成体マウスの心筋細胞の単一細胞転写プロファイリング

要約

単一細胞の発現プロファイリングは、個々の細胞の詳細な遺伝子発現解析が可能になります。我々は心筋細胞の単離のための方法を説明し、特定のターゲットの全トランスクリプトームのマイクロアレイや定量PCRのどちらかの結果のライセートを調製した。

要約

多くの研究は、心臓組織のホモジネートからの遺伝子発現の変化を検討してきたが、これは組織内の細胞間の固有の確率的変動を研究する防ぎます。マウスの心臓のコラゲナーゼ灌流を通して純粋な心筋細胞集団の分離は、全トランスクリプトーム遺伝子発現、またはナノ流体アレイを使用して特定のターゲットの定量PCRのための単一細胞マイクロアレイの生成を促進する。ここでは、心臓から単離された心筋細胞の単一細胞の遺伝子発現プロファイルを調べるために手順を説明します。このパラダイムでは、遺伝子発現の評価（図1）ため、従来の全組織のワークフローを使用する場合は不可能である（組織内の細胞の間に例の分散のための）意味に依存していない関心のメトリックの評価することができます。我々は、iのマイクロアレイの利用を促進する二本鎖cDNAの単セルのトランスクリプトーム収量マイクログラムの堅牢な増幅を実現していますndividual細胞。手順では、使用すると、そのデザインをカスタマイズする機能の容易さのために選択されたNimbleGen社配列を使​​用する方法を説明します。また、逆転写酵素 - 特定のターゲットの増幅（RT - STA）反応は、ナノ流体PCRによるターゲットの数百の定量PCRが可能になります。これらのアプローチのいずれかを使用して、それは細胞間の発現の変動だけでなく、組織内から珍しい種類の細胞の発現プロファイルを調べることを検討することが可能です。全体的に、単一細胞の遺伝子発現のアプローチは、潜在的に全体の組織から生成される典型的なホモジネートから細胞の数百万の発現を調べるときに典型的に平均化されている特異な発現プロファイルを識別できるデータを生成することができます。

プロトコル

1。ステップ1 - 心筋細胞の分離

1. 次のように消化のバッファを準備します。
   10 ×の消化緩衝液（超純粋なH ₂ Oで行われた）

   	最終濃度。	G / L	g/500 mLの	10x溶液g / Lの
   NaClを	130mMの	7.597	3.3	75.97
   塩化カリウム	5mMの	0.4	0.2	4.0
   ピルビン酸	3nmの	0.33	0.165	3.30
   HEPES	25 mMの	5.96	2.85	59.6
   MgCl 2の	0.5mMの	0.101	0.05	1.01
   のNaH 2PO 4monobasic	0.33 mMの	0.04	0.02	0.40
   デキストロース	22 mmの	3.96	1.98	39.6

   
   NaOHで7.4にpH緩衝
2. 10倍の消化緩衝液を使用して、（超高純度H ₂ Oで行われた）灌流されるそれぞれの心に次の4つのソリューションを行います。

消化バッファ（このソリューションの三アリコートを作る）

• 50 mLの - 1X消化緩衝液を含む：
  • μL75 - EGTA溶液（100mMのEGTA）

消化バッファーB（これらのいずれかを確認）

• 25 mLの - 1X消化緩衝液を含む：
  • 1.25μL - CaCl ₂溶液（1 M）
  • 1ミリグラム - プロテアーゼ
  • 25mgの - コラゲナーゼ（約Nも**この金額= 18.75 mgの75％）を使用してください

収集バッファ（これらのいずれかを確認）

• 2.5mLの - 1X消化緩衝液を含む：
  • 1.25μL - CaCl ₂溶液（1 M）
  • は0.5 mg - プロテアーゼ
  • 15mgの - コラゲナーゼ（75％= 11.25 mg）を**
  • 125 mgの - BSA

中和洗浄バッファー（これらのいずれかを確認）

• 25 mLの - 1X消化緩衝液を含む：
  • 6.25μL - CaCl ₂溶液（1 M）
  • 250mgのBSA

**ソースとコラゲナーゼのバッチ処理に応じて、酵素活性は異なる場合があります。それは、過剰消化を防ぐために、このバッファに追加された酵素の量を最適化する必要があるかもしれません。

3. 前述のDで説明されているアイソレーションシステムを設定する氷上で消化緩衝液の三15 mLのビーカー、消化緩衝液の1つの50 mLの試験管と25mLの消化バッファーB（灌流のための準備ができて消化緩衝液5 mLの最小値で、回線を介してフラッシュする必要があると^1,2を etail ）システムを介して実行、コレクションのバッファは37℃を温度を上げるために水浴、そして室温で中和洗浄バッファーに加温した。
4. 心臓がカニューレの上部の周囲に結び目疎コールド消化緩衝液Aでいくつかの縫合（4 - O 6 - Oのサイズを）洗浄し、血流の先端に結ばれる灌流カニューレと解剖皿を埋める。これは、後のカニューレを滑り落ちる心臓を防止するために大動脈を保持するために使用されます。
5. 末期落ち着いた麻酔剤（0.25 mLのペントバルビタールナトリウム液）のIP注射でマウスとマウスを確保するためには、無意識と痛みの刺激に応答しなくなります。横隔膜をカットして胸部縁に沿って慎重に胸腔を開いてカット（図2）。上方に上方カットと（これらの切開は、図2にそれぞれA、Bと指定されている）前方胸郭を反映する重要な - 。マウスはまだこれらの切開の前に呼吸する必要があります。
6. 大きさにカットプラスチックのピペットを使用して、静かにピペットに心を吸う。明らかに大動脈の枝（図3）を識別するために、心臓に十分な大動脈のを残すように注意して胸腔の心臓を切り取る。それが心臓に与えるダメージを最小限にして生じるので、ピペットが使用されます。
7. 氷冷消化緩衝液のいずれかのビーカーに心臓をドロップすると離れて血を洗い流してください。 15日以降に - 45秒で簡単に再リンスに氷冷消化緩衝液の第二のビーカーに心を置く。また、コールド消化緩衝液Aで満たされたペトリ皿に心を移し
8. 解剖の範囲で消化緩衝液の皿の中で心臓を表示し、慎重に大動脈とその枝を分離。慎重に最後のbrancにだけ劣っトリムH（図4）。
9. 大動脈にカニューレ先端を取り付け、解剖顕微鏡下のステージのセットアップを使用して6 - Oの縫合糸に4 - Oとの場所にライゲーション。カニューレは、大動脈内低すぎる座って、冠状動脈（図4）の上に残っているしていないことを確認してください。
10. 消化緩衝液灌流セットアップを流れると、セットアップへの血流の先端を配置し、そして血液の大部分は心臓がクリアされているままの心と流体から洗浄されるまで、心臓を灌流し始める。クリティカル - 灌流液の温度は37にできるだけ近いでなければなりません° Cそれがカテーテルから出てくる時。ソリューションが高すぎたり低すぎたりの場合、血流が組織を殺すのだ。心臓の灌流までの時間も重要です。血流が始まるまでの時間ウィンドウは、心臓の除去から5〜10分未満でなければなりません。心臓は₂接辞や頸椎脱臼がCOしない、麻酔下で除去する必要があります。
11. 一度血がされています心臓からのHEDは、消化緩衝液Aから消化バッファBへの切り替えは、消化緩衝液Bは現在、心臓を流れていることを確認してください。溶液は黄色色合いを持ち始めるでしょう。心臓がその形を失うの兆しを示し、消化が動作していることを示している丸めて見え始めるまで、2〜3分待ってください。心筋は血流が進むにつれて明るく表示されます。
12. 37コレクションバッファー15mLを含む50mLのコニカルチューブにハサミと場所によって心室を切断℃にコレクションのバッファに組織を配置しながら、ゆっくりと小さな断片に心室をカット。細胞間接着を溶解し、単一細胞の心筋細胞の混合物を作るためにプラスチック製のピペットで軽く混ぜる。
13. ほとんどの組織のが解散されたときは、（1分以内）大きな組織片が底に沈むことができます。 15 mLコニカルチューブに上清を除去して保存する。重力は10〜20分（15歳以上の上清からペレットを引っ張ってみましょう分は、室温で）が好ましい。
14. 削除し、上清を捨てる。ペレットに中和洗浄バッファーの5mlを加え、穏やかにそれらを再懸濁するために細胞を混ぜてペレットを洗浄します。この時点で、細胞は単一細胞解析（ステップ2に進む）に選択される、すぐに準備が整いました。

2。ステップ2 - 単一細胞の単離

1. 炎と細胞を操作するために使用されるガラス毛細管を使用してマニピュレータを準備します。マニピュレータは、単にその後、吸引が適用されるときにセルを移動または拾うことができるフレキシブルチューブの長尺に取り付けられている非常に細いキャピラリーチューブです。
2. すぐに引っ張らピペットおよび単一細胞試料のサンプルに転送されるから材料を防止するためのエアロックを使用して作成されたマイクロマニピュレーターを用いて顕微鏡（ニコンのEclipse TS100、20倍）下で個々の細胞の選択に進みます。細胞集団が正常であることを確認してください（70％生存）と分離プロセスから損傷がないこと。
3. それらは個別に選択できるように、小さなシャーレに細胞を希釈する。ときにピッキング細胞は少量（2未満μL）で細胞を捕捉するようにしてください。独特の正常な心筋細胞の形態（図5）を持っている唯一の健康な細胞を選択してください。
4. 個々のPCRチューブの底に個々のセルを配置し、直ちにドライアイスで、それらを凍結する。彼らは遺伝子発現解析のために使用されるまで、これらの細胞は、-80℃で保存されています。

3。ステップ3A - 単一細胞の定量PCR遺伝子発現

（ -アドバンス開発のプロトコル＃30フリューダイム^）3,4つのセルで定量PCRを実行するには、そのBiomarkナノ流体定量PCRアレイ用のフリューダイム株式会社によって単一細胞の遺伝子発現のために開発されたものから適応プロトコルを採用しています。

1. 特定のターゲットの増幅（RT - STA） - 逆転写の準備。になるまでジンは、1X DNA懸濁液のバッファーに100μM（10 mMトリス、pH 8.0、0.1mMのEDTA）で、目的の遺伝子のために（我々が正常に125のプライマーペアを使用している）全てのプライマーペアを再懸濁します。組み合わせると、さらにそれぞれのアッセイのための20μMに順方向および逆方向プライマーのペアを希釈する。最後に、RT - STAの反応で増幅される各アッセイのための200nMの最終濃度で1つのソリューションに全てのプライマーペアを希釈する。これを行うには、それぞれのプライマー対を取り、それらを1:100に希釈する。あなたが、20μMで30アッセイプライマーのペアを持っている場合たとえば、あなたはそれぞれのペア（30μLの合計）の1μLを追加する必要がありますし、最終的に到達するDNA懸濁液のバッファの70μLとボリュームの残りの部分を構成する100μLの希釈量。
2. プライマーの溶液を調製しているので、RT - STAの反応マスターミックスを組み立てます。あなたが増幅する個々の細胞のそれぞれのための十分なマスターミックスを調製する。

   試薬	μLの体積（あたり反応）
   2倍の反応ミックスをCellsDirect	5.0
   スーパースクリプトIII RT Plantinum Taqポリメラーゼミックス	0.2
   RT - STAのプライマーミックス（200 nMの各アッセイ）	2.5
   ヌクレアーゼフリーH 2 O（または1x DNA懸濁液のバッファー）	1.3
   総	9.0

   表1。RT - STAマスターミックス
3. すぐに細胞がチューブの底に配置されていることを保証するために30秒間最大RCFで凍結細胞と遠心を取り外します。チューブにRT - STAミックスの9μLを追加し、サーマルサイクラーで反応に進んでください。
   1. 50 ° C - 15分
   2. 95 ° C - 2分
   3. の18サイクル
      1. 95℃15秒C
      2. 604分° C
   4. 4℃ホールド° C
4. PCRマシンからチューブを取り外し、反応するExoSAP - ITの4μLを加える。 ExoSAP - ITは、RT - STAの反応からの過剰なプライマーおよび酵素を除去されるPCRクリーンアップ用試薬です。 PCRマシンで以下の反応を介してチューブを実行します。
   1. 37℃ - 15分
   2. 80 ° C - 15分
   3. 4℃ホールド° C
5. ExoSAP - IT処理が完了すると、DNA懸濁バッファーでサンプルを1:5に希釈する。サンプルは定量PCR分析のために調製されています。我々は、フリューダイムの遺伝子発現の定量PCRアレイ（48.48、または96.96プレート）と一緒にこの素材を使用。それは、より伝統的な定量PCRインスツルメンテーション（96ウェルまたは384ウェルフォーマット）でこのアプローチを使用することも可能です。しかし、これらの機器は、通常のpできるアッセイの数を制限する多くのサンプルの入力が必要です単一の細胞からerformed。

3。 3Bステップ - 単一細胞の全トランスクリプトーム増幅とマイクロアレイを

抽出と増幅

1. ペレットと単一細胞の両方からの二本鎖cDNAを増幅するために、シグマのWTA2キット（カタログ番号WTA2）を使用してください。単一の細胞は、製造元の指示に従って、シグマのWTA2プロトコルの最初のステップを経由して"抽出"されています。この最初のステップの間に37ライブラリー合成のバッファとのインキュベーション℃で5分間は、単一細胞と"抽出"を増幅するためのメッセージの膜を破壊する。
2. シグマアルドリッチのWTA2キットからの指示を使用して、2ラウンドで単一細胞を増幅する。製造業者のプロトコールに従って、ライブラリ準備のステップを実行し、その後WTA2増幅の70μLにライブラリのサンプルの1 / 5を追加
   マスターミックス。推奨サイクリングパラメータを用いて25サイクルのサンプルを増幅する。
3. サンプルUSIを清めるngのキアゲンのQIAクイックPCR精製キット（カタログ番号28104）と"クリーンアップQIAクイックPCR増幅反応の標準V4"プロトコルを使用してQiagenのQiacube上のプロセス。
4. 速度の真空を使用して、5μLに精製したサンプルを集中し、17サイクル（WTA2増幅プロトコールとサイクリングのパラメータを繰り返す）の増幅の第二ラウンドを通して置く。
5. QIAクイックPCR精製キットを使用してサンプルを精製し、メーカーのプロトコルに従って光度計分光光度計とアジレントのバイオアナライザDNA 7500キットを使って品質を確認してください。

ラベリングとNimbleGen社の遺伝子発現アレイ

6. 製造業者のプロトコルに従ってNimbleGen社のワンカラーラベリングキット（カタログ番号05223555001）を使用してそれぞれの増幅細胞のサンプルから二本鎖cDNAを二重のラベル2μgの。
7. ハツカネズミ 12x135k、NimbleGen社遺伝子発現アレイ（カタログ番号05543797001）ACCにCy3標識サンプルの5μgをハイブリダイズ製造者のプロトコールにオーディング。それらはレーザースキャナで画像化することができます前に、配列へのサンプルのハイブリダイゼーションの後、スライドを洗浄し、乾燥させる。
8. レーザスキャナを用いた遺伝子発現アレイをスキャンします。ここで、我々は、モレキュラーデバイスGenePix 4200Aの100POWの設定でスキャナ、および300 - 350PMTを使用してください。その後NimbleGen社のNimbleScanソフトウェアを使用して、各配列のペアのファイルを生成し、その後、各単セルアレイから（典型的な安定に発現心筋細胞転写産物のテーブルが補足として含まれている、表S1）全トランスクリプトーム発現に分析する。

心臓の血流がよく働いていた場合、分離の際、典型的な長方形の形態を維持する健康な心臓の細胞の割合が高いがあるはずです。血流がうまく進行しなかった場合には、死細胞の割合が大きい（図5の画像を参照）が存在します。細胞が正しくWTA2またはRT - STAのメソッドのいずれかを用いて増幅している場合nの最終製品は、光度計とBioAnalyser（図6）によるmRNAサンプルの品質のために、その後の品質管理テストを渡す必要があります。マイクロアレイのワークフローでは、これはmRNAの光度計とバイオアナライザの両方でテストされているWTA増幅の後に完了する。この分析のための代表的な正の結果を図6に示されています。 WTA2サンプルは、光度計分光光度計の読み取りだけでなく、バ​​イオアナライザ（BA）チップ（図6）からの電気泳動図の読み出しの両方で堅牢な増幅を示す必要があります。安定して単一細胞のマイクロアレイによって検出された遺伝子のテーブルは、例（表S1）として含まれています。定量PCRプロセスの場合は、データの品質は、プライマーセットは、所望の生成物（図7）を増幅していることを保証するためにPCR反応の終了時に溶融工程を実施することにより評価することができる。正しい場合、この溶融ステップは、1つの特定の融解ピークを生成する必要があります。この点を説明するために、ナノ流体定量PCRのデータのサブセットがピーク溶融tのヒートマップに示されていますemperature（図^8）8。非特異的な製品⁵の不在を確保するために、その溶融温度でPCR産物の品質を評価することが可能です。このマップの各行は43別のqPCRアッセイ（A1 - A43）でテストされた一つの細胞のサンプル（S1 - S40）を表します。この図では、それはいくつかのアッセイは、非常に可変であり、より高いPCR特異性を有する、より安定したアッセイよりも、おそらく信頼性が低いことは明らかである。

図1単セルの単離と遺伝子発現解析の概要。手順は、マウスの心臓の外科的切除と、個々の心筋細胞の分離のデモンストレーションを行います。この手順で説明した方法は、全トランスクリプトーム増幅（WTA）の後に定量PCRやマイクロアレイ解析のいずれかの方法が挙げられる。 WTAの手順は、シグマのユニバーサルプライマーの結合（​​B）mRNAに溶解（）で始まり、プール。これらのプライマー（C）と増幅（D）相の延長は、増幅された材料のマイクログラムを作成します。この増幅は、マイクロアレイの手続きのための十分な材料を生成する（E）繰り返されます。

図2マウスから心臓を削除するには、切開の位置の表現。胸郭の側壁（）に沿って切断して、胸郭の下縁（B）に沿ってカット。それでも心のカニューレを挿入するのに十分な大動脈のを残しつつ、上記と心臓下血管をカットすることは取り外しが可能になります。画像はMJクック⁶から適応。

図3マウスの胸部の図。点線は、hを損傷することなく、胸腔から心臓を摘出のために切開（A）の位置を示している eartの組織。画像はMJクック⁶から適応。

図4大動脈弓とその枝のイメージ。灰色の線は、大動脈を（）トリミングする場所の理想的な位置を示している。心臓に接続されている残りの大動脈カニューレ（B）の先端が大動脈内の適切なレベル（C）になるようにカニューレを挿入される。画像は、F.ガイヤール⁷から適応。

図5。遺伝子発現解析のための単一細胞の選択。各パネルには、心筋細胞の典型的な形態を示す光学顕微鏡イメージング心筋細胞を示しています。健康な心筋細胞は、緑色の矢印で示されます。死んだか死んでいる細胞は、赤の矢印で示されています。これらの死細胞は、分析では使用しないでください。

iles/ftp_upload/3302/3302fig6.jpg"altが="図6"/>
図6。単セルの増幅のための品質制御WTAの結果。 WTAの反応から増幅された転写産物に適した光度計分光光度計の読み出しの（）のイメージ。 （B）バイオアナライザのチップからの読み出しは、次の3つの増幅された細胞からの結果を示しています。

図7。定量PCRの増幅曲線（左図）とピークは、温度曲線（右図）を溶かす。 （A）品質の分析から、式の結果は、異なる増幅曲線にもかかわらず、単一の融解ピークが示されています。 （B）の発現解析のための理想的ではない非常に可変溶融ピークを持っている貧しい人々のプライマーセット、のカーブを溶かす。

図8。単セルの定量PCR反応させるための品質管理結果をイオン。このヒートマップは、カラースケールなどの溶融温度を表示するために作成されました。各定量PCRアッセイ（A1 - A43）のピーク融解温度は、40個のセル（S1 - 40）のために示されています。アッセイは、その溶融温度応じてクラスタリングされた。各アッセイのための列を下に見ることによってそれは変化がすべてのサンプル間の溶融を確認することが可能です。この図は、他人の変動が大きいため、単一細胞解析に適していない間に、いくつかのqPCRアッセイは非常に特異的であることを示しています。

表のS1。 マイクロアレイのデータの補足テーブル。これらの遺伝子は、それらが大規模なデータセット間で、単一心筋細胞で検出された堅牢性に応じて表示されます。この遺伝子リストは通常​​、単一心筋細胞に発現する遺伝子の数の検出の感度を示している。

ディスカッション

このメソッドは、機能の数だけでなく、遺伝子発現研究のための心筋細胞を生成する可能性があります。単一細胞の検査は、遺伝子発現解析で急成長領域です。単一細胞のレベルでの転写レベルを調べることの利点は、全体の組織調製物から可能ではない純粋な細胞集団の検査を、できることです。さらに、単一細胞の分析は、以前に^8,9均質であると考えられていた細胞集団を定義するために個々の細胞におけるmRNAレベルの確率的変動の検討が可能になります。それらの遺伝子発現^10,11,12で潜在的に確率的な遺伝子を同定に加えて、この方法はまた、それらの遺伝子発現プロファイルで定義されている希少細胞集団の同定が可能になります。

このメソッドは、遺伝子発現解析でエキサイティングな潜在的な用途の数を提供する一方で、SOMがあります単一細胞の使用中の電子の注意点と考慮事項。単一細胞解析の主な制約は、例えば分散のために、関心のメトリックに関しては統計的有意性を達成するために実験に十分な細胞の集まりです。関心の組織から単離された細胞の数が制限されていない場合は、いずれかがこのような次世代シーケンシング、またはナノ流体アレイなどのアプローチを使用して、グループごとに細胞数百を調べることができます。しかし、いくつかのケースでは、関心の組織からの十分な細胞を得ることが困難があるかもしれません。これは、部分的に標的細胞のタイプの収集のための特異な時間集約的な手続きによって引き起こされる場合があります。しかし、単一のセルのコレクションを進めるために慎重な計画と事前の準備はまだ限られた技術的なエラーと厳密な単一細胞解析のためにできる可能性があります。結果を検査する際には、細胞を単離するために、この手順は、多数のstudieで使用されているにもかかわらずこと、を考慮する必要がありますsは（顕微鏡、電気生理学、等を含む）、分離自体は潜在的に遺伝子発現に影響ことができます。生物学的サンプルを操作する任意のメソッドと同様に、あなたの調査結果の結果は慎重に、単一細胞の発現を確実に検証しなければなりません組織自体ではなく、技術的なバイアスの代表です。このようなin situハイブリダイゼーションなどのメソッドは、無傷の組織でこれらの結果を検証するために有用であろう。最後に、生成されたデータは慎重に品質管理のために選択されていることを確認することが重要です。図8に示すデータは、qPCRアッセイはそのようなアッセイ＃13（A13）として、その特異性に非常に堅牢であることまたはそのようなアッセイ＃34（A34）のような技術的な分散につながることができる可変性の高いレベルを持っている可能性があることを示しています。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬の名前	会社	カタログ番号	コメント
NaClを	シグマアルドリッチ	71378
塩化カリウム	シグマアルドリッチ	60128
ピルビン酸	シグマアルドリッチ	P4562
HEPES	シグマアルドリッチ	54457
MgCl 2の	シグマアルドリッチ	M1020
のNaH 2 PO 4一塩基	シグマアルドリッチ	P9791
デキストロース	シグマアルドリッチ	G6721
NaOHで	シグマアルドリッチ	72068
EGTA	シグマアルドリッチ	O3777
CaCl 2で	シグマアルドリッチ	21115
プロテアーゼ、タイプXIV	シグマアルドリッチ	P5147
コー​​ラgenaseは、タイプI	ワージントン	C9891
1XのDNAのSuspension Buffer（10 mMトリス、pH 8.0、0.1mMのEDTA）	TEKnova、	PN T0221
BSA	シグマアルドリッチ	B8667
ペントバルビタールナトリウム	ヘンリーシャインの獣医。供給*	発注するときはサプライヤーにお問い合わせください	*獣医師や実験動物専門家を通じて調達する必要があります。
ITをExoSAP	アフィメトリクス/ USB	78201
2倍RXNミックスをCellsDirect	インビトロジェン	11737-030
スーパースクリプトIII RTプラチナTaqポリメラーゼミックス	インビトロジェン	10928-042
RT - STAのプライマーミックス	IDT	カスタム
ヌクレアーゼフリー水	シグマアルドリッチ	W4502
WTA2	シグマアルドリッチ	WTA2 - 50rxn
QIAクイックPCR精製キット	キアゲン	28104
Qiacube	キアゲン	9001292
光度計分光光度計	光度計	2000C
バイオアナライザDNA 7500キット	アジレント	7500キット
Oneカラーラベリングキット	ロシュ、NimbleGen社	5223555001
ハツカネズミ12x135kの配列	ロシュ、NimbleGen社	5543797001
GenePix 4200Aスキャナ	分子デバイス	4200A
TransPlex完全に全トランスクリプトーム増幅キット（WTA2キット）	シグマアルドリッチ	WTA2 - 50RXN