Biologia

Residue-Specific Exchange of Proline by Proline Analogs in Fluorescent Proteins: How "Molecular Surgery" of the Backbone Affects Folding and Stability

Replacement of proline (Pro) residues in proteins by the traditional site-directed mutagenesis by any of the remaining 19 canonical amino acids is often detrimental to protein folding and, in particular, chromophore maturation in green fluorescent proteins and related variants. A reasonable alternative is to manipulate the translation of the protein so that all Pro residues are replaced residue-specifically by analogs, a method known as selective pressure incorporation (SPI). The built-in chemical modifications can be used as a kind of &#34;molecular surgery&#34; to finely dissect measurable changes or even rationally manipulate different protein properties. Here, the study demonstrates the usefulness of the SPI method to study the role of prolines in the organization of the typical &#946;-barrel structure of spectral variants of the green fluorescent protein (GFP) with 10-15 prolines in their sequence: enhanced green fluorescent protein (EGFP), NowGFP, and KillerOrange. Pro residues are present in connecting sections between individual &#946;-strands and constitute the closing lids of the barrel scaffold, thus being responsible for insulation of the chromophore from water, i.e., fluorescence properties. Selective pressure incorporation experiments with (4R)-fluoroproline (R-Flp), (4S)-fluoroproline (S-Flp), 4,4-difluoroproline (Dfp), and 3,4-dehydroproline (Dhp) were performed using a proline-auxotrophic E. coli strain as expression host. We found that fluorescent proteins with S-Flp and Dhp are active (i.e., fluorescent), while the other two analogs (Dfp and R-Flp) produced dysfunctional, misfolded proteins. Inspection of UV-Vis absorption and fluorescence emission profiles showed few characteristic alterations in the proteins containing Pro analogs. Examination of the folding kinetic profiles in EGFP variants showed an accelerated refolding process in the presence of S-Flp, while the process was similar to wild-type in the protein containing Dhp. This study showcases the capacity of the SPI method to produce subtle modifications of protein residues at an atomic level (&#34;molecular surgery&#34;), which can be adopted for the study of other proteins of interest. It illustrates the outcomes of proline replacements with close chemical analogs on the folding and spectroscopic properties in the class of &#946;-barrel fluorescent proteins.

To overcome the limitations of classical site-directed mutagenesis, proline analogs with specific modifications were incorporated into several fluorescent proteins. We show how the replacement of hydrogen by fluorine or of the single by double bonds in proline residues ("molecular surgery") affects fundamental protein properties, including their folding and interaction with light.

Scambio specifico di prolina da parte di analoghi della prolina in proteine fluorescenti: come la "chirurgia molecolare" della spina dorsale influisce sul ripiegamento e sulla stabilità

Replacement of proline (Pro) residues in proteins by the traditional site-directed mutagenesis by any of the remaining 19 canonical amino acids is often ...

Bioingegneria

The Proteasome Structure

The ubiquitin-proteasome pathway is a well-known mechanism utilized by eukaryotic cells to remove cytoplasmic proteins that are misfolded, damaged, or no longer needed. In this pathway, the protein that needs to be eliminated undergoes a process called ubiquitination, where a chain of ubiquitin molecules is attached to the 48th lysine residue of the target protein. This ubiquitin modification helps the proteasome distinguish between a target protein and a healthy protein.
The proteasome is an ATP-driven, large multi-subunit protease (26S) found in the nucleus and cytoplasm of all eukaryotes. The 26S proteasome comprises a central hollow cylindrical core (the 20S) and ring-shaped protein caps (19S). The 20S core particle is barrel-shaped, containing stacked rings with proteolytic active sites lined inside. The 19S caps act as gatekeepers and regulatory units of the proteasome. They are present at one or both ends of the core.
Caps have ubiquitin receptors, ubiquitin hydrolase, and unfoldase, each with a unique function. The ubiquitin receptor recognizes and allows ubiquitin-tagged proteins into the core, the hydrolase deubiquitinase cleaves ubiquitin from the substrate, and the unfoldase protein unfolds target proteins as they enter the protein core.
The hexameric unfoldases create a ring structure in the proteasome cap and belong to a large class of AAA proteins. Their mechanistic action is similar to other ATP-dependent helicases that cause DNA unwinding. The ATP-bound unfoldase ring binds a folded target protein held in place by its ubiquitin tag at the proteasomal cap. Next, a conformational change, driven by ATP hydrolysis, pulls the target protein substrate into the 20S core and strains the ring structure. As a result, when a protein is subjected to pulling forces, it can undergo two possible outcomes&#8212; it may either undergo partial unfolding and enter the cylindrical core, or it can retain its structure while partially retracting.
Highly stable substrates generally require hundreds of cycles of ATP hydrolysis before being pulled through the AAA ring. Once de-ubiquitylated and unfolded, the target protein is exposed to proteases inside the proteasomal core for digestion. In contrast to free cellular proteases, which quickly dissociate after their action on the target protein, the proteasome core holds the target protein until it is fully digested into smaller peptides. These small peptides are then released into the cytosol for further processing.&#160;

La struttura del proteasoma

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