Menschliche In-Vivo Bioassay für die Tissue-Specific Messung von nozizeptiven und Entzündungsmediatoren

Zusammenfassung

Eine Technik ist für die in-vivo-Sammlung der interstitiellen Flüssigkeit Proben aus relevanten Gewebe Seiten (hier experimentell entzündete Haut) für die Messung von Biochemikalien Vermittlung von Schmerzen und Entzündungen vor.

Zusammenfassung

Diese in-vivo menschlichen Bioassay kann zur menschlichen Probanden und Patienten zu untersuchen. Die Proben werden von einschlägigen Gewebe-Sites wie die Haut über aseptisch eingefügt Mikrodialyse-Katheter (Dermal Dialyse, Erlangen, Deutschland) gesammelt. Illustrated in diesem Beispiel ist die Sammlung der interstitiellen Flüssigkeit aus experimentell entzündete Haut in menschlichen Freiwilligen. Probenentnahme kann mit anderen experimentellen Untersuchungen kombiniert werden. Zum Beispiel bietet die gleichzeitige Beurteilung von lokal freigesetzt Biochemikalien und subjektive Empfindlichkeit auf Schmerzreize in experimentell entzündete Haut der kritischen biochemischen Verhaltens-Link, um Biomarker von Schmerzen und Entzündungen zu identifizieren. Präsentiert Assay im lebenden menschlichen Organismus ermöglicht mechanistische Einblicke in Gewebe-spezifischen Prozessen zugrunde liegenden Schmerzen und / oder Entzündung. Das Verfahren ist auch gut geeignet, um die Wirksamkeit der bestehenden oder neuen Interventionen zu untersuchen - wie neue Wirkstoffkandidaten - gezielt zur Behandlung von schmerzhaften und / oder entzündlichen Zuständen. Dieser Artikel wird eine detaillierte Beschreibung über die Verwendung der Mikrodialyse-Techniken für die Erhebung der interstitiellen Flüssigkeit aus experimentell entzündete Haut Läsion des menschlichen Probanden liefern. Interstitiellen Flüssigkeit Proben sind in der Regel mit Hilfe von Multiplex-Bead Immunoassays ermöglicht Testen von bis zu 100 Analyten in Proben so klein im Volumen von 50 Mikroliter verarbeitet.

Protokoll

Induktion der experimentellen Entzündung:

1. Eine Verwandte ersten Grades Sonnenbrand ist in nicht-gegerbten Haut eines Oberschenkels mit Hilfe eines kalibrierten, UV-B-Quelle (Saalmann Multitester SBB LT 499, Saalmann GmbH, Hereford, Deutschland) induziert. Der Sonnenbrand ist 24 Stunden vor Beginn einer Mikrodialyse Experiment, indem die dreifache Menge an UVB-Licht notwendig, um vollständige Rötung der Haut ausgesetzt, oder Dreifache der minimalen Erythem-Dosis (MED) verursachen induziert. Die MED ist in jedem Fach vor Beginn der Studie bestimmt. Genaue Lieferung von Energie ist mit versichert, ein UV-Messgerät (RM 12, Dr. Grobel UV-Electronic GmbH, Ettlingen, Deutschland).

Katheterplatzierung und Probenentnahme:

1. Bereiten Sie eine Staging-Bereich mit sterilen Handschuhen, 1 sterile Nadel Halter, 1cc Luer-Spritze mit einer 23 Gauge (G) Nadel, 1ml Spritze mit einer 30G Nadel, 1% Lidocain, Alkoholtupfer, 2x2 steriler Gaze-Pads, Mikrodialyse-Katheter an einem angeschlossenen Ende mit einer 4cm 23G Nadel (Dermal Dialyse, Erlangen, Deutschland) und 1,5 ml Microcent Sammelröhrchen (E & K Scientific, Santa Clara, CA.) mit 4μl Protease-Inhibitor-Lösung pro 100 &mgr; l Probe auf Trockeneis. Protease-Inhibitor-Lösung pro Anweisungen des Herstellers mit Protease Inhibitor Cocktail Tabletten (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland).
2. Bereiten Sie eine 1% Humanalbumin-Lösung in Ringer-Laktat-Lösung und ziehen es in die 1cc Luer Spritze, so dass es keine Luftblasen bleiben in der Spritze.
3. Legen Sie die Spritze mit der 1% Humanalbumin angereicherte Laktat-Lösung Ringer in die Wiege (Mikrodialyse multi-Spritze Rack, Harvard Apparatus, South Natick, MA) auf eine hohe Präzision Infusionspumpe (Pump 22, Harvard Apparatus, South Natick, MA montiert ). Stellen Sie sicher, dass die Bar der Infusionspumpe Fahren Sie die Spritze in vollem Kontakt mit dem Kolben der Spritze ist. Stellen Sie die Pumprate nach der Bestätigung, dass die Spritze Durchmesser wurde genau in die Pumpe eingegeben. Häufig verwendete Infusionsraten Bereich zwischen 2 bis 4μl/min.
4. Definieren Sie den Bereich, den Sie planen, Ihre Probe aus zu sammeln. Bei der Entnahme aus einer künstlich geschaffenen entzündeten Bereich, wie der Sonnenbrand oben beschriebenen Plan beim Einsetzen des Katheters an den Rand der Sonnenbrand.
5. Reinigen Sie einen kleinen Bereich an gegenüberliegenden Rändern der Läsion oder Website, die Sie beabsichtigen, Ihre Probe aus zu sammeln, mit Alkohol. Diese gereinigten Flächen wird die beabsichtigte Einführung und Ausspeisepunkte für den Katheter werden. Inject gerade genug Lidocain intra-kutan (belegt durch Ausbleichen der Haut an der Injektionsstelle) an diesen Stellen zu einem sehr kleinen Bläschen (maximal 2 mm) zu schaffen. Injection einer solchen begrenzten intra-kutane Lidocain bei der Ein-und Ausspeisepunkte des Mikrodialysekatheter sollte keinen Einfluss auf die Ergebnisse des Bioassays aber die Einführung des Katheters deutlich weniger schmerzhaft für Studienteilnehmer zu machen.
6. Unter aseptischen Bedingungen, legen Sie die Mikrodialyse-Katheter mit Hilfe des beigefügten 23G Nadel über die Länge der erforschten Hautpartien. Die Eintauchtiefe ist an der Schnittstelle zwischen Cutis und Subcutis. Insertion in ausreichender Tiefe kann optisch überprüft werden. Wie die Nadel und der beigefügten Katheters verschoben werden sollte die Nadel führen ein kleines up-Faltung der Haut sowie einige Ausbleichen der Haut. Kein Ausbluten auftreten sollten. Wenn die Blutung auftritt bedeutet dies, dass die Nadel tiefer als beabsichtigt ist und sich die Eintauchtiefe muss angepasst werden. Sobald die Nadel durch den Ausstieg der Haut geschoben worden ist, spülen Sie die Katheter mit 1% Albumin angereichert Lactat-Lösung Ringer, bis Sie Tröpfchen entlang der Länge des Katheters zu sehen. Dies geschieht durch vorsichtiges Einführen der Nadel Ende einer Spritze (23G Nadel) in das distale Ende des Mikrodialysekatheter, und langsam injizieren Lösung getan.
7. Nach dem Spülen des Katheters vorsichtig auf die Nadel auf die beigefügte Katheter durch die Haut zu ernähren. Schonende Behandlung ist erforderlich, weil der Katheter mit kleinem Durchmesser und damit zerbrechlich sind. Ziehen Sie den Katheter, bis sie vollständig durch die Haut threaded, berührt also die Basis des größeren Kunststoffschlauch Einbettung der distale Ende des Katheters die Haut an der Eintrittsstelle. Wie bereits erwähnt, bestätigt wenig bis gar keine Blutungen am Ende des Verfahrens eine optimale Platzierung von Kathetern.
8. Befestigen Sie das distale Ende des Katheters an der Spitze der 23G Nadel der Spritze Ruhe in das Rack der Infusionspumpe. Pflege erforderlich ist, um zu vermeiden Durchstechen der Nadel durch die Wand des Katheters, wäre die Ursache möglichen Leckagen.
9. Schneiden Sie die Nadel aus dem proximalen Ende des Katheters.
10. Mit ¼-Zoll-rosa Band, bringen Sie die vorbereiteten 1.5ml Microcent Sammelrohr an der Haut in der Nähe der Austrittsstelle des Katheters. Setzen Sie die Spitze des Katheters in die Sammlung Schlauch Sammlung von Mikrodialysat ermöglichen. Starten Sie den Perfusionspumpe an vorgegebenen raß und zeitweise prüfen, ob angeliefert und abgeholt Volumen übereinstimmen. Bei den Bänden nicht übereinstimmen, Leckage von der Haut entry site sollte ausgeschlossen werden (Sie können auch durch Ziehen der Teil des Katheters, die durch den Kunststoffschlauch eingebettet ist mehr fest auf der Haut Eintrag Ort behoben werden). Alternativ kann ein Katheter ersetzt werden müssen, wenn geliefert und Sammelbänden nicht übereinstimmen.
11. Nach Probenahme abgeschlossen ist, werden die Proben auf Trockeneis, bis Lagerung bei -80 º C gelegt

Diskussion

Der kombinierte Einsatz von Mikrodialyse Techniken und Multiplex-Immunoassay-Technologie ist eine wertvolle real-time, in-vivo-Bioassay Menschen einen Einblick in biochemische Vorgänge in Gewebe von Interesse. Kombiniert mit Verhaltenstests wie Schmerzen Tests erlaubt das Verfahren die Untersuchung der komplexen Wechselwirkungen von Biochemikalien Vermittlung von Schmerzen und Entzündungen. Die Methode ist für 1 vielversprechend) identifiziert Gewebe spezifische Biomarker Vermittlung von Schmerzen und Entzündungen, 2) die Bereitstellung...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microdialysis catheter	Tool	Dermal Dialysis	NA
Pump 22	Tool	Harvard Apparatus	552219
Saalmann Multitester SBB LT 400	Tool	Saalmann GmbH	NA
RM-12 IP-65 Radiometer	Tool	Dr. Grobel UV Elektronik GmbH	82120000/81112100
Complete Proteinase Inhibitor	Reagent	Roche Group	11836145001
Microcent tube	Tool	E&K Scientific	380150-X
Albumin 5%	Reagent	ZLB Behring	NA
Lactated Ringer	Reagent	Hospira Inc.	NA
Xylocaine-MPF	Other	AstraZeneca	NA
Syringe 1mL	Tool	BD Biosciences	309602