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要約

ここでは、3D顕微鏡や分析（3D免疫DNA FISH）が続いたDNA FISHによる蛍光抗体法およびDNA配列によるヒストン修飾の同時検出のためのプロトコルを記述します。

要約

3D共焦点顕微鏡（3DのDNA FISH）を、続いて3次元的に保存核にDNAプローブを用いた蛍光 in situハイブリダイゼーションは、個々の細胞における遺伝子座の位置、サブ領域の染色体または全体の領土を視覚化するための最も直接的な方法を表しています。このタイプの分析は、核のグローバルアーキテクチャだけでなく、核空間内の特定のゲノム遺伝子座や地域の行動への洞察を提供します。免疫蛍光法は、他の一方で、核タンパク質の検出（修正ヒストン、ヒストンバリアントと修飾、転写機構や要因、原子力サブコンパートメントなど）を許可します。免疫蛍光法および3DのDNA FISHを組み合わせるにおける主要な課題は核の3Dアーキテクチャと同様に抗体によって検出されるエピトープを保持する一方であり、他方では、DNAプローブの浸透が検出できるように遺伝子座や染色体テリトリーの1月5日。ここでは、3D保存核内ゲノム遺伝子座とクロマチン修飾の可視化を組み合わせたプロトコルを提供します。

概要

エピジェネティックなメカニズムトリガ成立と発達と細胞型特異的転写プロファイルの継承。 1レベルでこれは、アクティブまたはサイレントゲノム領域を定義クロマチン包装の変調を伴う。大規模に、ゲノムと核構造のグローバル3D組織はまた、転写パターンの制御に役割を果たしています。したがって、これらのepigenomic機能の解剖は、遺伝子が6-11を規制されている方法を完全に理解するために不可欠です。

組み合わせた免疫蛍光法および3DのDNA FISHは、特異的な相互作用/核内のDNA配列および/またはタンパク質の関連を評価することによって、分子および生化学的解析を補完するユニークな機会を提供します。さらに、このようなクロマチン免疫沈降（ChIP-seq）が染色体またはキャプチャのコンフォメーションなどのゲノムワイドなハイスループット技術は深いシーケンシングと相まってしばらく（4C-SEQ、5Cは、Hi-C）にグローバルdatを提供細胞集団は12日 、免疫蛍光/ DNA FISHの技術は、単一細胞レベルでの解析を可能にします。

ここでは、3D顕微鏡や分析（3D免疫FISH）が続いたDNA FISHによって免疫蛍光法およびDNA配列によってヒストン修飾の同時検出のためのプロトコルを記述します。このプロトコルの利点は、DNAやタンパク質の構造の保全を組み合わせた視覚化したものです。この分野での我々の経験では、既存のプロトコルを改善し、簡素化することができるようになりました。我々は組換えを受けてリンパ球におけるDNA二本鎖切断を検出するには、このプロトコルを使用していたが、この方法は、他のタンパク質と他の細胞型に適用することができます。

プロトコル

1。フルオロフォアとのDNAプローブのラベリング：ニック翻訳（〜6時間）

  1. クリーンBAC DNA（マキシプレップにより調製）またはプラスミドやPCR産物は、H 2 Oに再懸濁した全てが、標識に使用することができます注堅牢FISHの信号については、プローブは少なくとも10キロバイトに及ぶべきであること。
  2. 37℃（全ての試薬 ​​を表1に記載されています）で30分間のRNaseのDNAインキュベートする。
  3. 16℃（ 表2、表3を参照）で2時間、ニックトランスレーション反応をインキュベートする。直接標識の代替方法は、（：魚タグ、インビトロジェン例）を使用することができる。
  4. -80℃で1時間反応を不活性化する-20℃℃または一晩
  5. 2％アガロースゲル上でプローブサイズを決定します。塗抹標本は、約300から500塩基対（Cy5でプローブのスミアが表示されていないことに注意してください ）での過半数で、100〜1,000 bpの間でなければなりません。 DNAが十分に消化されていない場合は、それ以上のDNA Pol IはとDNase Iを反応に添加し、16℃でさらに2時間インキュベートすることができます
  6. 暗闇の中で2時間、H 2 0で埋め2リットルビーカーで0.025ミリメートルフィルター上のプローブを精製する。
  7. 次のようにプローブにブロッキング要因を追加します：COT-1 DNA、Hybloc10μgのDNAとDNAプローブ10μgのためのサケ精子の100μg10μgの。 -20℃で保存されたDNAプローブ

2。プローブ降水量/変性/プレアニーリング（3-4時間）

  1. 0.3μgおよびDNAプローブ1μgの間には、カバースリップあたりに使用されます。ミックス-80℃で1時間インキュベート3M NAACの0.1倍量（pH5.2）との100％エタノールを2.5倍量のプローブ、℃または-20℃で一晩、4℃、13,000 rpmでスピンダウン℃で30分間。 DNAプローブの量はDNAとハイブリダイゼーションの核領域の品質に応じて調整することができることに注意してください。直接標識の代替方法は、減少した量の使用を許すかもしれませんプローブ。 1スライド上の複数のDNA FISHシグナルの検出のために、異なるプローブ（反復配列のようなプレアニーリングしてはならないプローブを除く）一緒に沈殿させることができる。同時に行われ、いくつかの実験のためのプローブも一緒に析出させることができる。ペレットを軽く（プローブの少量が沈殿している場合は、ペレットが見えないかもしれません）を使用する蛍光団によると着色することがあります。
  2. 乾燥ペレットと37から45℃（約20分間）で暗所（エッペンドルフサーモミキサーを使用して）を振とうしながらカバースリップあたり（ 表4を参照）15μlのハイブリダイゼーション緩衝液で再懸濁します。
  3. 75から95で5分間変性プローブ​​℃、
  4. 30〜60分間、37℃でプローブをプレアニール。プレアニールの長さは、プローブの複雑さと品質に応じて調整することができる。
  5. 一晩ハイブリダイゼーション用のカバーガラス（セクション3を参照）にプローブを適用します。

3。 3次元DNA魚 - 一日目（〜3時間）

  1. 非接着細胞を1×PBS（カバースリップあたり5〜10μlの1×PBS中〜2×10 5細胞）を少量に濃縮し、ポリ-L-リジンコートカバースリップの中央にドロップされます。接着細胞は、少なくとも24時間（〜70％コンフルエント）（カバーガラスを0.1％ゼラチンでコーティングしてもよい）のカバースリップ上で培養されるべきである。スクエア18×18に24〜24ミリメートルのカバーを6ウェルプレートに配置され、プロトコル全体、各溶液2ミリリットルを（あるいはラウンド1.5mmのカバーガラスが12/24-wellプレートに配置することができます）ウェルあたりに使用されます。
  2. RT（4％PFAの株式は-20℃で保存し、等分することができます）で10分間、2％パラホルムアルデヒド/ 1×PBS、pHが7から7.4で細胞を固定してください。パラホルムアルデヒド（16％）溶液で購入することができ、または4％の原液を粉末/プリルから調製することができる。パラホルムアルデヒド粉末を調整し、氷の上で> 60℃（pHは溶解を容易にするために8-9に増加させることができる）、冷却されたダウンで1X PBSに溶解さED pHが7から7.4にし、濾過し、ハヤブサに分注し、-20℃で週間保存
  3. 1X PBSで3回洗浄した後、氷上で5分間冷やした冷0.4パーセントトリトン-X-100 / 1X PBSで細胞を透過。透過処理の長さは、細胞型に応じて調整することができるNBは ：DNAのFISHは免疫と組み合わされている場合は、免疫染色は（ セクション4を見てください）、この段階で行うべきである。
  4. 37℃で1時間、1×PBS、1×PBS中の0.1μg/μLのRNase Aを持つインキュベート細胞内で3回洗浄した後℃にカバースリップをパラフィルムで解決策または湿潤チャンバー内のスライドの100μlの上にドロップセル側を下に配置されます。カバースリップを慎重にピンセットで除去されます。任意の抵抗が発生した場合は、カバーガラスは、細胞の損傷を避けるために、1×PBSでフラッディングされなければなりません。
  5. 1X PBSで3回洗浄した後、氷上で10分間冷やした冷0.7パーセントトリトン-X-100 / 0.1M HCl中で細胞を透過。
  6. 3回洗浄した後、私nを1×PBS、室温で30分間1.9 M塩酸で変性細胞。交互に、細胞を少なくとも30分間75から80℃で50％ホルムアミド/ 2×SSC中で変性させることができます。ハイブリダイゼーション長（および温度）細胞型に応じて最適化することができることに注意してください 。
  7. 氷冷1X PBSで3回洗浄した後、℃の暗多湿室で37℃で一晩プローブを用いて細胞をハイブリダイズする。カバーガラスをスライド上のプローブの15μlの上にドロップセル側を下に置かれ、ラバーセメントで封止されている。

4。 3次元免疫魚 - 初日（6月7日〜HR）

  1. 組み合わせた免疫蛍光DNA /魚のため、免疫染色は、0.4％トリトンX-100（ ステップ3.3）で透過処理した後に実行されるべきである。
  2. 室温で30分（2.5％ウシ血清アルブミン（BSA）、10％正常ヤギ血清、0.1％のTween-20）のためにブロッキング溶液中で細胞をインキュベートします。ブロッキング溶液を濾過し、1.5mlのEppendorfsに等分し、mに格納されている-20℃でonths
  3. 湿潤チャンバー内の室温で1時間、タンパク質またはブロッキング溶液で希釈した関心のヒストン修飾に対して惹起された一次抗体を用いて細胞を培養する。ここでは、H2AXのリン酸化セリン-139（;詳細については、 表5を参照して 、γ-H2AX、ミリポア）に対する抗体の一例を示す。カバースリップをパラフィルムで解決策または湿潤チャンバー内のスライドの100μlの上にドロップセル側を下に配置されます。カバースリップを慎重にピンセット（必要に応じて1×PBSで水浸し）で削除されます。希釈およびインキュベーション長は抗体および細胞型の品質に応じて調整することができることに注意してください。
  4. 振とうしながら、0.2％のBSA / 0.1％のTween-20/1×PBS、室温で3時間5分で細胞を洗浄します。
  5. 暗くて湿ったチャンバー内で室温で1時間ブロッキング溶液で希釈した適切な蛍光色素標識二次抗体を用いて細胞をインキュベートします。ここでは、との検出の例を示す二次ヤギ抗マウス抗体（のAlexa Fluor 488または555、インビトロジェン、詳細については表5を参照）。ハプテン標識二次抗体（ビオチン、ジゴキシゲニン、等）を使用することもできる。この場合、適切な検出（ストレプトアビジン、抗DIG、etc）のための余分なステップは一晩、DNA-FISHハイブリダイゼーションの前または後に実行することができます。
  6. 暗闇の中で振とうしながら、0.1％のTween-20/1×PBS、室温で3時間5分で細胞を洗浄します。
  7. 暗闇の中で室温で10分間、2％パラホルムアルデヒド/ 1X PBSでポストフィックス細胞。
  8. 前述のRNase A（ ステップ3.4）中でのインキュベーションからのDNA FISHを続ける。

5。 3次元DNA FISH /免疫魚 - 2日目（〜2時間）

  1. 慎重にラバーセメント、2X SSCと洪水のカバーを取り外し、慎重にピンセットで除去し、洗浄液を含むウェルの中に置いてください。
  2. 37℃で30分間振とうしながら、暗闇の中でCの2×SSC中で細胞を洗浄します。
  3. 振盪しながら、暗闇の中で、室温で30分間2×SSC中で細胞を洗浄します。
  4. 振盪しながら、暗闇の中で、室温で30分間1×SSC中で細胞を洗浄ホルムアミドと変性の場合には、洗浄は、次のように置き換えなければならないことに注意してください：50％ホルムアミド/ 2×SSCおよび2x SSC、5で3回洗浄で3回洗浄37℃で、それぞれをmin℃に
  5. 全DNAの対比は1.5μg/ mlのDAPI（4,6 - ジアミジノ-2 - フェニル）を含むゴールドマウンティングメディウムを延長で細胞をマウントします。カバーガラスをスライド上に媒体をマウントの10〜15μlのドロップにセル側を下に配置し、マニキュアで封止されている。スライドは、-20℃で数ヶ月の​​ために保持されてい

6。 3D顕微鏡と分析

  1. 3D画像は、異なる顕微鏡システムで取得することができます。我々の実験では、0.3μm以下で区切ら光学切片はライカSP5 AOBS共焦点システム（音響光学ビームスプリッタ）で収集されます。 視神経の間の分離に注意してくださいリットルプレーンは分析の種類に応じて調整することができる。
  2. 3D画像スタックは、さまざまなソフトウェアやツールを用いて分析することができる。我々は、関心のある遺伝子座の間の距離の測定値を評価するために、サブ核コンパートメントまたはタンパク質と興味のある遺伝子座の協会の様々なタイプを分析するイメージJソフトを使用しています。
  3. 異なる種類の細胞やステージ間の比較は、目的の異なる遺伝子座の間の比較：すべての統計分析は意義のペアごとの評価（複数可）と2（またはそれ以上）の異なる生物学的条件を比較するために行われている。 1.00E-3≤P≤1.00E-2 *;すべての統計的検定では、P値≤5.00E-2（= 0.05）（1.00E-2≤*著しいP≤5.00E-2重要であると解釈される*非常に重要な、P <1.00E-3 ***非常に重要）。

二つの対立遺伝子間の距離の全体の分布の統計解析。我々は最初のc我々はノンパラメトリック二標本コルモゴロフ·スミルノフ（KS）のテスト13,14を使用する実証的対立遺伝子間の距離の分布の差の有意性を評価する2 alleles.To間で測定された距離の範囲全体にわたって累積分布の周波数曲線をonstruct。

カットオフの最適な距離を使用して、2つの対立遺伝子の密接な関連の統計解析（すなわちペアリング）。二つの対立遺伝子または遺伝子座の間の距離で最も堅牢な差の範囲を指定するには、我々は2つのテールフィッシャー正確確率検定15秒のシリーズをご使用ください。すなわち、それぞれの測定距離で、我々は一つの条件が大幅に2つのサンプル間の短い距離で過剰表現されているかどうかをテストします。 P値の分布の最小値は、二つの対立遺伝子の密接な関連のカットオフ（ すなわちペアリング）として考慮されるべきである距離の範囲を示しています。続いて2テールフィッシャー正確確率検定は、tを使用されている同定されたカットオフ値15で2つの対立遺伝子のペアリングの意義を評価O。多重検定補正は16を実行フィッシャーテストの総数を考慮するために適用されます。

サブ核コンパートメントまたはタンパク質と目的の遺伝子座の協会の統計分析は、2つのテールフィッシャー正確確率検定は、異なる区画またはタンパク質15を用いて目的の遺伝子座の協会の意義を分析するために使用されます。

結果

DNAと免疫FISHはBおよびTリンパ球の開発時に抗原受容体遺伝子座のV（D）J組み換えのプロセスに関連付けられている核の組織の変化を研究するためにSkokラボで使用されています。私に私たちを有効にする）遺伝子座の両端（収縮）の間の測定距離は上記の詳細技術ⅱ）対立遺伝子または遺伝子座の間の測定距離（ペアリング）、iii）は座、静脈内で発生するDNA損傷を解析するには）対立遺伝?...

ディスカッション

上記の詳細テクニックは、リンパ球の30,31を開発中の免疫グロブリンおよびTCRA / D座のV（D）J組み換えの規制を分析するために私たちの研究室で使用されていた。我々は、この技術は、異なる細胞型では、様々な核タンパク質、核コンパートメントと遺伝子座の検出に適応させることができると確信しています。プロトコルの修正が必要になることがあり、この場合に集?...

開示事項

著者らは、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

謝辞

我々は、議論とコメントのためのスザンナ·ヒューイット、特に、Skokラボのメンバーに感謝したいと思います。この作品は、健康補助金総合研究所R01GM086852、RC1CA145746（JAS）によってサポートされています。 JASは白血病リンパ腫協会の学者です。 JCは、がん研究所のア​​ーヴィング研究所フェロー。 MMは、国立科学財団助成統合大学院教育研究見習（NSF IGERT 0333389）によってサポートされています。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
試薬/材料の名称 会社 カタログ番号 注釈
H 2 O フィッシャー ＃BP2470
アーゼシグマ ＃R4642
のdNTP シグマ ＃DNTP100
アレクサdUTPをインビトロジェン C-11401に＃C11397
Cy3またはCy5 dUTPをフィッシャー ＃45-001-XXX
DNase Iをロッシュ ＃04536282001
DNA Pol Iはバイオラボズ ＃M0209
0.025μmフィルター Millipor電子 ＃VSWP02500
COT-1 DNAを1 mg / mlのインビトロジェン ＃18440
Hybloc DNAを1 mg / mlの応用遺伝学 ＃MHB
サケ精子シグマ ＃D1626 粉末をH 2 O中に10 mg / mlで再懸濁される
NAAC（酢酸ナトリウム、pH 5.2緩衝液） シグマ ＃S7899
フィコール400（モルBIOLグレード） フィッシャー第525位
ポリビニルピロリドン（MOL BIOLグレード） フィッシャー ＃BP431
デキストラン硫酸パウダーシグマ ＃D8906
SSPE（生理食塩水リン酸ナトリウム、EDTA）を20倍ソリューションフィッシャー ＃BP1328
ホルムアミドフィッシャー ＃BP227
カバースリップフィッシャー ＃12-548-B
スライドフィッシャー ＃12から550
6ウェルプレートフィッシャー ＃0720080
10×PBS、 フィッシャー ＃MT-46-013-CM
ポリ-L-リジン溶液シグマ ＃P8920
パラホルムアルデヒド、プリル、95％ シグマ ＃441244
トリトンX-100、MOL BIOLグレードシグマ ＃T8787
BSA（ウシ血清アルブミン）フラクションV フィッシャー ＃BP 1600
正常ヤギ血清ベクトルラボ ＃S-1000
Tween-20を、モルBIOLグレードシグマ ＃P9416
SSC（食塩クエン酸ナトリウム）20倍ソリューションフィッシャー ＃BP1325
Gold退色防止試薬を延長インビトロジェン ＃P36930
DAPI（4 '、6 - ジアミジノ-2 - フェニルインドール） シグマ ＃D9542
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表1に特異的な試薬及び小型機器。

参考文献

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