JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Наиболее часто используемый способ генерирования большого количества аутологичных дендритных клеток (DC) для использования в иммунотерапии опухолей описано. Метод использует IL-4 и GM-CSF дифференцировать ДК из моноцитов. Незрелые ДК стимулируются, чтобы созреть и затем загружается с антигенами, прежде чем они вводятся обратно в организм пациента.

Аннотация

Хотя клинические исследования установили, что антиген-DC загруженных вакцины безопасны и перспективным для терапии опухолей 1, их клиническая эффективность еще предстоит установить. Метод, описанный ниже, подготовленной в соответствии с правилами процесса производства (GMP) руководящие принципы, является оптимизацией самых распространенных бывших естественных условиях подготовки способ генерации большого количества контроллеров домена для клинических исследований 2.

Наши способе используют синтетический агонист TLR 3 Полиинозиновую-полицитидилова кислота-поли-L-лизин-карбоксиметилцеллюлоза (Поли-ICLC), чтобы стимулировать DC. В предыдущем исследовании было установлено, что Poly-ICLC является самым мощным стимулом отдельных созревание для человека РС по оценке регуляция CD83 и CD86, индукции интерлейкина-12 (IL-12), фактор некроза опухолей (ФНО), интерферон гамма-индуцированной белок 10 (IP-10), interleukmin 1 (IL-1), интерфероны типа I (IFN) и минимальное интерлейкин-10 (IL-10) производства. ДК отличаются от замороженных мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС), полученного лейкаферез. РВМС выделяли центрифугированием в градиенте Ficoll и замораживают в аликвотах. В день 1 РВМС оттаивали, засевали на колбах культуры тканей, чтобы выбрать для моноцитов которые прилипают к пластиковой поверхности через 1-2 ч инкубации при 37 ° С в инкубаторе для тканевых культур. После инкубации лимфоцитов смываются и прилипшие моноциты культивировали в течение 5 дней в присутствии интерлейкина-4 (IL-4) и гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) дифференцироваться в незрелые ДК. На 6-й день, незрелые ДК импульсно гемоцианин лимфы улитки (KLH) белок, который служит в качестве контроля качества вакцин и может повысить иммуногенность вакцины 3. ДК стимулируются, чтобы созреть, нагруженных пептидных антигенов, и инкубировали в течение ночи. На 7 день, клетки промывают и замораживают в аликвотах 1 мл, содержащих4 - 20 × 10 6 клеток с использованием контролируемой скорости морозильной камеры. Лот тестирования расцепителя для партий ДК выполняется, и должны соответствовать минимальным требованиям, прежде чем они вводят пациентам.

протокол

1. Выделение и криоконсервации МНПК 4

  1. Асептически шип одного из портов доступа в лейкафереза ​​сумку с помощью набора переноса плазмы. С помощью 60 мл шприц, передавать лейкафереза, полученных от пациентов в стерильный 500 мл.
  2. Регулировка громкости лейкафереза ​​в 2 раза от первоначального объема использованием RPMI комнатной температуре. Тщательно перемешать.
  3. Аккуратно перемешайте бутылку Фиколл Paque-PLUS. Добавить 12 мл Ficoll-Пак Плюс в стерильные 50 мл коническую трубку.
  4. Осторожно слой 30 мл разбавленного продукта лейкаферез друг стерильные 50 мл конические пробирки, содержащей Ficoll. Будьте осторожны, чтобы не нарушить взаимодействие между Фиколл и клеточной суспензии.
  5. Повторите этапы 1.3 и 1.4, пока все лейкаферез не был слоистым.
  6. Центрифуга 50 мл конические пробирки при 1000 х г в течение 20 мин при комнатной температуре, без тормоза.
  7. Осторожно собрать облачный слой МНПК из каждой пробирки и TransfeR Чтобы новые стерильные 50 мл пробирки.
  8. Добавить RPMI в каждую пробирку до конечного объема 50 мл. Осторожно перемешать с помощью инверсии.
  9. Центрифуга клетки при 500 х г в течение 10 мин при 4 ° С с полного торможения.
  10. Удалить супернатант из каждой пробирки. Ресуспендируют клеточный осадок из каждой пробирки и добавляют RPMI до конечного объема 50 мл. Осторожно перемешать с помощью инверсии.
  11. Центрифуга клетки при 500 х г в течение 6 мин при 4 ° C.
  12. Удалить супернатант из каждой пробирки. Ресуспендируйте и бассейн вместе клеточные суспензии в одном 50 мл коническую трубку.
  13. Доведите объем объединенных PBMC, до 50 мл с более RPMI. Осторожно перемешать с помощью инверсии.
  14. Центрифуга клетки при 300 х г в течение 6 мин при 4 ° C.
  15. Удалить супернатант. Ресуспендируют осадок клеток в 50 мл среды RPMI. Осторожно перемешать, чтобы обеспечить равномерную суспензию клеток.
  16. Подсчет числа клеток и определения жизнеспособности клеток. Расчет общего количества жизнеспособных клеток.
  17. Центрифуга клетки при 300Х г в течение 6 мин при 4 ° C. Подготовьте замораживания средств массовой информации. Замораживание средств массовой информации состоит из 10% Диметилсульфоксид (ДМСО; Miltenyi Biotec) в человеческой сыворотки АВ (долины биомедицинских).
  18. Удалить супернатант. Ресуспендируют клеток в конечной концентрации 2 × 10 8 клеток / мл в холодном замораживания средств массовой информации.
  19. Сделать аликвоты по 1 мл в 1,8 мл криопробирки.
  20. Передача криопробирки в контролируемой скоростью морозильник и начать замораживание перспективе, программы 1. В конце прогона, передавать замороженных криопробирок сразу в паровой фазе жидкого азота морозильник.

2. День 0: Дифференциация дендритных клеток из моноцитов

  1. Добавить 30 мл RPMI / 1% аутологичной плазмы в стерильную 50 мл коническую трубку.
  2. Оттепель замороженных аликвотам МНПК нежным агитации в 37 ° С водяной бане. Когда полностью оттаять, передавать содержимое флаконов стерильных 50 мл коническую трубку. Тщательно перемешать.
  3. Центрифуга клетки в течение 6 минпри 500 х г при комнатной температуре. Удалить супернатант и ресуспендируют осажденные клетки в малом объеме среды RPMI / 1% аутологичной плазмы. Затем добавляют еще RPMI / 1% аутологичной плазмы до конечного объема 50 мл. Тщательно перемешать.
  4. Центрифуга клетки еще раз в течение 6 мин при 500 х г при комнатной температуре. Аспирируйте супернатант и ресуспендируют осадок в 50 мл RPMI / 1% аутологичной плазмы. Тщательно перемешать.
  5. Подсчет числа клеток и определения жизнеспособности клеток. Расчет общего количества жизнеспособных клеток.
  6. Пластина 1,40 × 10 8 клеток в 40 мл среды RPMI / 1% аутологичной плазмы на 225 см 2 EasyFlask. Повторяйте, пока все клетки не были покрыты.
  7. Инкубируйте EasyFlasks плоский на боку в течение 1 - 2 часов при 37 ° С в культуре ткани инкубаторе, содержащем 5% CO 2, чтобы позволить моноцитов прилипать к колбе.
  8. Когда инкубация завершена, удалите EasyFlask из инкубатора и мыть дважды, чтобы удалить не прилипшие клетки USIнг 30 мл предварительно нагретого RPMI.
  9. После второго мытья, добавляют 40 мл RPMI / 1% аутологичной плазмы с 400-1000 МЕ / мл IL-4 и 100-1000 МЕ / мл GM-CSF 5-8. Для этого протокола, мы используем 400 МЕ / мл IL-4 и 100 МЕ / мл GM-CSF.
  10. Инкубируйте EasyFlasks течение 2 дней при 37 ° С в культуре ткани инкубаторе, содержащем 5% СО 2.

3. День 2: Кормление дендритных клеток с IL-4 и GM-CSF

  1. Добавить 4 мл RPMI / 1% аутологичной плазмы с 400-1000 МЕ / мл IL-4 и 100-1000 МЕ / мл GM-CSF друг EasyFlask. Смешать, крутящихся и покачиваясь на его стороне.
  2. Выдержите EasyFlasks течение еще ​​3 дней (до 5 дней) при 37 ° C в культуре ткани инкубаторе, содержащем 5% CO 2.

4. День 5: сбор незрелые дендритные клетки

  1. Урожай культур, активно закрученного колб и с помощью пипетки вверх и вниз, чтобы ресуспендируйте неадгезивные и свободно присоединенными клетками. ПеренеситеСобранные клетки к новым 50 мл конические пробирки.
  2. Центрифуга труб при 500 х г в течение 6 мин при комнатной температуре. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 50 мл среды RPMI / 1% аутологичной плазмы. Тщательно перемешать.
  3. Подсчет числа клеток и определения жизнеспособности клеток. Расчет общего количества жизнеспособных клеток.
  4. Центрифуга труб при 500 х г в течение 6 мин при комнатной температуре. Пластина 1-2 × 10 6 клеток на лунку в 3 мл среды RPMI / 1% аутологичной плазмы с 400 МЕ / мл IL-4 и 100 МЕ / мл GM-CSF в 6-луночных планшетах для культуры ткани.
  5. Инкубируют планшеты при 37 ° С в культуре ткани инкубаторе, содержащем 5% СО 2 в течение ночи.

5. День 6: Созревание и загрузка антигена дендритных клеток

  1. Добавить 10 мкг / мл KLH до 1/3 от скважины в 6-луночные культуральные планшеты. Swirl пластины перемешать. KLH только добавляют к 1/3 от скважины, потому что KLH используется только для первой вакцины постоянного тока. Последующие DC вакцин ConTAIN только опухолевые пептиды антигена.
  2. ДК можно стимулировать, чтобы созреть, используя различные раздражители. Наиболее распространенными созревание раздражители, которые были использованы в клинических исследованиях была смесью цитокинов (IL-1 β, ФНО и ИЛ-6) и простагландин Е2 (PGE 2) 9,10. В последнее время использование Toll-подобных рецепторов (TLR) агонисты завоевали популярность 11,12. В этом протоколе, добавить 2 мг / мл Полиинозиновую-полицитидиловая Кислота-поли-L-лизин карбоксиметилцеллюлоза (Poly-МКПЦН) в лунки и хорошо перемешать. Поли-ICLC является клинической класса формулировки поли-IC, который стабилизирован с поли-L-*-лизин и карбоксиметилцеллюлозы (производства Oncovir, Inc.)
  3. Добавить 100 мкг / мл длинных пептидных антигенов (NY-ESO-1 и / или Melan-A/MART-1) к их назначенным скважин каждую лунку получавших только один пептид, чтобы избежать перекрестного конкуренции 13.
  4. Инкубируют планшеты при 37 ° С в культуре ткани инкубаторе, содержащем 5% CO <суб> 2 O / N.

6. День 7: Криоконсервация дендритных клеток

  1. Подготовка DC Замораживание Решение с помощью аутологичной плазмы и 10% ДМСО. Центрифуга решение DC Замораживание при 2000 х г в течение 20 мин при 4 ° С для удаления любых частиц. Передача супернатант в новую помечены 15 мл коническую трубку. Хранить при 4 ° С до использования.
  2. При инкубации в течение ночи закончена, урожай и бассейн все лунки, содержащие ДК импульсно с пептидами в 50 мл конические пробирки.
  3. Центрифуга труб при 500 х г в течение 6 мин. Удалите супернатант. Ресуспендируют осадок клеток в 5 мл среды RPMI / 1% аутологичной плазмы. Довести общий объем до 50 мл RPMI / 1% аутологичной плазмы. Тщательно перемешать.
  4. Подсчет числа клеток и определения жизнеспособности клеток. Рассчитать общее число жизнеспособных клеток.
  5. Центрифуга труб при 500 х г в течение 6 мин при комнатной температуре. Удалите супернатант и ресуспендируйте каждая гранула в 5 мл SteriLe 0,9% NaCl, USP и перехода на новые 15 мл конические пробирки. Принести каждой клеточной суспензии в 14 мл стерильной более 0,9% NaCl, USP. Cap и перемешать инверсии.
  6. Повторите предыдущий шаг дважды. После последнего центрифугирования, удаления надосадочной жидкости, получение как можно ближе к клетке гранулы, не нарушая гранул.
  7. Ресуспендируют клеточный осадок в DC Замораживание решения на 4 - 20 × 10 6 клеток / мл и аликвоты 1 мл на каждый криоскопической пробирки 1,8 мл флаконе.
  8. С помощью контролируемой скоростью морозильной камеры, одна программа, заморозить вниз аликвоты вакцины постоянного тока и передавать непосредственно в паровой фазе жидкого азота морозильник для длительного хранения.

7. Тестирование Лот релиз

  1. Каждую партию вакцины постоянного тока должны быть оценены и соответствуют конкретной партии выпуска критериев (табл. 1) до его выпуска для инъекции в пациента в исследование, обычно от 5 до 6 недель после вакцинного препарата.
  2. Жизнеспособность:Оценка жизнеспособности вакцина постоянного тока с использованием автоматического счетчика клеток. Минимальная приемлемая спецификации жизнеспособность> 70%.
  3. Идентичность: Оценка идентичность зрелых ДК (CD11c + CD14 + CD83 +) методом проточной цитометрии. Процент клеток CD11c + должна быть> 50%. Процент CD11c + и CD14 +-клеток должно быть <30%, а процент CD11c +, CD14 + и CD83 + клеток должна быть> 50%.
  4. Стерильность: Тест вакцины постоянного тока на наличие аэробных и анаэробных бактерий и грибков прямым культуры и окрашивание по Граму. Оценка на наличие микоплазм с использованием прямого система культуры и ДНК флуорохромом Assay Окрашивание индикатора клеточной линии. В этих тестах минимальный набор спецификаций в том, что никакого роста не наблюдалось от всех культур.
  5. Эндотоксина: Оценка содержания эндотоксина с помощью кинетического-QCL кинетической хромогенные LAL анализа и оно должно быть <50 КОЕ / мл для удовлетворения минимальных критериев.
  6. Функция: Оцените DC функции в реакции смешанных лимфоцитов путем инкубации с аллогенных Т-клеток. Наличие пролиферации по сравнению с нестимулированных ДК сообщается (рис. 3).

Результаты

В период с 10 - 20% исходного РВМС дифференцироваться в ДК в конце периода культивирования. Зрелые ДК являются CD11c +, CD14 +, CD83 +, CD40 + и CCR7 + (рис. 1). Они выражают высокие уровни MHC класса I и II молекул и молекул костимулирующую CD80 и CD86. Поли-ICLC также индуцирует более низкие уровни PDL-1 по сра?...

Обсуждение

Фазы I и II клинических испытаний, полученных из моноцитов ДК показали, что они индуцируют иммунный ответ у пациентов, однако клинический успех был ограничен 1. Частично это может быть связано с отсутствием консенсуса о том, как для формирования оптимального РСУ иммунотерапевтичес...

Раскрытие информации

Авторы получили финансовую поддержку из следующих: NIH (AI061684, AI071078, AI044628 и K08 AI084578 (Miller)), Фонд Билла и Мелинды Гейтс, Дорис Дьюк благотворительный фонд, НИИ онкологии, Альянс за Волчанка исследований, и Изумрудное Foundation. Нина Bhardwaj является coinventor на патенты, связанные с подготовкой и использованием дендритных клеток манипулировать иммунитет. Авторы не имеют никакие другие соответствующие принадлежности или финансовое участие с любой организацией или организацией в финансовой заинтересованности в финансовом или конфликт с предметом или материалы обсуждаются в рукописи, кроме тех, раскрыта.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить Андрес Салазар (Oncovir, Inc) за дар Poly-МКПЦН.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
RPMI-1640 medium with L-glutamineBioWhittaker12-702F
1M HEPES buffered salineBioWhittaker17-737E
Phosphate buffered saline (PBS)BioWhittaker17-516F
Human albumin, 25% solution USPAventis Behring
Ficoll-Hypaque PREMIUMGE Healthcare17-5442-03
Human AB serumValley BiomedicalHP1022
Sterile saline USPHospira
CryoMACS DMSO Miltenyi Biotec170-076-303
Leukine GM-CSF, 0.5 mg/mlBerlexA02266
MACS GMP IL-4Miltenyi Biotec170-076-101
Hiltonol, Poly-ICLC, 2 mg/mlOncovirNA
VACMUNE KLHBiosyn
225 sq cm EasyFlasksNalgene Nunc159934
Falcon 6-well tissue culture platesBecton Dickinson353046
1.8 ml CryoTube vialsNalgene Nunc377267
Controlled Rate FreezerThermoCryoMed

Ссылки

  1. Lesterhuis, W. J., et al. Dendritic cell vaccines in melanoma: from promise to proof. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 66, 118-134 (2008).
  2. Sabado, R. L., Bhardwaj, N. Directing dendritic cell immunotherapy towards successful cancer treatment. Immunotherapy. 2, 37-56 (2010).
  3. Schumacher, K. Keyhole limpet hemocyanin (KLH) conjugate vaccines as novel therapeutic tools in malignant disorders. J. Cancer. Res. Clin. Oncol. 127, 1-2 (2001).
  4. Jaatinen, T., Laine, J. Isolation of mononuclear cells from human cord blood by Ficoll-Paque density gradient. Curr. Protoc. Stem Cell Biol. Chapter 2, Unit 2A 1 (2007).
  5. Eichler, H., et al. Multicenter study on in vitro characterization of dendritic cells. Cytotherapy. 10, 21-29 (2008).
  6. Feuerstein, B., et al. A method for the production of cryopreserved aliquots of antigen-preloaded, mature dendritic cells ready for clinical use. J. Immunol. Methods. 245, 15-29 (2000).
  7. O'Neill, D., Bhardwaj, N. Generation of autologous peptide- and protein-pulsed dendritic cells for patient-specific immunotherapy. Methods Mol. Med. 109, 97-112 (2005).
  8. de Vries, I. J., et al. Phenotypical and functional characterization of clinical grade dendritic cells. J. Immunother. 25, 429-438 (2002).
  9. Jonuleit, H., et al. Pro-inflammatory cytokines and prostaglandins induce maturation of potent immunostimulatory dendritic cells under fetal calf serum-free conditions. Eur. J. Immunol. 27, 3135-3142 (1997).
  10. Lee, A. W., et al. A clinical grade cocktail of cytokines and PGE2 results in uniform maturation of human monocyte-derived dendritic cells: implications for immunotherapy. Vaccine. 20, A8-A22 (2002).
  11. Bhardwaj, N. Harnessing the immune system to treat cancer. J. Clin. Invest. 117, 1130-1136 (2007).
  12. Gnjatic, S., Sawhney, N. B., Bhardwaj, N. Toll-like receptor agonists: are they good adjuvants?. Cancer J. 16, 382-391 (2010).
  13. Kedl, R. M., Kappler, J. W., Marrack, P. Epitope dominance, competition and T cell affinity maturation. Curr. Opin. Immunol. 15, 120-127 (2003).
  14. Bogunovic, D., et al. TLR4 engagement during TLR3-induced proinflammatory signaling in dendritic cells promotes IL-10-mediated suppression of antitumor immunity. Cancer Research. 71, 5467-5476 (2011).
  15. Verdijk, R. M., et al. Polyriboinosinic polyribocytidylic acid (poly(I:C)) induces stable maturation of functionally active human dendritic cells. J. Immunol. 163, 57-61 (1999).
  16. Rouas, R., et al. Poly(I:C) used for human dendritic cell maturation preserves their ability to secondarily secrete bioactive IL-12. Int. Immunol. 16, 767-773 (2004).
  17. Jongmans, W., Tiemessen, D. M., van Vlodrop, I. J., Mulders, P. F., Oosterwijk, E. Th1-polarizing capacity of clinical-grade dendritic cells is triggered by Ribomunyl but is compromised by PGE2: the importance of maturation cocktails. J. Immunother. 28, 480-487 (2005).
  18. Krause, P., et al. Prostaglandin E2 is a key factor for monocyte-derived dendritic cell maturation: enhanced T cell stimulatory capacity despite IDO. J. Leukoc. Biol. 82, 1106-1114 (2007).
  19. Morelli, A. E., Thomson, A. W. Dendritic cells under the spell of prostaglandins. Trends Immunol. 24, 108-111 (2003).
  20. Adams, M., et al. Dendritic cell (DC) based therapy for cervical cancer: use of DC pulsed with tumour lysate and matured with a novel synthetic clinically non-toxic double stranded RNA analogue poly [I]:poly [C(12)U] (Ampligen R). Vaccine. 21 (12), 787-790 (2003).
  21. Colombo, M. P., Trinchieri, G. Interleukin-12 in anti-tumor immunity and immunotherapy. Cytokine Growth Factor Rev. 13, 155-168 (2002).
  22. Mayordomo, J. I., et al. Bone marrow-derived dendritic cells pulsed with synthetic tumour peptides elicit protective and therapeutic antitumour immunity. Nat Med. 1, 1297-1302 (1995).
  23. Dhodapkar, M. V., et al. Rapid generation of broad T-cell immunity in humans after a single injection of mature dendritic cells. J. Clin. Invest. 104, 173-180 (1999).
  24. Schuler-Thurner, B., et al. Rapid induction of tumor-specific type 1 T helper cells in metastatic melanoma patients by vaccination with mature, cryopreserved, peptide-loaded monocyte-derived dendritic cells. J. Exp. Med. 195, 1279-1288 (2002).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

78

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены