Umano in vivo Bioassay per il tessuto-specifica misura di mediatori infiammatori e nocicettivo

Riepilogo

Una tecnica è presentato per la raccolta in vivo di campioni di liquido interstiziale del tessuto da siti pertinenti (pelle qui, sperimentalmente infiammata) per la misurazione di sostanze biochimiche che mediano il dolore e l'infiammazione.

Abstract

Questo in-vivo biologico umano può essere utilizzato per studiare volontari e pazienti. I campioni sono stati raccolti da siti pertinenti tessuti come la pelle attraverso cateteri inseriti microdialisi in modo asettico (Dialisi cutanea, Erlangen, Germania). Illustrato in questo esempio è la raccolta di liquido interstiziale dalla cute sperimentalmente infiammata in volontari umani. Raccolta del campione può essere combinato con altri test sperimentali. Per esempio, la valutazione simultanea di sostanze biochimiche a livello locale rilasciato e la sensibilità soggettiva agli stimoli dolorosi in pelle sperimentalmente infiammata fornisce la critica biochimico-comportamentale di collegamento per identificare biomarcatori del dolore e dell'infiammazione. Saggio presentato nell'organismo umano vivente permette di comprensione meccanicistica nei processi di tessuto-specifici alla base del dolore e / o infiammazione. Il metodo è adatto anche per esaminare l'efficacia degli interventi esistenti o nuove - come ad esempio nuovi farmaci candidati - mira il trattamento di condizioni dolorose e / o infiammatorie. Questo articolo fornisce una descrizione dettagliata sull'uso di tecniche di microdialisi per la raccolta di liquido interstiziale dalla lesione cutanea sperimentalmente infiammata dei soggetti in studio umano. I campioni di fluidi interstiziali vengono solitamente trattati con l'aiuto dei test immunologici serie multiplex tallone che consente dosaggio fino a 100 analiti in campioni più piccolo in volume di 50 microlitri.

Protocollo

L'induzione di infiammazione sperimentale:

1. Un primo grado scottatura è indotta a non conciata pelle di una coscia con l'aiuto di un calibrato, fonte di raggi ultravioletti B (Saalmann Multitester FFS LT 499, Saalmann GmbH, Hereford, Germania). La scottatura è indotta 24 ore prima di iniziare un esperimento microdialisi applicando tre volte la quantità di luce UVB necessaria per provocare arrossamento completo di pelle esposta, o tre volte la dose minima eritema (MED). Il MED è determinato in ogni soggetto prima di iniziare lo studio. Consegna precisa di energia è assicurata con un misuratore UV (RM 12, il dottor Grobel UV-Electronic GmbH, Ettlingen, Germania).

Catetere collocamento e raccolta dei campioni:

1. Preparare una area di sosta con guanti sterili, 1 porta aghi sterili, 1cc la siringa luer con un calibro 23 (G) ago, 1cc siringa con un ago 30G, 1% di lidocaina, tamponi imbevuti di alcool, 2x2 garze sterili, cateteri microdialisi fissati ad una fine di un ago 23G 4 centimetri (Dialisi cutanea, Erlangen, Germania), e provette da 1,5 ml di raccolta Microcent (E & K scientifico, Santa Clara, CA.) con la soluzione 4μl inibitore della proteasi per esempio 100μl in ghiaccio secco. inibitore della proteasi soluzione è fatto per istruzione costruttore, utilizzando un cocktail di inibitori della proteasi compresse (Roche Diagnostics, GmbH, Mannheim, Germania).
2. Preparare una soluzione all'1% di albumina umana in soluzione Ringer lattato e renderlo il 1cc siringa punta luer, assicurandosi che non ci siano bolle d'aria residua nella siringa.
3. Caricare la siringa con l'1% di albumina umana arricchita di soluzione di Ringer lattato nella base di appoggio (microdialisi multi-siringa rack, Harvard Apparatus, South Natick, MA) montato su una pompa ad alta infusione di precisione (Pump 22, Harvard Apparatus, South Natick, MA ). Assicurarsi che la barra della pompa di infusione guida la siringa è a pieno contatto con lo stantuffo della siringa. Impostare la velocità della pompa dopo aver verificato che il diametro della siringa è stata accuratamente entrato nella pompa. Velocità di infusione comunemente utilizzata varia fra 2 e 4μl/min.
4. Definire l'area si prevede di raccogliere il campione da. Quando il campionamento da un'area creata artificialmente infiammato, come la solarizzazione di cui sopra, ha intenzione di inserire il catetere a bordo della solarizzazione.
5. Pulire una piccola area ai bordi opposti della lesione, o un sito che si intende ritirare il campione, con l'alcol. Queste aree pulite sarà l'inserimento previsto e punti di uscita per il catetere. Iniettare quel tanto che basta lidocaina intra-cutaneo (evidenziato dal pallore della pelle iniezione) in questi siti per creare una bozza molto piccoli (massimo di 2 mm). Iniezione di tale quantità limitata di intra-cutanea alla lidocaina entrata e di uscita del catetere microdialisi non dovrebbe alterare i risultati del biotest, ma fa l'inserimento del catetere significativamente meno dolorosa per i soggetti di studio.
6. Utilizzando tecniche asettiche, inserire i cateteri microdialisi con l'ausilio di aghi 23G attaccato per tutta la lunghezza della zona cutanea esplorata. La profondità di inserimento è all'interfaccia tra cute e sottocute. Inserimento a una profondità adeguata può essere verificata otticamente. Come l'ago e il catetere attaccato vengono spostati in avanti l'ago dovrebbe causare un po 'di up-piegatura della pelle così come alcuni sbiancamento della pelle. Assenza di sanguinamento dovrebbe verificarsi. Se l'emorragia si verifica questo indica che l'ago si trova più profonda del previsto e la profondità di inserimento deve essere regolata. Una volta che l'ago è stato spinto attraverso il punto di uscita della pelle, lavare i cateteri con 1% di albumina soluzione arricchita Ringer lattato fino a vedere le gocce per tutta la lunghezza del catetere. Questo viene fatto con cura inserendo l'ago di una siringa (ago 23G) nella parte distale del catetere microdialisi, e lentamente iniettare la soluzione.
7. Dopo il lavaggio del catetere tirare delicatamente l'ago per alimentare il catetere collegato attraverso la pelle. Trattamento delicato è necessario perché i cateteri sono di piccolo diametro, e quindi fragile. Tirare il catetere fino a quando non è completamente filettato attraverso la pelle, cioè la base del tubo di plastica più grandi incorporare l'estremità distale del catetere tocca la pelle al punto di ingresso. Come accennato in precedenza, poco o nessun sanguinamento al termine della procedura di conferma posizionamento ottimale del catetere.
8. Collegare l'estremità distale del catetere alla punta dell'ago 23G della siringa di riposo nel rack della pompa di infusione. La cura è necessario per evitare la puntura l'ago attraverso la parete del catetere, che causerebbe perdite potenziali.
9. Tagliare l'ago fuori l'estremità prossimale del catetere.
10. Utilizzando ¼ pollici nastro rosa, collegare il tubo di 1,5 ml preparato raccolta Microcent la pelle vicino al sito di uscita del catetere. Posizionare la punta del catetere nel tubo di raccolta per permettere la raccolta di microdialysate. Avviare la pompa a perfusione r predeterminatomangiato e intermittente verificare che il volume consegnato e raccolti corrispondono. In caso di volumi non corrispondono, perdite dal punto di ingresso cutaneo deve essere esclusa (a volte può essere risolto tirando la parte del catetere che è integrato dal tubo di plastica più strettamente punto di ingresso sulla pelle). In alternativa, un catetere può essere necessario sostituire se i volumi consegnati e raccolti non corrispondono.
11. Una volta che il campionamento è completa, i campioni sono posti in ghiaccio secco fino a stoccaggio a -80 ° C.

Discussione

L'uso combinato di tecniche di microdialisi e immunodosaggio tecnologia multiplex è un prezioso tempo reale, in-vivo biologico umano permettono di approfondire eventi biochimici nel tessuto di interesse. In combinazione con test comportamentali, quali i test dolore, il metodo permette di studiare le complesse interazioni tra sostanze biochimiche che mediano il dolore e l'infiammazione. Il metodo è promettente per 1) identificare biomarcatori specifici tessuti mediando dolore e l'infiammazione, 2) fornendo visione meccanicistic...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microdialysis catheter	Tool	Dermal Dialysis	NA
Pump 22	Tool	Harvard Apparatus	552219
Saalmann Multitester SBB LT 400	Tool	Saalmann GmbH	NA
RM-12 IP-65 Radiometer	Tool	Dr. Grobel UV Elektronik GmbH	82120000/81112100
Complete Proteinase Inhibitor	Reagent	Roche Group	11836145001
Microcent tube	Tool	E&K Scientific	380150-X
Albumin 5%	Reagent	ZLB Behring	NA
Lactated Ringer	Reagent	Hospira Inc.	NA
Xylocaine-MPF	Other	AstraZeneca	NA
Syringe 1mL	Tool	BD Biosciences	309602