セルの剛性を推定するために基板に接続された細胞のマイクロピペット吸引

要約

ここでは、セルの剛性を測定するために迅速かつ簡単な方法を説明します。このアプローチの一般的な原則は、細胞表面にマイクロピペットを介して適用、明確に定義された負圧に応答して膜の変形を測定することです。この方法は、基板に接続された細胞の生体力学的特性を研究するための強力なツールを提供します。

要約

研究の数が増え、個々の細胞の生体力学的特性は、細胞の増殖、分化、移動および細胞間相互作用を含む複数の細胞機能において重要な役割を果たしていることを示している。細胞のバイオメカニクスの2つの重要なパラメータは、細胞変形や剛性と力を収縮し、生成する細胞の能力である。ここでは、細胞表面にガラスマイクロピペット、マイクロピペット吸引またはMicroaspirationと呼ばれる技術によって適用された負圧に応じて、膜変形の度合いを測定することにより、セルの剛性を推定するために迅速かつ簡単な方法を説明します。

Microaspirationその後、空気圧トランスデューサに接続されており、近くに持って来られる、非常に小さなチップ（細胞または組織サンプルの大きさに応じて2から50μmの直径）でマイクロピペットを作成するためにガラスキャピラリーを引っ張ることによって行われます顕微鏡下で細胞の付近。時ピペットの先端が細胞に触れると、負圧工程は、細胞膜上の明確に定義された圧力を発生させる空気圧トランスデューサによりピペットに適用されます。圧力に応じて、メンブレンをピペット内に吸引され、ピペットにプログレッシブ膜変形または "膜投影"は、時間の関数として測定される。この実験的なアプローチの基本的な原理は、定義された機械的な力に応じて、膜変形の程度は膜剛性の関数であるということです。硬めの膜であり、膜変形と短い定常吸引length.The技術の遅い速度は、単離された両方のサスペンションと、基板に接続された、大規模な細胞小器官内の細胞、およびリポソーム上で実行することができます。

分析は、異なる細胞集団や実験条件の与えられた圧力の下で達成最大の膜の変形を比較することによって行われる。 "剛性係数は、" ESです印加圧力の関数としての膜変形の吸引された長さをプロットすることによりtimated。さらに、データはさらに材料の剛性を特徴づける細胞のヤング率（E）は、最も一般的なパラメータを推定するために分析することができる。真核細胞の細胞膜は膜脂質二重層は、サブ膜細胞骨格によって、それが膜の機械的足場を構成し、変形を支配する細胞骨格であるunderliedされる二成分系とみなすことができることに注意することが重要です携帯封筒の。このアプローチは、したがって、サブ膜細胞骨格の力学的特性をプロービングすることができます。

プロトコル

1。ガラスマイクロピペットを引っ張る

機器：マイクロピペットプラー、マイクロフォージ。

ガラス：Boroscillicateガラスキャピラリー（〜1.5ミリメートル外径は、〜1.4ミリメートル内径）。

1. マイクロピペットは、電気生理学的記録のためにガラス微小電極を準備するために使用されているのと同じ基本的なアプローチを使用してプルアップされています 。簡単に言えば、ガラスキャピラリーを途中で加熱され、ガラスが溶け始めたときに毛細血管の二つの半分は離れて2マイクロピペットを生成引っ張られる。複数の商用車夫は、プルの速度と他のパラメータを変化させるために、複数のプログラム可能なオプションを提供する高度に洗練された水平方向の引き手に2つのピペットを引き離すために重力を使用し、比較的単純な縦の引き手に至るまで、このプロセスを実行するために利用されています。引き手の両方のタイプは、私たちの実験で使用した。
2. 要件ピペットチップのジオメトリ用S：これらの実験で使用したピペットの先端は、典型的には細胞の大きさに応じて2から6μmの外径の間の範囲。もう一つの重要なパラメータは、先端の形状であるべきおおよその円筒管（ 図1を参照）。これは、所望の形状が得られるまでプルのパラメータを最適化し、顕微鏡下で先端の形状を確認することによって達成することができます。ピペットシャンクの最適な長さは、予想される変形量に依存します：変形が小さい<10μmである場合、それはピペットの筒状の部分が短い（同程度の大きさ）より大きいため、相対的であることで十分です変形はそれに応じて調整してください。一般的に、 "プル"で、熱および/または増大を増やすと先端の直径が小さくなります。 "プル"の増加も長いテーパー付きチップを生成します。我々の実験では、サッターP-97水平ピペットプラーを使用して、プログラムがあった;プル22;ベロシティ22時間200;圧力500 473のヒート：次のパラメータに対して最適化されます。それは非常に長いシャンクを引っ張って、その後破壊し、それを研磨することにより円筒状のヒントを作成することも可能です。ピペットの異なる種類を準備する方法の詳細な手順については、サッターのマニュアルに記載されています。
3. マイクロフォージ ：それはまた、原形質膜に良好なシールを作る滑らかなガラス表面を生成するためのピペットの先端を火磨くことをお勧めします。これは、マイクロフォージを使用して、2番目の非常に分数の加熱されたガラス玉の近傍にピペットの先端を持って来ることによって行われます。同様の技術は、日常的に電気生理学的記録用微小電極を作製するために使用されます。
4. マイクロピペットを充填 ：マイクロピペットは、PBSまたは非蛍光増殖培地として生理食塩水で満たされるべきである。重要なのは溶液が細胞膜を可能にする30％の血清を補充すべきであるピペットにスムーズに移動するためにブレーン。二つのアプローチは、ピペットの先端に気泡を取り除くために使用することができます：（i）のピペットの先端は、液体がピペットを埋め戻し、続いて毛管力により先端部を埋めるようにする第一溶液に浸漬することができますもう一方の端から、または（ii）をホールピペットを穏やかに先端から気泡を除去するためにピペットのシャンクをタップすることで、バックエンドから充填することができる。
5. 注 ：ピペット、実験当日に準備する必要があります。

2。細胞の調製

1. 細胞を播種 ：Microaspirationいずれか懸濁液中に維持されるか、基板に接続された単一細胞で行われています。懸濁液中の細胞を吸引するために、細胞は、その基板から持ち上げ、右実験前に倒立顕微鏡に搭載されている浅い縦室にピペットで注入されています。基板に接続された細胞は、細胞を吸引するまた、実験前にmicroaspiration室に配置することができます小さなカバーグラス（〜直径10mm）上に播種する。浅い縦室を使用する理論的根拠は、マイクロピペットは、できるだけ水平に近い非常に浅い角度で細胞に接近できるようにすることです。これは、（ 図2を参照）は、フォーカスの単一の平面上に可視化するマイクロピペットに引き込ま膜を可能にするために行われます。
2. 細胞膜の可視化 ：ピペット内膜突起を観察するために、細胞膜は、標準的な染色プロトコルを使用して、このようなDIIなどの親油性蛍光色素で染色されています。
   1. PBS溶液を温める。
   2. 温めておいたPBS溶液で作業濃度（5μM）に株式DIIを希釈します。
   3. 色素凝集体を壊すために、5分間超音波洗浄します。
   4. 5分間スピンダウンし、上清をとる。
   5. PBSで3回、各5分間で細胞を洗浄します。
   6. そう色素で細胞をインキュベート37℃インキュベーターで30分間分離能。
   7. 5分ごとに、PBSで3回細胞を洗浄します。
3. 注：また、ピペット内膜と一緒に引っ張られているサブ膜細胞骨格を可視化すると、膜のDII染色を代用することが可能である。それは、細胞骨格を乱すことは、細胞の生体力学的特性を変化させる可能性があること、しかし、考慮する必要があります。また、基板付着細胞とmicroaspiration実験を行う際に、それが細胞の焦点面までの角度で配置されているピペット内膜突起の長さを推定するために3D画像を使用することを推奨します。

3。 Microaspiration及び画像取得

機器：倒立蛍光顕微鏡、好ましく3Dデコンボリューション機能（objectivのコンピュータ制御、Z軸の動きとZEISS AXIOVERT 200MとESまたは同等のもの）コンピュータ（AxioCam MRMまたは同等品）に接続ビデオカメラ、圧力変換器（バイオテックまたは同等品）、振動のない駅（TMDまたは同等品）、マニピュレーター（ナリシゲ、サッター、バーレイまたは、それと同等のもの、マニピュレータ）、機械油圧式や圧電することができます。それはmicroaspirationこのような赤血球^1,2または好中球^3、このような核⁴または人工リポソーム⁵として隔離された細胞小器官などの懸濁液中の細胞の剛性を推定するために3D機能なしの顕微鏡を用いて行うことができますを強調するためにも重要です。

画像取得ソフトウェア：ツァイスAxioVisionのまたは同等品。

1. 上記のように倒立蛍光顕微鏡で、microaspirationチャンバーに細胞をマウントします 。実験用のセルを選択するセルを配置し、視野の中心に配置します。それはperfoすることが重要です特に基板に接続された細胞を用いた実験のための振動のない環境でrmをこれらの実験では、一般的にベンチと通常の表で発生する微小な振動が完全にシールの作成を危うくする可能性があるので、マイクロピペットまたは結果内の先端を破る結果の分析と正しいチップの位置が大幅にシフトする。
2. タイトなフィット感ピペットホルダーのコネクターに調整直径がフレキシブルチューブにより、電力変換器に接続ピペットホルダにPBS /メディアワット/血清溶液を充填したマイクロピペットを置きます 。各実験の初めに、ピペット内の圧力が大気圧に戻した。ピペットはミクロン範囲のピペットの動きの微調整を可能にマニピュレーターに装着される。チャンバーの底に浅い角度でピペットを置き、視野の中心にピペットの先端を持って来る。木曜日ピペットの電子シャンク、膜が吸引されているにピペットチップの筒状の部分は、できるだけ浅い角度（10〜15°）に（1）ポジショニングピペットで、（2）によって焦点面に水平に配置される室の底部に対してピペットのシャンクを曲げる。シャンクが非常に薄いため、図1に模式的に示すように、セルに近づいている間、それはチャンバーの底部にスライドするのに十分な柔軟性を備えています。徐々にセルの焦点面付近までのコースマニピュレータを使用して、単一のセルの側面にマイクロピペットをダウンさせる。ピペットの先端を優しく膜に接触するまで、その後、罰金マニピュレータを使用すると、セルの端にマイクロピペットを移動します。ピペットの位置を観察するために、1つの画像を撮影するピペットの先端全体が細胞表面に完全に接触していると接触が安定しているときに良いシールが作成されます。強い客観的基準はシールが販売されどのように良いの詳細については、しかし、がありません目視検査用EPT。
3. 変換器を使用して負圧のステップを適用し、膜突起が安定するまでそれを維持している。ピペット内に膜を吸引するために必要な圧力の量は細胞の種類や特定の実験条件によって異なります。 -2〜15ミリメートルHgの間の範囲の圧力を適用するときに我々の実験では、初期変形は、一般的に観察される。それは一定の長さ、一般的に2〜3分を要するプロセスで安定するまで、圧力が加えられると、膜が徐々にピペットに変形される。この間、膜変形のイメージがピペット内に引き込まれ、膜の進行を追跡するために、30秒ごとに取得されます。
4. 2〜5ミリメートルHgのステップで次のレベルへの圧力を高め、膜突起は、実験が停止された時点で細胞をピペット内に移動、から切り離されるまで、全体の手順を繰り返します。

4。分析

膜変形の度合いを定量化するために、吸引された長さ（L）は、膜突起の外周の頂点にピペットの先端から測定される。それは、より大きいピペットは圧力と同じレベルで、細胞膜上のより多くの力を適用すること、しかし、注意することが重要である。ピペットの直径間のばらつきを考慮するために、したがって、吸引長さは、それぞれの実験のために測定ピペット径（D）のために正規化されています。

以前の研究^6,7で説明したようにデータはさらに、内皮細胞の標準的な線形粘弾性半空間モデルを用いて分析することができます。具体的には、細胞の弾性率は、次式を用いて推定した。

Eはヤング率であり、内側のですピペットの半径は、Δpは圧力差、Lは対応する吸引した長さであり、φ（η）関数は、Theret ら ⁷によって記述力モデルを用いて計算の壁である。それは、複数のモデルが細胞は、細胞が球形の形状を形成することを前提として等方的かつ均質材料特性と液滴モデルと変形可能な球であると仮定し、有限要素モデルを含むmicroaspirationデータを分析するために使用されていることに注意することが重要である継続的に変形し、いくつかの優れたレビューで説明したように、リリース時に回復することができます^：8-10。 Microaspirationはまた、携帯粘弾性特性、細胞や組織のバイオメカニクスとは異なる構造要素の皮質緊張と貢献（詳細については、上記のレビューを参照）などの細胞や組織の他の生体力学的パラメータを調査するために使用することができます。

5。代表者結果

以前の研究では、マイクロピペット吸引は、リポソーム⁵基板上または基板^2,11-13に付着しなかった細胞のいずれかで行われた。我々の研究では、しかし、細胞は典型的には、細胞が^{14から16を}切り離したときに発生する可能性がある細胞骨格構造の変化を避けるために、基板に付着保持されます。基板に接続されたセルに対するmicroaspiration技術の使用を検証するために、我々は予想通り、というように、この方法で見積もったウシ大動脈内皮細胞（BAECs）の細胞剛性の減少におけるF-アクチンの結果の混乱を図3に示すかどうかを試験した、これは確かにそうである。具体的には、 図3Aは、マイクロピペットを介して印加される負圧に応じてプログレッシブ変形を受ける内皮細胞膜の蛍光像の典型的なシリーズです。予想されたように、膜が徐々にピペットとaspiratに吸引するedの長さは、印加された圧力の関数として増加します。 F-アクチンの破壊が大幅にすべての圧力条件（ 図^{3B）14 歳}未満の突起吸引した長さを増加させることを変形ショーの時間のコース。

このアプローチを使用して、我々はそのコレステロール濃縮は効果^14を持っ^ていたのに対し、細胞膜のコレステロールが枯渇されたときに、セルの剛性が増加を発見した。 図4で最大吸引の長さに達した後、コレステロールに富む細胞、コントロール細胞、及びコレステロール枯渇細胞を示している-15ミリメートルHg（4A）。突起は通常、-10mmHgで開発に着手し、膜変形の時間コースは-10、-15、-20ミリメートルHg（4B）の負の圧力のために測定することができる。 -25mmHg以上の圧力のアプリケーションが別々の小胞を形成し、吸引した突起の剥離が生じた。膜剥離につながっ圧レベルはsimilaだったコレステロール異なる条件下でR。以前の研究では、膜脂質二重層膜にコレステロールの増加は、膜^5,17の剛性を増加させることを示したので、この観測は非常に予想外であった。私たちのさらなる研究は、原子間力顕微鏡^18,19とフォーストラクション顕微鏡^20を含むいくつかの独立したアプローチを用いて、これらの観察結果を確認した。

図1。記録ピペットの概略側面図ではピペットチップ（側面図）で円筒シャンクを生成するためにプルアップされています。マイクロピペットパラメータD = 2A =内径とED = 2B =外径。

図2。マイクロピペットは、基板に接続されたセルに近づいて （a）は概略側面図;マイクロピペットsの（B）のブライトコントラスト画像ハンクは、吸引実験で使用した典型的形状のセルをタッチする。DiIC ₁₈で標識された同一のセルの（C）の蛍光画像。マイクロピペットは、まだ存在していますが^、（14日から）見えません。

図3。 microaspirationを使用して、基板に接続された細胞における細胞剛性を測定する検査。 ：それは蛍光を発していないため、対照条件下とlatrunculinへの暴露後BAECsのプログレッシブ膜変形の画像ピペットは、画像上では見えません。細胞が劇的にローダミン - ファロイジン蛍光（図示せず）によって測定されたが、セルの形状に有意な影響を及ぼさなかったが、F-アクチンの量を減少させた10分間、2μMのlatrunculinにさらされた。 latrunculin処理した細胞では、吸引した投影の真ん中に膜が薄くなることがあるが、投影はまだCに接続されているellsますb。 Lは膜突起およびDの長さを吸引される膜変形の時間コースでlatrunculinの効果は、対照細胞のためのピペットの直径（n = 14）および2μMのlatrunculinに曝露した細胞で10分間（N = 5）。 細胞は-10ミリメートルHg（ダイヤ）、-15ミリメートルHg（四角）および-20ミリメートルHg（三角形）で吸引した。 ^（14日から）。

図4。 BAECsの膜変形に及ぼす細胞コレステロールレベルの効果。 。コレステロールに富む、コレステロール枯渇とコントロール細胞（コントロール細胞の膜変形の典型的なイメージはMβCDにさらされた：細胞内遊離コレステロールのレベルに影響を及ぼさなかった1:1の比率でMβCD -コレステロール混合物（参照挿入図）。示されている画像は、-15ミリメートルHgで最大変形を示している。矢印は、吸引した突起の位置を示し。バーは30μmである。Bは 。 3つの実験の細胞集団のために吸引された長さの平均時間のコースです。C。最大吸引された長さが加えられた圧力の関数としてプロットした。枯渇した細胞内で最大の正規化された長さは、圧力-15ミリメートルHgおよび-20 mmHgで有意（P <0.05）のための制御細胞のそれよりも有意に低かった。 ^（14日から）。

ディスカッション

Microaspirationは、細胞膜に負圧を適用し、明確に定義された圧力に応答して膜の変形能を測定することにより細胞の剛性/変形を推定するためのシンプルで再現性の高い方法を提供します。これは、最初の細胞分裂²¹その後赤血球¹の機械的特性を見るためのメカニズムへの洞察を提供するために、ウニの卵の弾性的性質を特徴づけるためにミッチソンとスワン（1954）によって開...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬の名称	会社	カタログ/モデル番号	注釈
サッターピペットプラー	サターインスツルメンツ	P-97
マイクロフォージ	ナリシゲ	MF-830
倒立蛍光顕微鏡	ツァイス	AXIOVERT 200M	顕微鏡は、好ましく3D/deconvolution機能を装備する必要があります。
ビデオカメラ	ツァイス	AxioCam MRM
画像取得sotware	ツァイス	AxioVisionの
空気圧トランスデューサ	BioTekの	DPM-1B	DPM1B空変換器のテスターは現在FLUKEことによって見つけることができます。
ピペットグラス	リッチランド	カスタマイズされたガラス	ピペットは1.2内径と外径1.6を使用してカスタマイズされた。
DiIを染料	インビトロジェン	D282	DMSOによく溶ける