構造質量分析法によって大きなタンパク質複合体の分析

要約

質量分析は、大規模なタンパク質複合体を分析するための貴重なツールであることが実証されています。このメソッドは、マルチサブユニットのアセンブリの構成、化学量論と全体的なアーキテクチャへの洞察が可能になります。ここで、我々は、構造的な質量分析を実行し、巨大分子構造を特徴づける方法を、順を追って、説明します。

要約

生きている細胞は、制御し、動的な、多タンパク質複合体¹の配列に自分自身を組み立てる多数のタンパク質の協調行動を通じて、その生物学的プロセスを調節する。様々な細胞プロセスの機序を理解するために、そのようなタンパク質複合体の構造を決定し、それらの構造的組織がその機能を規定する方法を明らかにすることが重要です。多タンパク質複合体の多くの側面が、しかし、彼らの不均質な性質、非対称構造、及びダイナミクスのために、評価が難しくなります。したがって、新たなアプローチは、タンパク質の組織の三次レベルの研究のために必要です。

高分子複合体を分析するための新たな構造生物学のツールの一つは、質量分析^（MS）2-5です。このメソッドは、複雑なタンパク質組成物、サブユニットの化学量論、構造トポロジーに関する情報を得られます。 MSの消費電力は、結果、低いサンプルの要件として、これは内在性レベルで発現されるタンパク質複合体の検査を可能にする、その高感度から派生したもので、。もう一つの利点は、リアルタイムで反応のモニタリングを可能にする分析の速度、です。また、テクニックが同時に共存する混合物中の別々の集団の特性を測定することができます。

ここで、我々は、大規模なタンパク質のアセンブリの解析に構造的なMSのアプリケーションの詳細なプロトコルを記述する。手順は、ナノフローエレクトロスプレーイオン化（nESI）のための金でコーティングされた毛細血管の準備から始まります。その後、片手でnESIと互換性がある、と他の上にそのまま複合体を維持するために有効にする必要がありますバッファの条件を強調し、サンプル調製を続けます。私たちは、その後、高質量測定のための実験条件を最適化し、MSおよびタンデムMSスペクトルを取得する方法を、ステップバイステップで、説明する。最後に、我々は、データ処理と続く分析をグラフ化。むしろタンパク質のアセンブリのすべての側面を特徴づけるために試みるよりも、このプロトコルは、非共有結合複合体のMSおよびMS / MS実験のパフォーマンスを可能にする、基本的なMSの手順を紹介します。全体的に、私たちの目標は、主要な実験的なツールの知識と、構造的なMSの分野で面識のない研究者に提供することです。

プロトコル

パート1：ナノフローのエレクトロスプレーイオン化のための金でコーティングされたキャピラリーの調製

非共有結合複合体の分析は通常、（通常は金色）ファインチップ（〜1μmの内径）に引っ張られているガラスまたは石英キャピラリーを使用して、ナノフローのエレクトロスプレーイオン化の手段^（nESI）6によって行われ、導電性材料でコーティングされている。 ：しかし、それは社内でそれらを準備するために、より費用対効果の高いことができる。このような毛細血管には、既製使用するために商業的な供給源（新たな目標やProxeon）から入手できます。

1. 2センチメートル離れて、ペトリ皿の底に両面接着パッドの2つのストリップを貼り付けます。パッドの中心部にあり、ガラス棒（8センチ× 5 mmの）に置きます。粘着パッドは、場所に毛細血管を保持し、ガラス棒は、準備された毛細血管をサポートしている、と（図1）分割されるヒントを保持します。
2. （ない。G100TF - 4我々はワーナー音源から500薄肉ホウケイ酸毛細血管のパックを使用して、猫。）ホウケイ酸ガラス毛細管、1.0ミリメートル外径× 0.78ミリメートルのIDを使用してください。一針プラー（我々はサッターインストゥルメント（株）からのモデルのP - 97を使用）へのキャピラリ挿入します。場所で穏やかにキャピラリーをクランプし、それが針の引き手の加熱フィラメントの中心に横たわるように位置を調整。キャピラリーの両端がしっかり固定されるまで、静かにクランプを締めます。
3. 定義済みのプログラムを使用して、キャピラリーを引っ張る。プルごとにキャピラリーには2つの最終的な、形の毛細血管を生じさせるだろう。許容先端の形状が得られるまでプラープログラミングのプロセスは、試行錯誤の一つです。私たちは、次のプログラムを使用します。

   ステップ	熱	プル	旧港	タイム
   1	750	-	15	80
   2	700	-	15	50
   3	750	200	20	80

4. 測定器から引き出さ毛細血管を削除するとヒント、廃棄変形または破壊されているものを検査します。ペトリ皿の中で毛細血管を配置する、（私たちはCK精密からの測位ピンセットを使って）鈍ピンセットを使用してください。キャピラリーのベースは、接着パッドに接続する必要がありますし、上部には先端が上向きで、ガラス棒にもたれるはず。
5. （10cmの直径のディッシュに80毛細血管のフィット約）ペトリ皿が一杯になると、金にプレートを挿入するには、コーター（我々は、モデルを使用する。EMSからEMS550を、）スパッタ。ガスの供給が製造元の指示に従って選択されていることを確認し、5 × 10 ^-2ミリバール、45ミリアンペアの電流を、とのコーティングの時の真空圧力で事前定義されたコーティングのサイクルを（我々はアルゴンの圧力4 PSIを使用し、アクティブに1分は、3-6サイクルでは、毛細血管まで）均等に黄金です。

パート2：サンプルの準備

1. サンプルの低マイクロモル濃度は（ - 20μM1）必要とされています。必要に応じて、遠心式限外ろ過装置（例えば、ポールコーポレーションからザルトリウスからVivaspin、またはNanoSep）を使用してサンプルを濃縮する。それはあなたが使用する前に、デバイスの膜へのタンパク質複合体の吸着を確認することをお勧めします。
2. 多くの場合、タンパク質複合体の精製のバッファまたはストレージソリューションは、揮発性のソリューションを使用することのできるnESI、互換性がありません。したがって、バッファの交換が必要です。塩、バッファーの分子または例えばグリセロール、DTT、またはEDTAなどの他の不揮発性付加体のすべてのトレースが削除されているこの重要なステップは、スペクトルの品質を決定します。通常、水性酢酸アンモニウム溶液を5 mMと1 Mの間の濃度で、6〜8のpHで、使用されています。バッファの交換は、マイクロゲル濾過カラム（例えば、マイクロバイオスピンエンプティBio - Rad社から6クロマトグラフィーカラム）を使用して実行することができます。最大の交換が達成されるまでこのステップは、最小限の希釈（装置⁵あたり1.3倍未満）で1〜3回繰り返すことができます。濃度やバッファー交換の両方が必要な場合は、これらは遠心限外ろ過（E、G.、ザルトリウスからVivaspin、またはポールコーポレーションからNanoSep）を使用して、一緒に行ってもよい。

第3部：高質量測定用質量分析計のキャリブレーション

多タンパク質複合体で行われた実験のほとんどは、ナノエレクトロスプレー四重極 - 飛行時間型（Q - TOF）測定器を使用して実行されます。それはあなたが高いm / z値を^7,8とイオンの透過と質量分析を可能にするために、低周波数に調整四重極マスフィルタを使用することをお勧めします。それは、また、ガス導入口^7,8またはスリーブ^9が初の真空段階で圧力制御をイネーブルにするには、第1のイオンガイドに楽器を追加することをお勧め。後者は、伝送の最適化、および非常に大規模なイオンが^7-9の脱溶媒和が可能になります。現在、商業用ESI - TOFおよびQ - TOFの測定器は、ネイティブのMSのアプリケーション^7,8については、比較的容易かつコスト効率よく変更することができますいくつかのメーカー（例えば、ウォーターズ、SCIEX、ブルカー、またはAgilent）から入手できます。それが可能である、しかし、ハードウェアの変更⁵を必要とせず、1 MDAまでの複合体のためにマススペクトルを取得するなどLCTまたはQToF1（ウォーターズ）などの楽器に標準TOFまたはQTOF構成を使用する。

以下に概説するプロトコルは、SYNAPT楽器（ウォーターズ）を実施した。

1. 精製水でCsIの100 mg / mlの溶液を調製します。 CSIは、高質量の1価塩のクラスタなどのキャリブレーション、（CSI） _のnのCsのために使用されます⁺ 393からのm / zをはるかに超える10,000（図2）に、広い質量範囲にわたって。
2. 鈍ピンセットを使用して、エッペンドルフGeLoaderチップを使用して、ペトリ皿とはCsIソリューションの負荷2μlのからキャピラリーにコーティングキャピラリーを取る。
3. キャピラリーホルダーにキャピラリを挿入し、先端が離れてホルダーの端から約10mmになるようにキャピラリを調整する。
4. 手動でキャピラリーの先端に向かって解決策をスライドさせ、またはアダプタスピンダウンを使用。
5. 光学顕微鏡下でキャピラリーを置き、鋭いAA型ピンセットを使用して、先端部分を切り取ります。
6. ナノフローESのインタフェースへのキャピラリホルダーを接続してください。キャピラリーの破損を防ぐため、後方のxyzステージを回転させ、その活性化の位置にステージを押し込みます。キャピラリーは、1を配置する必要があります - 円錐のオリフィスから10 mm。
7. スプレーが開始されるまで、最小限の値にナノフローの圧力を軽減しようとし、キャピラリー電圧（1050から1400 V）と低ナノフローの圧力（0.00から0.03のバー）を適用します。
8. XYZステージの場所、キャピラリー電圧、ナノフローの圧力、および脱溶媒ガスの流量を調整することによって、信号強度を最適化します。
9. CsI​​のピークシリーズの広い質量範囲を検出するには、加速電圧が（：キャピラリー1.3から1.7 kVの、サンプルコーン80 - 150V、抽出コーン1から3 V我々は次のパラメータを使用する）最適化する必要があります。
10. ソースおよびアナライザの間に穏やかな脱溶媒の条件を必要とする高質量イオンの伝達、初期の真空段階での背圧を、最適化するため、調達すべきである。これは、部分的に遮断弁を（Speed​​iValve）閉じることによって、慎重にスクロールポンプにソースの真空ラインのコンダクタンスを減少させることによって達成することができます。信号強度（我々は通常3.0から6.5ミリバールを使用）への影響を監視しながら最適なポイントを定義するために、後者は実行する必要があります。
11. のm / zの15,000〜1,000〜のm / z範囲で、1スキャン/秒で約30スキャンを収集する
12. 買収後は、適切なキャリブレーションテーブルを使用してTOFをキャリブレーション。

パート4：無傷のタンパク質複合体のMSの分析

1. 、あなたのサンプルをロードするように説明（パート3、セクション2-5）、およびスプレーを開始する。
2. 信号が検出されるまで、スプレーの初期化（パート3、セクション6-9）ことから始めます。充電状態の正確な位置は、蛋白質に依存ですが、これは次のように、イオンの質量と平均電荷の状態との関係を用いて、予測することができます：（Z ^AV）10：Z _AV = 0.0778√（M）、ここでMダルトンの複合体の質量です。複雑な解離を防ぐために、イオン源を加熱しないでください：どちらかのヒーターをオフに切り替える、または40未満の温度を保つ℃を
3. キャピラリーの位置、サンプルコーンとイオンの透過を最大にするために抽出電圧を変化し、スペクトルの結果の変化を確認してください。 1 V、キャピラリー電圧1.5 kVの：抽出コーン、可能な出発点は、コーン電圧100 Vである可能性があります。ナノフローの圧力との組み合わせで、これらのパラメータを最適化する。
4. 脱溶媒和を向上させ、残留水や緩衝液成分を取り除くために、バイアス電圧とコリジョンセル内のガス圧を増加させる。このステップは、複合体の解離を防ぐために、慎重に行う必要があります。典型的なバイアス電圧は1〜10 ml /分（図3）のトラップのガス流量で10〜100 Vの範囲内である。 RFの設定と四重極プロファイルの手動調整は、高質量イオンの伝達が改善されることがあります。
5. トラップおよび転送の衝突エネルギーを調整する。多くの場合、高い電圧が高質量イオン（通常は10〜30 Vの範囲内）の伝送に必要とされています。この時点で、複合体の衝突誘起解離を避けることが大切です。
6. 安定した信号はRの後にeached、それは安定したスプレーを維持しながら、ナノフローの圧力やキャピラリー電圧は、最小の値に減少することをお勧めします。

第5部：タンデム質量分析法：解離のタンパク質複合体

1. 最適かつ安定した信号を取得した後、前駆イオンを選択します。質量中心と分離幅を設定する（我々は一般的に12のLMの解像度、および13〜15のHMの解像度を使用）。高質量/低チャージ解離製品を検出するための広い質量範囲を使用してください。それはあなたが最大レベルにm / z範囲を設定し、目的の値にそれを軽減することをお勧めします。我々はさらに、選択したプリカーサイオンの分離を検証するために、MSおよびMS / MSスペクトルを重ね合わせることを示唆している。
2. MS / MSを実行するには、コリジョンセルの衝突エネルギー（CE）と圧力を増加させることにより前駆体イオンを解離する。 10 - 20Vのステップで、徐々にトラップまたは転送CEのどちらかを増やし、0〜5ミリリットル/分（一般的な値）に衝突ガスの圧力を上昇させる。最適な活性化の条件に達するまでのスペクトルの変化を監視します。高い活性化エネルギーは、そのまま複雑なから一つ以上のサブユニットの解離を誘導し、異なるサブユニットの相互作用の親和性を明確にすることがあります。重いガス（例えば、Xe又はSF _6）を使用することの利点が報告されているものの、我々は一般的に、トラップ/転送細胞の衝突ガスとしてアルゴンを使用しますが、これらのガスは、実質^11（図3）高価なものです。
3. それは複数の電荷状態がMS / MS分析用に選択することをお勧めします。重複するコンポーネントの場合には、タンデムMSスペクトルの集合を取得すると、異なる集団の電荷の一連の解決を支援します。また、より高い電荷状態がより低い電荷状態¹²に比べて、より容易に解離する。
4. 無傷の複合体の特性評価に加えて、それは穏やかな変性条件下で、溶液中で小さくsubcomplexesが生成されることが示唆された。 subcomplexesのMSとMS / MS分析では、複雑な¹³のサブユニットのアーキテクチャを定義するための基礎を形成する。サブユニット - サブユニット間相互作用の部分的​​な崩壊のために、徐々に50％濃度になるように有機溶媒（例えばメタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリル）まで追加、または最大4の濃度にアンモニアまたはギ酸を（追加することにより、溶液のpHを変える％）。
5. コンプレックスを構成する個々のサブユニットの質量を決定するために、それは、変性条件下でスペクトルを取得することが重要です。これは、溶出溶媒として1％ギ酸で、ジップヒント25:75水/アセトニトリル比とC _{4（Millipore）}を用いて行うことができます。

パート6：データ処理と解析

1. データはMSスペクトルのスペクトル解析プログラムを使用して、オフラインで解析されます。我々は通常、MassLynxプログラム（ウォーターズ）を使用します。
2. 幅広いm / zの範囲にまたがるスペクトルでは、これらの領域のピーク分解能の違いを反映するために、平滑化と重心パラメータの異なる方式がハイとローのm / zの地域に適用されることをお勧めします。
3. 充電のシリーズを識別し、充電状態と質量を計算するには、MassLynxの"取扱説明書が見つからない"機能を適用することができます。重複するコンポーネントを持つ複雑な質量スペクトルのケースでは、大衆の手動計算は簡単かもしれません。
4. これらの割り当てプロセスを容易にするために、追加のソフトウェアを使用することができます、例えば：スペクトルのデコンボリューション^14、ピークフィッティングやシミュレーション¹⁵ SOMMS、およびタンパク質のsubcomplexesの組成と化学量論を割り当て、タンパク質相互作用ネットワーク^13,16,17を生成^するためのサミットのMAXENT 。

パート7：代表的な結果

図1。金でコーティングされたナノエレクトロ毛細血管の準備。
A.は2cm離れて、ペトリ皿に2つの両面粘着ストリップを取り付けます。準備毛細血管をサポートするために、B.は、接着パッドに準備した毛細血管の平滑末端をスティック。パッドの一つの中心にガラス棒（8センチ× 5 mmを）置き、ガラス棒で先端に傾く。金の薄膜を均一に毛細血管の外表面上に堆積されるまで、C.は、一度ペトリ皿は、金でコーティングして、準備した毛細血管が充填されている。

図2。ヨウ化セシウムイオンを用いて高質量キャリブレーション。
CsI​​の大とmonisotopicクラスタは、その高質量分析用質量分析計を校正するための選択の化合てきた。等間隔の一連のピークは m / z 393からも1万人以上に、広い範囲にわたって。彼らはassigされています一般的な組成（CSI） _のnのCs ⁺の1価塩のクラスタに定義さ。主要なピークの間に追加の信号は、シリーズのダブルとトリプル荷電種によって引き起こされる、[（CSI） _のn CS2] ^{2 +}と^{3 +、}それぞれ[（CSI） _のn CS3]。初期の真空段階での圧力を増加させると高質量のクラスターを検出するために不可欠です。高質量ピークに対する圧力の効果は、パネルに示されています。 AとB。それぞれ1.2、5.3、の圧力のリードバックを持つ。C。 Bで示すように、質量スペクトルの拡大。

図3。五量体レクチンのナノフローエレクトロスプレー質量スペクトル。
レクチンバリアントの複雑なのA.マススペクトロメトリーは、（方向進化¹⁸によってLIB1 - B7から派生）3,000〜5,000 m / zの間の電荷状態の分布を生じさせるが、イオンの不十分な脱溶媒和による、ピークは広いです。パネルA.とB.の比較は4V（。）から15V（B）ピーク幅上にバイアス電圧を増加させる効果を示す。加速条件におけるこの増加は、高度に分解スペクトルをもたらし、残留水とバッファー成分の除去を引き起こす。測定された質量（60240 ± 38 Da）は、五量体複合体に相当する。C. 15の充電状態がその後、タンデムMS分析（パネルBに灰色で陰影が。）Dに選ばれた。衝突エネルギーの増加は、5,000の範囲で、1664メートル/ Zを中心とする高度に帯電したモノマー、およびストリップ四量体の放出を引き起こす - 8000メートル/ Z.すべてのスペクトルは、0.5M酢酸アンモニウムの溶液20μMを含むサンプルから得られた。

ディスカッション

高品質のスペクトルの注目を獲得するためには、サンプルの濃縮およびバッファー交換を含むサンプル調製のステップ、に与えられるべきである。希釈した試料を介して高濃度のサンプルはかなり粘性である場合もある一方、低信号を得、そしてエレクトロスプレーニードルをブロックします。また、このような塩、グリセリン、界面活性剤、金属イオン、及び還元剤（DTTまたはβ-メルカプトエタノール）のようなソリューションの添加剤は、タンパク質の外表面に付着する傾向があり、ピークの拡大原因。そのため、十分に解決さのピークを達成するために、これらのコンポーネントは、可能な限り最も低い濃度で添加する必要があります。

もう一つの重要なパラメータは、質量分析計のオリフィスからの相対キャピラリーナノフローの位置、です。 "スイートスポット"を見つけることは、経験の浅いユーザにとっては困難な場合があります。それにもかかわらず、それが大幅にスペクトルの質に影響を与えます。ナノフロー前スプレーの開始にキャピラリーを調べることも重要です。液滴のサイズは〜1μmのあるべき先端径の関数である。小さな液滴はより効率的なイオン化を招くため、有利である。それは、買収時の流れをブロックする可能性がある、とゴールドコーティングが毛細血管から除去されていないことをキャピラリー内に気泡がないことを検証するためにも重要です、その場合、さらに先端をトリミング。サンプル量が過剰となり、電圧、圧力、および衝突エネルギーを加速、このようなキャピラリー電圧などのMS条件の最適化の可能性を高めることに留意してください。

全体的に、プロトコルで説明される手順は、多数のタンパク質複合体（レビュー2,3,4を参照）の組成、化学量論およびアーキテクチャを判別するために使用されている。など¹⁹リボソームと高度に秩序化されたウイルスキャプシド^20から22のような大規模なMDAの複合体の解析、分子機械^23-25、またはサブユニット相互作用ネットワークの特性評価^{26,17,16,17,27,28}に結合する基質を定義するとしてしかし、このアプローチの価値のほんの一例。

資料

サンプル	要求	コメント
ボリューム	1〜2μL	キャピラリー当たり
濃度	1 -20μM	複雑な当たり
バッファ	例えば、pH = 6での酢酸アンモニウムのようなAquanos揮発性バッファー - 8	通常5 MM - 1M
洗剤	最小	界面活性剤分子のクラスターは、広範かつ未解決のピークを生じる
グリセロール	最小限の（最大5％）	非特異的にタンパク質に付​​着し、その結果として、ブロードなピークが観察される
有機溶剤	最大50％	タンパク質の複合体を変性させる可能性が
酸	最大4％に	変性タンパク質複合体
塩	最小	塩付加体は、広範かつ未解決のピークにつながる
DTT	最小	1〜2μmが存在することができる
キレート剤	最小	250μMを超える大規模な付加体の形成につながる