侵害受容性および炎症性メディエーターの組織特異的な測定のためのヒトのin vivoバイオアッセイ

要約

技術は、痛みや炎症を介在する生化学物質の測定のための適切な組織のサイト（ここで、実験的に炎症を起こしている皮膚）から間質液サンプルの生体内のコレクションのために提示されます。

要約

この生体内のヒトバイオアッセイは、ヒトのボランティアと患者を研究するために使用することができます。サンプルは、無菌的に挿入した微小透析カテーテル（皮膚透析、エルランゲン、ドイツ）を経由して皮膚などの関連する組織のサイトから収集されます。この例に示すようにヒトのボランティアで実験的に炎症を起こしている皮膚から間質液のコレクションです。サンプルのコレクションは、他の実験的なテストと組み合わせることができます。例えば、局所的に放出さ生化学および実験的に炎症を起こしている皮膚の痛みを伴う刺激に対する主観的な感度の同時評価は、痛みや炎症のバイオマーカーを識別するための重要な生化学的、行動的リンクを提供しています。生きている人間の生体に提示アッセイは、疼痛および/または炎症の基礎となる組織特異的なプロセスへの機械的な洞察が可能になります。このような新薬候補として - - 痛みおよび/または炎症性状態の治療をターゲッティング法もよく、既存または新規の介入の有効性を調べるために適しています。この記事では、人間の被験者の実験的炎症を起こしている皮膚の病変から間質液を収集するためのマイクロダイアリシス技術の使用に関する詳細な説明を提供します。間質液のサンプルは、通常、50マイクロリットルのようなボリュームのような小さなサンプルで100検体までアッセイすることが可能マルチプレックスビーズアレイのイムノアッセイの助けを借りて処理されます。

プロトコル

実験的な炎症の誘導：

1. 第一度日焼けはキャリブレーション、紫外線Bのソース（SaalmannマルチテスターSBB LT 499、Saalmann社、ヘレフォード、ドイツ）の助けを借りて、太ももの非日焼けした肌に誘導される。日焼けは、露出した皮膚の完全な発赤、または3回最小限の紅斑量（MED）を引き起こすために必要なUVB光線の3倍を適用することにより、マイクロダイアリシス実験を開始する前に24時間誘導される。 MEDは、研究開始前に各被験者に決定されます。エネルギーの正確な納期は、UV計（RM 12、博士グローベルUV -電子社、Ettlingenの、ドイツ）で保証されています。

カテーテル留置とサンプルの収集：

1. 滅菌手袋、23ゲージ（G）針、30Gの針と1cc注射器、1％リドカイン1滅菌ニードルホルダー、1ccルアーチップシリンジを使用してステージング領域を準備し、アルコール綿棒、2x2の滅菌ガーゼパッド、マイクロダイアリシスカテーテルは、一度に添付4センチメートル23G針（皮膚透析、エルランゲン、ドイツ）、そしてドライアイス上に100μlのサンプル当たり4μlプロテアーゼ阻害剤溶液と1.5ミリリットルMicrocentコレクションチューブ（E＆Kサイエンティフィック、サンタクララ、カリフォルニア州）に終了。プロテアーゼ阻害剤溶液は、プロテアーゼインヒビターカクテル錠剤（Roche Diagnostics社、社、マンハイム、ドイツ）を使用して、製造元の指示ごとに行われます。
2. 乳酸リンゲル液の1％ヒトアルブミン溶液を調製し、1ccルアーチップシリンジにそれを描く、注射器に残っているに気泡がないことを確認すること。
3. 高精度の注入ポンプ（ポンプ22、ハーバード装置、南ネイティック、マサチューセッツ州に取り付けたクレードル（微小透析マルチシリンジラック、ハーバード装置、南ネイティック、マサチューセッツ州）に1％ヒトアルブミンの濃縮乳酸溶液を注射器をロードする）。注射器を駆動する輸液ポンプのバーは、シリンジのプランジャーと完全に接触していることを確認してください。シリンジの直径が正確にポンプに入力されていることを確認した後にポンプ速度を設定します。一般的に使用される注入速度は2〜4μl/minの範囲です。
4. あなたからのサンプルを収集する予定の領域を定義します。このような日​​焼け上記の、日焼けの端にカテーテルを挿入する上での計画として人工的に作られた炎症部位からサンプリングするとき。
5. あなたがアルコールと、からサンプルを収集する予定の小さな病変の反対側の端の領域、またはサイトをクリーニングします。これらのクリーンなエリアでは、意図した挿入とカテーテルのための出口点になります。ちょうど足りるだけの非常に小さな水疱（2mmの最大）を作成するために、これらのサイトで（注射で皮膚の蒼白によって証明される）内皮下リドカイン注入する。マイクロダイアリシスカテーテルの入口と出口でイントラ皮膚リドカインのような限られた量の注射は、バイオアッセイの結果を変更しないでくださいしかし、研究対象者に対して大幅に少ない痛みカテーテルの挿入を行うことはありません。
6. 無菌技術を用いて、探索皮膚領域の長さ以上添付23G針の助けを借りて、微小透析カテーテルを挿入する。挿入の深さは、皮膚と皮下組織の間のインタフェースになります。十分な深さで挿入は光学的に検証することができます。針と接続されたカテーテルを前方に移動されると、針は皮膚の少し上の折りたたみだけでなく、皮膚の一部白化を引き起こす必要があります。出血は発生しないはずです。出血が発生した場合、これは針が深く、意図したよりも置かれていることを示し、挿入の深さは調節する必要があります。針が皮膚の出口ポイントを介してプッシュされた後に、カテーテルの長さに沿って液滴を表示されるまで、1％アルブミンの濃縮乳酸リンゲル液ソリューションでカテーテルをフラッシュする。これは、慎重にマイクロダイアリシスカテーテルの遠位端にシリンジ（23G針）の針の端を挿入し、ゆっくりと溶液を注入することにより行われます。
7. カテーテルをフラッシュした後、皮膚を介して接続されたカテーテルを養うために針を軽く引っ張る。カテーテルが小径、そして結果的に壊れやすいので、丁重な扱いが必要です。それは完全に皮膚を介してスレッド化されるまで、カテーテルを引っ張って、すなわち、カテーテルの遠位端を埋め込む大きなプラスチックチューブのベースには、エントリポイントで肌に触れる。前述のように、手順の最後にない出血の少ない、最適なカテーテルの配置を確認する。
8. 輸液ポンプのラックで休んで注射器の23G針の先端にカテーテルの遠位端を取り付けます。ケアは、潜在的な漏れの原因となるカテーテルの壁を通して針を穿刺を回避するために必要です。
9. カテーテルの近位端から針をカット。
10. ¼インチのピンクのテープを使用して、カテーテルの出口部に近い皮膚に準備さ1.5ミリリットルMicrocentコレクションチューブを取り付けます。 microdialysateのコレクションを可能にするためにコレクションチューブにカテーテルの先端を置きます。所定Rにおける灌流ポンプを起動します。食べて、断続的に配信され、収集されたボリュームが一致していることを確認。ケース内のボリュームが一致しない、皮膚の侵入部位からの漏れは（時々皮膚の侵入部位に、より緊密にプラスチックチューブにより埋め込まれているカテーテルの部分を引いて解決することができます）除外する必要があります。配信され、収集されたボリュームが一致しない場合あるいは、カテーテルを交換する必要があります。
11. サンプリングが完了すると、サンプルは-80℃で貯蔵するまでドライアイス上に配置されています

ディスカッション

微小透析技術と多重イムノアッセイ技術の併用は、関心のある組織の生化学的事象についての洞察を提供する人間のバイオアッセイ、in vivoで、リアルタイムの貴重なものです。このような痛みのテストのような行動テストと組み合わせることで、方法は痛みや炎症を介在する生化学物質の複雑な相互作用を研究することができます。方法は、末梢組織病理で炎症と慢性疼痛の条件の病理にメカニズムの洞察...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microdialysis catheter	Tool	Dermal Dialysis	NA
Pump 22	Tool	Harvard Apparatus	552219
Saalmann Multitester SBB LT 400	Tool	Saalmann GmbH	NA
RM-12 IP-65 Radiometer	Tool	Dr. Grobel UV Elektronik GmbH	82120000/81112100
Complete Proteinase Inhibitor	Reagent	Roche Group	11836145001
Microcent tube	Tool	E&K Scientific	380150-X
Albumin 5%	Reagent	ZLB Behring	NA
Lactated Ringer	Reagent	Hospira Inc.	NA
Xylocaine-MPF	Other	AstraZeneca	NA
Syringe 1mL	Tool	BD Biosciences	309602