Preparação do antigénio tumoral-carregados células dendríticas maduras para a imunoterapia

Resumo

O método mais vulgarmente usado para a geração de grandes números de células dendríticas autólogas (DCs), para uso na imunoterapia de tumores é descrita. O método utiliza a IL-4 e GM-CSF a partir de monócitos diferenciam DCs. As DC imaturas são estimuladas a maduro e, em seguida, carregado com os antigénios, antes de serem injectadas de novo no paciente.

Resumo

Embora estudos clínicos têm demonstrado que as vacinas DC antígeno-carregados são seguros e promissora terapia para tumores ^1, sua eficácia clínica ainda não foi estabelecida. O método descrito abaixo, preparadas de acordo com as Boas Processo de Fabricação (GMP), é uma otimização do método de preparação ex vivo mais comum para a geração de um grande número de DCs para estudos clínicos ^2.

Nosso método utiliza o TLR sintético 3 agonista Carboxymethylcellulose ácido poli-L-lisina Polyinosinic-Polycytidylic (Poly-ICLC) para estimular os DCs. O nosso estudo anterior estabeleceu que a poli-ICLC é o estímulo da maturação individual mais potente para DCs humanas, tal como avaliado por uma sobre-regulação de CD83 e CD86, a indução da interleucina-12 (IL-12), factor de necrose tumoral (TNF), o interferão-gama induzido proteína 10 (IP-10), interleukmin 1 (IL-1), e os interferões tipo I (IFN), e interleucina mínima 10 (IL-10) de produção. DCs são diferenciados a partir de células mononucleares do sangue periférico (PBMC congelados), obtidos por leucaferese. As PBMC são isoladas por centrifugação em gradiente de Ficoll e congelado em alíquotas. No dia 1, as CMSPs são descongelados e semeados em frascos de cultura de tecido para seleccionar os monócitos que aderiram à superfície plástica após 1-2 horas de incubação a 37 ° C na incubadora de cultura de tecido. Após a incubação, os linfócitos são lavados e os monócitos aderentes foram cultivadas durante 5 dias na presença de interleucina-4 (IL-4) e de granulócitos factor de estimulação de colónias de macrófagos (GM-CSF) para se diferenciarem para DCs imaturas. No dia 6, DCs imaturas são pulsadas com a proteína hemocianina de lapa buraco de fechadura (KLH), que serve como um controlo para a qualidade da vacina e pode aumentar-se a imunogenicidade da vacina contra a ^3. As DCs são estimuladas a amadurecer, carregado com antígenos peptídeos, e incubadas durante a noite. No dia 7, as células são lavadas, e congelado em alíquotas de 1 ml contendo4-20 x 10 ⁶ células, utilizando um congelador de taxa controlada. Testes de liberação de lote para os lotes de DCs é realizada e deve atender a especificações mínimas, antes de serem injetadas em pacientes.

Protocolo

1. O isolamento e a criopreservação de PBMCs ⁴

1. Assepticamente espiga de uma das portas de acesso na bolsa leucaferese utilizando um conjunto de transferência de plasma. Usando uma seringa de 60 ml, a transferência da leucaferese obtidos de pacientes em um frasco de 500 ml estéril.
2. Ajustar o volume da leucaferese para 2x o seu volume original usando RPMI temperatura ambiente. Misture bem.
3. Misture delicadamente a garrafa de Ficoll-Paque PLUS. Adicionar 12 ml de Ficoll-Paque Plus em tubo de 50 ml estéril.
4. Suavemente camada de 30 ml do produto de leucaferese diluído a cada tubo de 50 ml estéril contendo Ficoll. Ter cuidado para não perturbar a interface entre o Ficoll e suspensão de células.
5. Repita os passos 1.3 e 1.4 até que toda a leucaferese foram mergulhados.
6. Centrifugar os tubos cónicos de 50 ml a 1000 × g durante 20 minutos à temperatura ambiente sem travagem.
7. Colher cuidadosamente a camada turva de PBMCs de cada tubo e transfer para novos tubos estéreis de 50 ml.
8. Adicionar RPMI a cada tubo para um volume final de 50 ml. Misture delicadamente por inversão.
9. Centrifugar as células a 500 x g durante 10 min a 4 ° C, com travão integral.
10. Remove-se os sobrenadantes de cada tubo. Voltar a suspender as pelotas de células de cada tubo e adicionar meio RPMI para um volume final de 50 ml. Misture delicadamente por inversão.
11. Centrifugar as células a 500 x g durante 6 min a 4 ° C.
12. Remove-se os sobrenadantes de cada tubo. Ressuspender piscina e juntas as suspensões de células em um tubo de 50 ml.
13. Levar o volume das CMSPs reunidas até 50 ml com mais meio RPMI. Misture delicadamente por inversão.
14. Centrifugar as células a 300 x g durante 6 min a 4 ° C.
15. Remover o sobrenadante. Ressuspender o sedimento celular em 50 ml de RPMI. Misture com cuidado para assegurar a suspensão de células uniforme.
16. Conte o número de células e determinar a viabilidade celular. Calcular o número total de células viáveis.
17. Centrifugar as células em 300× g durante 6 min a 4 ° C. Prepare a mídia de congelamento. Meio de congelação é constituída de 10% de dimetilsulfóxido (DMSO; Miltenyi Biotec) em soro AB humano (Vale Biomedical).
18. Remover o sobrenadante. Ressuspender as células a uma concentração final de 2 x 10 ⁸ células / ml em meio de congelamento frio.
19. Faça alíquotas de 1 ml em criotubos de 1,8 ml.
20. Transfira os criotubos no congelador de taxa controlada e começar a correr congelamento, Programa 1. No final da corrida, a transferência dos criotubos congelados imediatamente para a fase de vapor do congelador de azoto líquido.

2. Dia 0: diferenciação de células dendríticas a partir de monócitos

1. Adicionar 30 ml de RPMI / 1% de plasma autólogo para um tubo de 50 ml estéril.
2. Alíquotas descongelamento de PBMCs congelados por agitação suave no banho de água 37 ° C. Quando completamente descongelado, transferir os conteúdos dos frascos com o tubo de 50 ml estéril. Misture bem.
3. Centrifugar as células de 6 mina 500 x g à temperatura ambiente. Remover o sobrenadante e ressuspender as células sedimentadas num pequeno volume de RPMI / 1% de plasma autólogo. Em seguida, adicionar mais RPMI / 1% de plasma autólogo até um volume final de 50 ml. Misture bem.
4. Centrifugar as células mais uma vez durante 6 minutos a 500 x g à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 50 ml de RPMI / 1% de plasma autólogo. Misture bem.
5. Conte o número de células e determinar a viabilidade celular. Calcular o número total de células viáveis.
6. Placa de 1,40 x 10 ⁸ células em 40 ml de RPMI / 1% de plasma autólogo para 225 centímetros ² EasyFlask. Repetir até que todas as células foram plaqueadas.
7. Incubar as EasyFlasks plana no seu lado para 1-2 horas a 37 ° C na incubadora de cultura de tecidos contendo 5% de _CO2 para permitir que os monócitos aderir ao balão.
8. Quando a incubação estiver completa, remover o EasyFlask da incubadora e lavar duas vezes para remover as células não aderentes using 30 ml de meio RPMI pré-aquecido.
9. Após a segunda lavagem, adicionar 40 ml de RPMI / 1% de plasma autólogo, com 400-1.000 UI / ml de IL-4 e 100-1.000 UI / ml de GM-CSF ^5-8. Para este protocolo, nós estamos usando 400 UI / ml IL-4 e 100 UI / ml de GM-CSF.
10. Incubar as EasyFlasks durante 2 dias a 37 ° C na incubadora de cultura de tecidos contendo 5% de CO _2.

3. Dia 2: A alimentação de células dendríticas com IL-4 e GM-CSF

1. Adicionar 4 ml de RPMI / 1% de plasma autólogo, com 400-1.000 UI / ml de IL-4 e 100-1.000 UI / ml de GM-CSF para cada EasyFlask. Misture agitando e balançando ao seu lado.
2. Incubar as EasyFlasks para mais 3 dias (até ao dia 5), a 37 ° C na incubadora de cultura de tecidos contendo 5% de CO _2.

4. Dia 5: Colheita de células dendríticas imaturas

1. Colher as culturas agitando vigorosamente os frascos e pipetando cima e para baixo para voltar a suspender as células não aderentes e pouco aderente. Transferir océlulas colhidas para novos 50 ml tubos cônicos.
2. Centrifugar os tubos a 500 x g durante 6 min à temperatura ambiente. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 50 ml de RPMI / 1% de plasma autólogo. Misture bem.
3. Conte o número de células e determinar a viabilidade celular. Calcular o número total de células viáveis.
4. Centrifugar os tubos a 500 x g durante 6 min à temperatura ambiente. Placa de 1-2 x 10 ⁶ culas por po em 3 ml de RPMI / 1% de plasma autólogo, com 400 UI / ml de IL-4 e 100 UI / ml de GM-CSF em placas de cultura de tecidos de 6 poços.
5. Incubar as placas a 37 ° C na incubadora de cultura de tecidos contendo 5% de CO ₂ durante a noite.

5. Dia 6: Maturação e Antígeno Carregando de células dendríticas

1. Adicionam-se 10 ug / ml de KLH a 1/3 dos poços das placas de cultura de 6 poços. Redemoinho as placas para misturar. KLH só é adicionada a 1/3 dos poços KLH porque é usado apenas para a primeira vacina DC. Subseqüente DC vacinas conTain apenas os péptidos de antigénios tumorais.
2. DCs podem ser estimuladas a amadurecer com diferentes estímulos. Os estímulos de maturação mais comum que tem sido usado em estudos clínicos, tem sido um cocktail de citocinas (IL-1 β, TNFa e IL-6) e prostaglandina E2 _(PGE2) ^9,10. Mais recentemente, a utilização de agonistas do receptor do tipo Toll (TLR) ganharam popularidade ^11,12. Neste protocolo, adicionar 2 mg / ml de carboximetilcelulose em ácido poli-L-lisina-Polyinosinic Polycytidylic (Poli-ICLC) aos poços e misturar bem. Poli-ICLC é a formulação clínica grau de poli-CI que é estabilizado com poli-L-*-lisina e carboximetilcelulose (fabricado pela Oncovir, Inc.).
3. Adicionam-se 100 ug / ml de antigénios peptídicos longas (NY-ESO-1 e / ou Melan-A/MART-1) designados para os seus poços, cada poço recebe apenas um único péptido a evitar competição cruzada ^13.
4. Incubar as placas a 37 ° C na incubadora de cultura de tecidos contendo 5% de CO _{2 S / N.}

6. Dia 7: Criopreservação de células dendríticas

1. Preparar a solução de congelamento DC usando plasma autólogo e 10% DMSO. Centrifugar a solução de congelação DC a 2000 × g durante 20 min a 4 ° C para remover qualquer matéria em partículas. Transferir o sobrenadante para um novo tubo de 15 ml rotulados cónica. Armazenar a 4 ° C até utilização.
2. Quando a incubação durante a noite está terminado, a colheita e piscina todos os poços que contêm as DCs pulsadas com péptidos em tubos cónicos de 50 ml.
3. Centrifugar os tubos a 500 × g por 6 min. Remove-se os sobrenadantes. Ressuspender o sedimento de células em 5 ml de RPMI / 1% de plasma autólogo. Levar o volume total a 50 ml com RPMI / 1% de plasma autólogo. Misture bem.
4. Conte o número de células e determinar a viabilidade celular. Calcular o número total de células viáveis.
5. Centrifugar os tubos a 500 × g por 6 min à temperatura ambiente. Remover o sobrenadante e ressuspender cada pellet em 5 ml sterile 0,9% de NaCl, USP e transferência para novos tubos de 15 mL cónicos. Traga a cada suspensão de células para 14 ml com mais estéril a 0,9% de NaCl, USP. Tampar e misturar por inversão.
6. Repetir etapa anterior por duas vezes. Após a última centrifugação, remove-se os sobrenadantes, ficando tão próximo quanto possível para as pelotas de células, sem perturbar os sedimentos.
7. Ressuspender as células em peletes DC Solução de congelação em 4 - 20 x 10 ⁶ células / ml e alíquotas de 1 ml a cada frasco 1,8 ml de tubo criogénico.
8. Usar o congelador de taxa controlada, um programa, para congelar as alíquotas de vacinas DC e transferir imediatamente para a fase de vapor de um congelador de azoto líquido durante a armazenagem a longo prazo.

7. Lote testes de liberação

1. Cada lote de vacina DC devem ser avaliados e atender aos critérios de liberação de lote específicos (Tabela 1), antes de ser liberado para injeção em pacientes no estudo, tipicamente de 5 a 6 semanas após a preparação da vacina.
2. Viabilidade:Avaliar a viabilidade da vacina DC utilizando um contador de células automatizado. A especificação mínima aceitável é de viabilidade> 70%.
3. Identidade: Avaliar a identidade do DCs maduras (CD11c + CD14-CD83 +) por citometria de fluxo. A percentagem de células + CD11c deve ser> 50%. A percentagem de células CD14 + e CD11c + deve ser <30%, e a percentagem de CD11c +, CD14-e células CD83 + devem ser> 50%.
4. Esterilidade: Testar a vacina DC para a presença de bactérias e fungos anaeróbio e aeróbio por cultura direta e manchas de grama. Avaliar a presença de micoplasma usando um sistema de cultura directa e ADN fluorocromo Ensaio de Coloração com a linha celular indicadora. Para estes testes, o conjunto mínimo de especificação é que não se observa o crescimento de todas as culturas.
5. A endotoxina: Avaliar o teor de endotoxina utilizando o ensaio de LAL cromogénico cinético Kinetic QCL-e que deve ser <50 EU / ml para satisfazer os critérios mínimos.
6. Função: Avaliar a função DC em uma reação mista de linfócitos através da incubação com as células T alogênicas. A presença de proliferação em comparação com DCs não estimuladas é reportado (Figura 3).

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Resultados

Entre 10 - 20% a partir de PBMCs diferenciarem em DCs no final do período de cultura. DCs maduras são CD11c +, CD14-, CD83 +, CD40 + e CCR7 + (Figura 1). Eles expressam altos níveis de moléculas MHC classe II, as moléculas co-estimulatórias CD80 e CD86 e eu e. Poli-ICLC também induziu níveis baixos de PDL-1, em comparação com outros agonistas de TLR ^14. Além disso, estas DCs segregam grandes quantidades de poli-IC-maturados de IL-12 (Figura 2 e ^15,16) e ...

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Discussão

Fase I e II de ensaios clínicos de DCs derivadas de monócitos têm mostrado que induzem respostas imunitárias em pacientes, no entanto o sucesso clínico tem sido limitada ^1. Isto pode ser em parte devido à falta de consenso sobre a forma de gerar os DCs óptimas para a utilização de imunoterapia tumoral. Embora haja várias maneiras de gerar DCs clínico grau, estes métodos variam em termos do uso de citocinas utilizadas para diferenciar os monócitos, os estímulos utilizados para induzir a maturaç?...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI-1640 medium with L-glutamine	BioWhittaker	12-702F
1M HEPES buffered saline	BioWhittaker	17-737E
Phosphate buffered saline (PBS)	BioWhittaker	17-516F
Human albumin, 25% solution USP	Aventis Behring
Ficoll-Hypaque PREMIUM	GE Healthcare	17-5442-03
Human AB serum	Valley Biomedical	HP1022
Sterile saline USP	Hospira
CryoMACS DMSO	Miltenyi Biotec	170-076-303
Leukine GM-CSF, 0.5 mg/ml	Berlex	A02266
MACS GMP IL-4	Miltenyi Biotec	170-076-101
Hiltonol, Poly-ICLC, 2 mg/ml	Oncovir	NA
VACMUNE KLH	Biosyn
225 sq cm EasyFlasks	Nalgene Nunc	159934
Falcon 6-well tissue culture plates	Becton Dickinson	353046
1.8 ml CryoTube vials	Nalgene Nunc	377267
Controlled Rate Freezer	Thermo	CryoMed