Estudio in bioensayo para la medición específica de tejido de mediadores inflamatorios y nociceptivos

Resumen

Una técnica se presenta para la colección en vivo de las muestras de líquido intersticial del tejido de los sitios pertinentes (la piel aquí, experimentalmente inflamación) para la medición de sustancias bioquímicas mediar el dolor y la inflamación.

Resumen

Este bioensayo humana in vivo puede ser utilizado para estudiar voluntarios y pacientes. Las muestras se recogen de los sitios de los tejidos pertinentes, tales como la piel a través de catéteres de microdiálisis asépticamente insertado (diálisis dérmica, Erlangen, Alemania). Muestra en este ejemplo es la colección de líquido intersticial de la piel inflamada forma experimental en voluntarios humanos. La recogida de muestras se puede combinar con otras pruebas experimentales. Por ejemplo, la evaluación simultánea de productos bioquímicos liberados localmente y la sensibilidad subjetiva a los estímulos dolorosos en la piel inflamada experimental proporciona la crítica bioquímicos-conductual enlace para identificar biomarcadores de inflamación y dolor. Ensayo presentado en el organismo humano vivo permite visión mecanicista de los procesos específicos de tejido subyacente del dolor y / o la inflamación. El método también es adecuado para examinar la efectividad de las intervenciones existentes o nuevas - tales como los nuevos medicamentos - objetivo el tratamiento de dolor y / o inflamatorios. En este artículo se proporcionará una descripción detallada sobre el uso de técnicas de microdiálisis para recoger el líquido intersticial de la lesión de la piel inflamada forma experimental los sujetos de estudio humanos. Muestras de fluido intersticial son procesados ​​con la ayuda de los inmunoensayos multiplex serie de cuentas que permite ensayar hasta 100 analitos en muestras tan pequeñas como en el volumen de 50 microlitros.

Protocolo

La inducción de la inflamación experimental:

1. Una quemadura de primer grado se induce en la piel no curtida de un muslo con ayuda de un calibrado, la fuente de los rayos ultravioleta B (Saalmann Multitester SBB LT 499, Saalmann GmbH, Hereford, Alemania). La quemadura solar es inducida por 24 horas antes de iniciar un experimento de microdiálisis mediante la aplicación de tres veces la cantidad de luz UVB necesaria para causar enrojecimiento completa de la piel expuesta, o tres veces la dosis mínima de eritema (MED). El MED se determina en cada tema antes de iniciar el estudio. La entrega precisa de la energía está asegurada con un medidor de UV (RM 12, el Dr. Grobel UV-Electronic GmbH, Ettlingen, Alemania).

Catéter de colocación y recogida de muestras:

1. Prepare un área de ensayo con guantes estériles, un porta-agujas estériles, jeringas de 1 cc punta luer con un calibre 23 (G) de aguja, la jeringa de 1 cc con una aguja 30G, lidocaína al 1%, algodones con alcohol, gasas estériles de 2x2, los catéteres de microdiálisis conectado a un fin a una aguja de 4 cm de 23G (diálisis dérmica, Erlangen, Alemania), y tubos de 1,5 ml Microcent colección (E & K Científico, Santa Clara, CA.) con una solución de 4μl inhibidor de la proteasa por muestra 100μl en hielo seco. solución de inhibidor de la proteasa se hace según las instrucciones del fabricante, utilizando comprimidos de cóctel de inhibidores de la proteasa (Roche Diagnostics, GmbH, Mannheim, Alemania).
2. Prepare una solución al 1% de albúmina humana en solución de Ringer lactato y dibujarlo en la punta de la jeringa de 1cc luer, asegurándose de que no haya burbujas de aire que queda en la jeringa.
3. Cargue la jeringa con el 1% de albúmina humana enriquecida con solución de Ringer lactato en la cuna (microdiálisis multi-jeringa rack, Harvard Apparatus, Natick del Sur, MA) montado en una bomba de precisión de la infusión de alto (la bomba 22, Harvard Apparatus, South Natick, MA ). Asegúrese de que la barra de la bomba de infusión de conducción de la jeringa se encuentra en pleno contacto con el émbolo de la jeringa. Establecer la velocidad de la bomba después de confirmar que el diámetro de la jeringa ha sido exactamente entró en la bomba. Comúnmente utilizado las tasas de infusión oscila entre 2 a 4μl/min.
4. Definir el área que el plan para recoger la muestra de. Cuando el muestreo de un área creada artificialmente inflamada, como la quemadura de sol se ha descrito anteriormente, el plan de inserción del catéter en el borde de la quemadura.
5. Limpiar un área pequeña en los bordes opuestos de la lesión, o en el sitio tiene la intención de tomar la muestra de, con el alcohol. Estas áreas ya limpias se pretende la inserción y puntos de salida del catéter. Inyectar suficiente lidocaína intra-cutánea (evidenciado por la palidez de la piel de inyección) en estos sitios para crear una ampolla muy pequeña (máximo de 2 mm). La inyección de dicha cantidad limitada de intra-cutánea de lidocaína en la entrada y salida del catéter de microdiálisis no debe alterar los resultados de los bioensayos, pero hace que la inserción del catéter significativamente menos doloroso para los sujetos de estudio.
6. Utilizando las técnicas de asepsia, inserte los catéteres de microdiálisis con la ayuda de la aguja de 23G unida a lo largo de la zona de la piel explorado. La profundidad de inserción se encuentra en la interfaz entre el cutis y el tejido subcutáneo. Inserción a una profundidad adecuada se puede verificar de forma óptica. A medida que la aguja y el catéter conectado se mueven hacia delante de la aguja debe causar un poco más arriba-pliegue de la piel, así como algunos blanqueo de la piel. No debe ocurrir sangrado. Si se produce una hemorragia, esto indica que la aguja se encuentra más profunda de lo previsto y la profundidad de inserción tiene que ser ajustada. Una vez que la aguja ha sido empujado a través del punto de salida de la piel, lavar los catéteres con albúmina al 1% enriquecido solución de Ringer lactato hasta que vea las gotas a lo largo de la longitud del catéter. Esto se hace introduciendo cuidadosamente el extremo de la aguja de una jeringa (aguja 23G) en el extremo distal del catéter de microdiálisis, e inyectando lentamente la solución.
7. Después de lavar el catéter tire suavemente de la aguja para alimentar a la sonda conectada a través de la piel. Un manejo cuidadoso es necesario porque los catéteres de diámetro pequeño y frágil en consecuencia. Tirar el catéter hasta que esté completamente pasa a través de la piel, es decir, la base del tubo de plástico más grandes incorporación del extremo distal del catéter toca la piel en el punto de entrada. Como se mencionó anteriormente, poco o ningún sangrado al final del procedimiento confirma la colocación del catéter óptimo.
8. Conecte el extremo distal del catéter hasta la punta de la aguja 23G de la jeringa en reposo en el bastidor de la bomba de infusión. Es necesario tener cuidado para evitar la punción de la aguja a través de la pared de la sonda, lo que causa las posibilidades de fuga.
9. Corte la aguja del extremo proximal del catéter.
10. El uso de ¼ de pulgada de cinta de color rosa, conecte el tubo de 1,5 ml preparados colección Microcent en la piel cerca del sitio de salida del catéter. Coloque la punta del catéter en el tubo de recogida que permita la recogida de microdialysate. En marcha la bomba de perfusión en r predeterminadocomieron y de forma intermitente comprobar que el volumen de entrega y recogida coinciden. En el caso de los volúmenes no coinciden, la fuga del sitio de entrada la piel debe ser excluido (a veces se puede resolver tirando de la parte del catéter que se inserta en el tubo de plástico con más fuerza en el sitio de entrada de la piel). Por otra parte, un catéter puede necesitar ser reemplazada si los volúmenes de entrega y recogida no coinciden.
11. Una vez efectuada la toma, las muestras se colocaron en hielo seco hasta su almacenamiento a -80 º C.

Discusión

El uso combinado de técnicas de microdiálisis y la tecnología de inmunoanálisis multiplex es un valor en tiempo real, en vivo bioensayo humanos proporcionando información sobre los eventos bioquímicos en el tejido de interés. En combinación con las pruebas de comportamiento, tales como pruebas de dolor, el método permite el estudio de las complejas interacciones bioquímicas de la mediación del dolor y la inflamación. El método es prometedor para 1) la identificación de biomarcadores específicos de tejido mediar el dolor y la ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microdialysis catheter	Tool	Dermal Dialysis	NA
Pump 22	Tool	Harvard Apparatus	552219
Saalmann Multitester SBB LT 400	Tool	Saalmann GmbH	NA
RM-12 IP-65 Radiometer	Tool	Dr. Grobel UV Elektronik GmbH	82120000/81112100
Complete Proteinase Inhibitor	Reagent	Roche Group	11836145001
Microcent tube	Tool	E&K Scientific	380150-X
Albumin 5%	Reagent	ZLB Behring	NA
Lactated Ringer	Reagent	Hospira Inc.	NA
Xylocaine-MPF	Other	AstraZeneca	NA
Syringe 1mL	Tool	BD Biosciences	309602