免疫療法のための腫瘍抗原にロードされた成熟樹状細胞の調製

Rachel Lubong Sabado; Elizabeth Miller; Meredith Spadaccia; Isabelita Vengco; Farah Hasan; Nina Bhardwaj

doi:10.3791/50085

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Method Article

免疫療法のための腫瘍抗原にロードされた成熟樹状細胞の調製

DOI:

10.3791/50085

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August 1st, 2013

Rachel Lubong Sabado¹, Elizabeth Miller², Meredith Spadaccia¹, Isabelita Vengco¹, Farah Hasan¹, Nina Bhardwaj¹

¹Cancer Institute, NYU Langone Medical Center, ²Infectious Diseases, NYU Langone Medical Center

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要約

腫瘍免疫療法に使用するための自己樹状細胞（DC）を大量に生成するための最も一般的に使用される方法が記載されている。この方法は、単球から樹状細胞を区別するためにIL-4およびGM-CSFを使用する。彼らは患者に再び注入される前に、未成熟DCは、成熟した後、抗原でロードに刺激される。

要約

臨床研究は、抗原·ロードDCワクチンは腫瘍¹のための安全かつ有望な治療法であり、それらの臨床的有効性が確立されて残っていることが確立しているが。方法は、良好な製造技術（GMP）のガイドラインに準拠して作成、後述するように、臨床研究のためのDC ²を大量に生成するための最も一般的なex vivoでの調製方法の最適化である。

提案手法では、樹状細胞を刺激するための合成TLR 3アゴニストポリイノシン - ポリシチジル酸 - ポリ-L-リジンカルボキシメチルセルロース（ポリICLC）を利用する。 CD83およびCD86のアップレギュレーションにより評価されるポリICLCはヒトDCのための最も強力な個々の成熟刺激であることが確立我々の以前の研究では、インターロイキン12の誘導（IL-12）、腫瘍壊死因子（TNF）、インターフェロンγ誘起タンパク質10（IP-10）、interleukmin 1（IL-1）、I型インターフェロン（IFN）、および最小のインターロイキン10（IL-10）産生。樹状細胞は、白血球搬出により得られた凍結末梢血単核細胞（PBMC）から区別される。 PBMCを、フィコール勾配遠心分離によって単離し、アリコートで凍結する。 1日目では、PBMCを解凍され、℃の中の組織培養インキュベーターで、37〜2時間インキュベートした後、プラスチック表面に付着した単球を選択するために組織培養フラスコに播種。インキュベーション後、リンパ球が洗い落とされ、接着単球を未成熟DCに分化するインターロイキン-4（IL-4）および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）の存在下で5日間培養する。 6日目に、未成熟DCは、ワクチンの品質の制御として機能し、ワクチン³の免疫原性を高めることがキーホールリンペットヘモシアニン（KLH）タンパク質でパルスされています。 DCは、成熟に刺激ペプチド抗原を搭載し、一晩インキュベートする。 7日目に、細胞を洗浄し、含有する、1mlのアリコートで凍結4 -制御された速度冷凍庫を使って20×10 ⁶細胞。 DCのバッチのロットリリーステストが行われ、それらが患者に注入される前に、最低限の仕様を満たしている必要があります。

プロトコル

1。 PBMCを⁴の単離と凍結保存

無菌スパイクプラズマ転送セットを使用して、白血球搬出袋のアクセスポートのいずれ。 60ミリリットル注射器を用いて、無菌の500mlボトルに患者から得られた白血球搬出を転送する。
室温RPMIを用いて元のボリュームを2倍に白血球搬出の音量を調整します。徹底的に混ぜる。
優しくフィコール - Paque PLUSのボトルを混ぜて。滅菌50ミリリットルコニカルチューブに12ミリリットルフィコール - Paque PLUSを追加します。
フィコールを含む各滅菌50ミリリットルコニカルチューブに希釈白血球搬出製品の優しく層30ミリリットル。フィコールと細胞懸濁液との間のインターフェースを邪魔しないように注意してください。
白血球搬出のすべてが積層されるまで手順1.3と1.4を繰り返します。
ブレーキなしで室温で20分間、1,000×gで50ミリリットルコニカルチューブを遠心。
慎重に各チューブとtransfe由来のPBMCの濁った層を収穫新しい無菌の50mlチューブにR。
50ミリリットルの最終体積に各チューブにRPMIを追加します。反転により穏やかに混合。
4時10分°Cフルブレーキ付、500×gで、細胞を遠心分離します。
各チューブから上清を取り除きます。各チューブからの細胞ペレットを再懸濁し、50 mlの最終容積にRPMIを追加します。反転により穏やかに混合。
500×4で6分間遠心℃で細胞を遠心
各チューブから上清を取り除きます。再懸濁し、1 50ミリリットルコニカルチューブに一緒にプールに細胞懸濁液を。
もっとRPMIで50 mlにプールされた末梢血単核球の体積を持ち出す。反転により穏やかに混合。
300×4で6分間遠心℃で細胞を遠心
上清を取り除きます。 50ミリリットルRPMIで細胞ペレットを再懸濁します。均一な細胞懸濁液を確実にするために穏やかに混合する。
セルの数をカウントし、細胞生存率を決定します。生存細胞の総数を計算します。
300で細胞を遠心×4で6分間遠心℃、凍結メディアを準備します。ヒトAB血清（バレーバイオメディカル）において、凍結培地は、10％ジメチルスルホキシド（DMSOミルテニーバイオテク社）で構成されています。
上清を取り除きます。寒い凍結メディアで2×10 ⁸細胞/ mlの最終濃度で細胞を再懸濁します。
1.8ミリリットルのクライオバイアルに1ミリリットルのアリコートを作る。
制御された速度冷凍庫にクライオバイアルに移し、凍結実行、プログラム1を開始します。実行の最後に、直ちに液体窒素冷凍庫の気相に凍結クリオバイアルを移す。

2。 0日目：単球から樹状細胞の分化

滅菌50ミリリットルコニカルチューブにRPMI / 1％自己血漿30mlのを追加します。
37℃の水浴中で穏やかに撹拌によって凍結したPBMCの融解アリコート。完全に解凍すると、無菌の50ミリリットルコニカルチューブにバイアルの内容を転送します。徹底的に混ぜる。
6分間、細胞を遠心分離室温で500×gで。上清を除去し、RPMI / 1％自己血漿少量のペレット化した細胞を再懸濁します。次いで50 mlの最終容積にもっとRPMI / 1％自己血漿を追加します。徹底的に混ぜる。
500で6分×gで室温では再び細胞を遠心分離。上清を吸引し、50ミリリットルRPMI / 1％自己血漿でペレットを再懸濁します。徹底的に混ぜる。
セルの数をカウントし、細胞生存率を決定します。生存細胞の総数を計算します。
プレート1.40 40 RPMIのミリリットル/ 225センチメートル² EasyFlaskへ1％自家血漿中×10 ⁸細胞。すべての細胞がメッキされているまで繰り返します。
1のためにその側にフラットEasyFlasksをインキュベート- 37で2時間°組織培養インキュベーターでCは単球がフラスコに付着できるように、5％CO _2を含む。
インキュベーションが完了したら、インキュベーターからEasyFlaskを除去し、非接着細胞USIを除去するために二回洗っNG温めRPMI 30mlの。
二回目の洗浄後、400〜1,000 IU / mlのIL-4および100〜1,000 IU / mlのGM-CSF ^5-8でRPMI / 1％自己血漿40 mlを加える。このプロトコルのために、我々は400 IU / mlのIL-4、100 IU / mlのGM-CSFを使用しています。
37℃で2日間EasyFlasksをインキュベート°組織培養インキュベーター中でCが5％CO _2を含む。

3。 2日目：IL-4およびGM-CSFを有する樹状細胞の給餌

400〜1,000 IU / mlのIL-4および100〜1,000 IU / mlのGM-CSFで各EasyFlaskにRPMI / 1％自己血漿4 mlを加え。渦巻くとその側に揺動混ぜる。
37℃の組織培養インキュベーター中、5％CO _2を含むでより多くの3日間EasyFlasksを（5日まで）インキュベートする。

4。 5日目：未成熟樹状細胞の収穫

精力的にフラスコを渦巻くことで、非粘着性と緩く接着細胞を再懸濁するために上下にピペッティングにより文化を収穫。転送新しい50 mlコニカルチューブに回収した細胞。
室温で6分間、500×gでチューブを遠心する。上清を取り出し、50ミリリットルRPMI / 1％自己血漿で細胞ペレットを再懸濁します。徹底的に混ぜる。
セルの数をカウントし、細胞生存率を決定します。生存細胞の総数を計算します。
室温で6分間、500×gでチューブを遠心する。 3ミリリットルRPMI / 6ウェル組織培養プレートで400 IU / mlのIL-4および100 IU / mlのGM-CSFと1％の自己血漿中のウェル当たりプレート1-2×10 ⁶細胞。
37℃でプレートをインキュベート℃で組織培養インキュベーターでは₂晩、5％のCOを含む。

5。 6日目：樹状細胞の成熟と抗原読み込み

10μgの/ mlのKLHに6ウェル培養プレート中のウェルの1/3を入れる。渦巻プレートが混合する。 KLHにのみ第1のDCワクチンに使用されるためKLHは、ウェルの1/3に添加する。その後のDCワクチンの詐欺唯一の腫瘍抗原ペプチドをTainの。
DCは異なる刺激を使用して成熟し刺激することができる。臨床試験で用いられている最も一般的な成熟刺激サイトカインのカクテル（IL-1β、TNFαおよびIL-6）及びプロスタグランジンE2（PGE ^_2）9,10されている。より最近では、Toll様受容体（TLR）アゴニストの使用は人気^11,12を集めている。このプロトコルでは、ウェルに2 mg / mlのポリイノシン-ポリシチジル酸-ポリ-L-リジンカルボキシメチルセルロース（ポリICLC）を追加し、よく混ぜる。ポリICLCは、ポリ-L-*-リジンおよびカルボキシメチルセルロース（Oncovir社製）で安定化されているポリ-ICの臨床グレードの製剤である。
各ウェルクロス競争^13を回避する唯一の単一のペプチドを受け、それらの指定されたウェルには100μg/ mlの長いペプチド抗原（NY-ESO-1および/ またはMelan-A/MART-1）を追加します。
37℃のプレートをインキュベートし、組織培養におけるCインキュベーターがCO 5％を含む<サブ> 2 O / N

6。 7日目：樹状細胞の凍結保存

自己血漿および10％DMSOを使用してDC凍結溶液を調製。任意の粒子状物質を除去するために4℃で20分間2,000のDC凍結ソリューション×gで遠心します。新しいラベル15ミリリットルコニカルチューブに上清を移します。 4℃で保存し、使用するまでC。
一晩のインキュベーションが終了し、収穫、プール50ミリリットルコニカルチューブにペプチドをパルスした樹状細胞を含むすべての井戸。
6分間500×gでチューブを遠心する。上清を取り除きます。 RPMI / 1％自己血漿5mlの細胞ペレットを再懸濁します。 RPMI / 1％自己血漿で50 mlに総量を持ち出す。徹底的に混ぜる。
セルの数をカウントし、細胞生存率を決定します。生存細胞の総数を計算します。
室温で6分間、500×gでチューブを遠心する。上清を取り出し、5ミリリットル殺菌の各ペレットを再懸濁しル0.9％のNaCl、USPおよび新しい15ミリリットルコニカルチューブに移す。より滅菌0.9％のNaCl、USPは14 mlに各細胞懸濁液を持参してください。反転によってキャップとミックス。
二回前の手順を繰り返します。最後の遠心分離後、上清を除去し、ペレットを乱すことなく、細胞ペレットにできるだけ近くになって。
4のDC凍結溶液中の細胞ペレットを再懸濁し- 20×10 ⁶細胞/ mlとアリコートそれぞれ1.8ミリリットルのクライオチューブバイアルに1ミリリットル。
DCワクチンのアリコートを下に凍結し、長期保存のために液体窒素冷凍庫の気相中にすぐに転送するために、制御された速度冷凍庫、プログラム1を使用します。

7。ロットリリーステスト

それは典型的には5〜6週間ワクチン調製後、研究では患者への注射のためにリリースされる前に、DCワクチンの各バッチが評価され、特定のロットリリース基準（ 表1）を満たしている必要があります。
生存：自動細胞計数器を用いたDCワクチンの有効性を評価する。最小許容生存仕様は> 70％である。
アイデンティティ：フローサイトメトリーによる成熟DC（CD11cは+ CD14-CD83 +）の身元を評価する。のCD11c +細胞の割合は> 50％であるべきである。 CD11c陽性の割合は+およびCD14 +細胞が<30％のCD11c +、の割合がCD14-、およびCD83 +細胞がなければならない>ことが50％。べき
不妊：直接文化やグラムの汚れで嫌気と好気性細菌や真菌の存在のためのテストのDCワクチン。インジケータセルラインと直接培養系及びDNA蛍光色素染色アッセイを用いてマイコプラズマの存在を評価します。これらのテストでは、最小の仕様セットは成長がすべての培養物から観察されないということである。
エンドトキシン：キネティック-QCLカイネティック発色LALアッセイを用いてエンドトキシンの内容を評価し、それが最低基準を満たすために<50 EU / mlのでなければなりません。
機能：同種T細胞とのインキュベーションによって混合リンパ球反応においてDC機能を評価します。刺激されていない樹状細胞と比較して増殖の存在が（ 図3）が報告されている。