Bioensaio In-Vivo humanos para a medição de tecidos específicos de Mediadores nociceptiva e inflamatória

Resumo

A técnica é apresentada para a coleta in vivo de amostras de líquido intersticial de sites pertinentes tecido (pele aqui, experimentalmente inflamação) para a medição de produtos bioquímicos mediação dor e inflamação.

Resumo

Este bioensaio in vivo humano pode ser usado para estudar voluntários humanos e pacientes. As amostras são coletadas em sites de tecido pertinentes, tais como a pele através de cateteres inseridos assepticamente microdiálise (Diálise Dermal, Erlangen, Alemanha). Ilustrado neste exemplo é a coleção de líquido intersticial da pele inflamada experimentalmente em voluntários humanos. Coleta de amostras podem ser combinadas com outros testes experimentais. Por exemplo, a avaliação simultânea de produtos bioquímicos localmente liberados e sensibilidade subjetiva a estímulos dolorosos na pele inflamada experimentalmente fornece o link de bioquímica-comportamental fundamental para identificar biomarcadores da dor e inflamação. Ensaio apresentado no organismo humano vivo permite uma visão mecanicista em processos de tecidos específicos subjacentes a dor e / ou inflamação. O método também é adequado para examinar a eficácia das intervenções existentes ou novos - como novos fármacos - visando o tratamento de situações dolorosas e / ou inflamatória. Este artigo irá fornecer uma descrição detalhada sobre o uso de técnicas de microdiálise para coletar o líquido intersticial da lesão de pele inflamada experimentalmente dos sujeitos do estudo humano. As amostras de líquidos intersticiais são normalmente tratados com auxílio de imunoensaios multiplex talão série assaying permitindo até 100 analitos em amostras tão pequenas no volume de 50 microlitros.

Protocolo

Indução da inflamação experimental:

1. A queimadura de primeiro grau é induzida em não-bronzeada da pele de um coxa com auxílio de uma fonte calibrada B, ultravioleta (Saalmann multitester SBB LT 499, Saalmann GmbH, Hereford, Alemanha). A queimadura solar é induzida 24 horas antes de iniciar um experimento microdiálise através da aplicação de três vezes a quantidade de luz UVB necessária para causar vermelhidão completa de pele exposta, ou três vezes a dose mínima eritema (MED). O MED é determinado em cada disciplina antes do início do estudo. Entrega exata de energia está assegurada com uma UV-metro (12 RM, Dr. Grobel UV-Electronic GmbH, Ettlingen, Alemanha).

Colocação de cateter e coleta de amostra:

1. Prepare uma área de preparação com luvas estéreis, um porta-agulha estéril, seringa ponta 1cc luer com um calibre 23 (G) da agulha, seringa com uma agulha 1cc 30G, lidocaína a 1%, o algodão, as compressas de gaze estéril 2x2, cateteres microdiálise anexado em um fim a uma agulha de 4 centímetros 23G (Diálise Dermal, Erlangen, Alemanha), e 1,5 ml tubos de coleta Microcent (E & K Scientific, Santa Clara, CA.) com a solução 4μl inibidor da protease por amostra 100μl em gelo seco. solução inibidor da protease é feita por instrução do fabricante usando comprimidos inibidores da protease cocktail (Roche Diagnostics, GmbH, Mannheim, Alemanha).
2. Prepare uma solução de 1% de albumina humana em solução de ringer com lactato e desenhá-lo para dentro da seringa 1cc ponta luer, certificando-se não há bolhas de ar que restou na seringa.
3. Carregar a seringa com a 1% de albumina humana enriquecido solução de Ringer com lactato no berço (microdiálise seringa multi-rack, Harvard Apparatus, South Natick, MA) montado em uma bomba de alta precisão de infusão (Pump 22, Harvard Apparatus, South Natick, MA ). Certifique-se que a barra da bomba de infusão de condução a seringa está em contato total com o êmbolo da seringa. Definir a taxa de bomba após a confirmação de que o diâmetro da seringa foi exatamente entrou na bomba. As taxas de infusão comumente utilizados variam entre 2 a 4μl/min.
4. Defina a área que você pretende coletar sua amostra de. Quando a amostragem de uma área criada artificialmente inflamado, como a queimadura solar descrito acima, o plano de inserção do cateter na borda da queimadura.
5. Limpe uma área pequena em margens opostas da lesão, ou o site que pretende coletar a amostra de, com o álcool. Estas áreas serão limpas a inserção pretendido e pontos de saída para o cateter. Injetar apenas o suficiente lidocaína intra-cutânea (evidenciado pelo branqueamento da pele no local da injecção) nesses locais para criar uma bolha muito pequenas (máximo de 2mm). Injeção de quantidade limitada de tais intra-cutânea de lidocaína na entrada e pontos de saída do cateter de microdiálise não deve alterar os resultados do bioensaio, mas faz a inserção do cateter significativamente menos doloroso para sujeitos do estudo.
6. Utilizando técnicas de assepsia, insira o cateter de microdiálise com auxílio de agulha de 23G conectado ao longo do comprimento da área de pele explorado. A profundidade de inserção é na interface entre a cútis e subcutâneo. Inserção em uma profundidade adequada pode ser verificado visualmente. Como a agulha eo cateter são anexados avançou a agulha deve causar um pouco de dobra da pele, bem como alguns branqueamento da pele. Sem sangramento deve ocorrer. Se o sangramento ocorre isso indica que a agulha fica mais profundo do que o pretendido e da profundidade de inserção tem que ser ajustada. Uma vez que a agulha foi empurrada através do ponto de saída da pele, lave-os cateteres com 1% de albumina enriquecido solução de Ringer lactato até ver gotas ao longo do comprimento do cateter. Isto é feito através da inserção no final de uma seringa de agulha (23G agulha) na extremidade distal do cateter de microdiálise, e, lentamente, injetando solução.
7. Após a lavagem do cateter puxar suavemente a agulha para alimentar o cateter conectado através da pele. Manuseio suave é necessária porque os cateteres são de pequeno diâmetro e, conseqüentemente, frágil. Puxe o cateter até que esteja completamente roscadas através da pele, ou seja, a base do tubo de plástico maior incorporação da extremidade distal do cateter toca a pele no ponto de entrada. Como mencionado acima, pouco ou nenhum sangramento no final do procedimento confirma a inserção do cateter ideal.
8. Anexar a extremidade distal do cateter para a ponta da agulha da seringa 23G descansando no rack da bomba de infusão. Cuidado é necessário para evitar punção da agulha através da parede do cateter, o que poderia provocar uma fuga em potencial.
9. Cortar a agulha fora da extremidade proximal do cateter.
10. Usando ¼ polegadas de fita rosa, anexar o tubo de coleta de 1,5 ml preparada Microcent na pele perto do local de saída do cateter. Coloque a ponta do cateter para dentro do tubo de coleta para permitir a coleta de microdialysate. Ligue a bomba de perfusão em r predeterminadocomeu e intermitentemente verificar que o volume entregue e recolhido igualar-se. No caso de os volumes não correspondem, fuga do local de entrada da pele deve ser excluída (às vezes pode ser resolvido, puxando a parte do cateter que é incorporado pelo tubo de plástico com mais força sobre o local de entrada da pele). Alternativamente, um cateter pode precisar de ser substituído se volumes entregues e recolhidos não combinam.
11. Uma vez que a amostragem é completa, as amostras são colocadas em gelo seco até o armazenamento a -80 º C.

Discussão

O uso combinado de técnicas de microdiálise e tecnologia de imunoensaio multiplex é um valioso em tempo real, bioensaio in vivo humana fornecendo informações sobre eventos bioquímicos em tecidos de interesse. Combinados com testes comportamentais, tais como testes de dor, o método permite estudar as interações complexas de produtos bioquímicos mediação dor e inflamação. O método é promissor para 1) identificar biomarcadores tecido específico mediando a dor ea inflamação, 2) proporcionando uma visão mecanicista sobre a pa...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microdialysis catheter	Tool	Dermal Dialysis	NA
Pump 22	Tool	Harvard Apparatus	552219
Saalmann Multitester SBB LT 400	Tool	Saalmann GmbH	NA
RM-12 IP-65 Radiometer	Tool	Dr. Grobel UV Elektronik GmbH	82120000/81112100
Complete Proteinase Inhibitor	Reagent	Roche Group	11836145001
Microcent tube	Tool	E&K Scientific	380150-X
Albumin 5%	Reagent	ZLB Behring	NA
Lactated Ringer	Reagent	Hospira Inc.	NA
Xylocaine-MPF	Other	AstraZeneca	NA
Syringe 1mL	Tool	BD Biosciences	309602