Immunofluorescence combinés et FISH ADN sur 3D préservé noyaux en interphase pour étudier les changements dans l'organisation nucléaire 3D

Résumé

Nous décrivons ici un protocole pour la détection simultanée des modifications des histones par des séquences d'ADN immunofluorescence et par FISH ADN suivies par microscopie 3D (3D et des analyses immuno-FISH ADN).

Résumé

Hybridation fluorescente in situ utilisant des sondes ADN sur le 3-dimensions noyaux conservés suivie par microscopie confocale 3D (FISH ADN 3D) représente le moyen le plus direct pour visualiser l'emplacement des loci de gènes, chromosomes sous-régions ou des territoires entiers dans des cellules individuelles. Ce type d'analyse permet de mieux comprendre l'architecture globale du noyau ainsi que le comportement des loci génomiques spécifiques et des régions dans l'espace nucléaire. Immunofluorescence, d'autre part, permet la détection des protéines nucléaires (histones modifiées, variants d'histones et des modificateurs, des machines et des facteurs de transcription nucléaires, sous-compartiments, etc.) Le problème majeur en combinant FISH ADN immunofluorescence et 3D est, d'une part, de préserver l'épitope détecté par l'anticorps, ainsi que l'architecture 3D du noyau, et d'autre part, pour permettre la pénétration de la sonde d'ADN pour détecter loci chromosomiques ou territoires ^1-5. Ici, nous fournissons un protocole qui combine la visualisation des modifications de la chromatine avec loci génomiques conservées dans les noyaux 3D.

Introduction

Épigénétique mise en place de mécanismes de déclenchement et l'héritage de développement et d'un type de cellule spécifique profils transcriptionnels. À un certain niveau, cela implique la modulation de empaquetage de la chromatine qui définit des régions génomiques actifs ou silencieux. À plus grande échelle, l'organisation mondiale de la 3D et de l'architecture du génome nucléaire jouent également un rôle dans le contrôle des motifs de la transcription. Ainsi, la dissection de ces caractéristiques épigénomiques est essentielle pour une compréhension complète de la façon dont les gènes sont régulés ^6-11.

Combiné FISH ADN immunofluorescence et 3D offrent une occasion unique de compléter les analyses moléculaires et biochimiques en évaluant les interactions spécifiques / associations de séquences d'ADN et / ou de protéines dans le noyau. En outre, alors que l'ensemble du génome techniques à haut débit tels que immunoprécipitation de la chromatine (ChIP-seq) ou la conformation de capture chromosome couplé avec le séquençage profond (4C-seq, 5C, Salut-C) fournir dat mondialeun sur ¹² populations de cellules, les techniques d'immunofluorescence POISSON / ADN permettre des analyses au niveau de la cellule unique.

Nous décrivons ici un protocole pour la détection simultanée des modifications des histones par des séquences d'ADN immunofluorescence et par FISH ADN suivies par microscopie 3D et des analyses (3D immuno-FISH). L'avantage de ce protocole est la visualisation combinée de l'ADN et la préservation de la structure des protéines. Notre expérience dans ce domaine nous a permis d'améliorer et de simplifier les protocoles existants. Bien que nous ayons utilisé ce protocole pour détecter l'ADN des cassures double brin dans les lymphocytes subissent une recombinaison, cette méthode peut être appliquée à d'autres protéines et d'autres types de cellules.

Protocole

1. Étiquetage sonde d'ADN avec des fluorophores: Nick Translation (~ 6 h)

1. Propre ADN de BAC (préparé par maxi-prep) ou des plasmides ou des produits de PCR, tous remis en suspension dans H ₂ O, peut être utilisé pour le marquage. Notez que pour un signal FISH robuste, sondes doivent couvrir au moins 10 kb.
2. Incuber ADN dans RNase A pendant 30 min à 37 ° C (Tous les réactifs sont énumérées dans le tableau 1).
3. Incuber la réaction translation de coupure pendant 2 heures à 16 ° C (voir les tableaux 2 et 3). D'autres méthodes de marquage direct peut être utilisé (Exemple: Tag FISH, Invitrogen).
4. Inactiver la réaction pendant une heure à -80 ° C ou une nuit à -20 ° C.
5. Déterminer la taille de la sonde sur un gel d'agarose à 2%. Le frottis doit être comprise entre 100 et 1000 pb, avec la majorité, à environ 300-500 pb (Notez que le frottis de Cy5-sondes n'est pas visible). Si l'ADN est digéré pas assez, plus l'ADN Pol I etDNase I peut être ajouté au mélange réactionnel et on incube pendant deux heures plus à 16 ° C.
6. Purifier sondes sur 0,025 mm de filtres deux béchers litres remplis de H ₂ 0 pendant deux heures dans l'obscurité.
7. Ajouter facteurs de blocage des sondes comme suit: 10 pg d'ADN Cot-1, 10 pg d'ADN Hybloc et 100 pg de sperme de saumon pour 10 pg de sondes d'ADN. Des sondes d'ADN conserver à -20 ° C.

2. Sonde de précipitation / dénaturation / pré-recuit (h 3-4)

1. Entre 0,3 pg et 1 pg de sonde d'ADN est utilisé par lamelle. Sondes mélanger avec 0,1 volume de 3M NaAc (pH 5,2) et 2,5 volumes d'éthanol à 100%, incuber pendant une heure à -80 ° C ou une nuit à -20 ° C et centrifuger à 13000 rpm à 4 ° C pendant 30 min. A noter que la quantité de sonde d'ADN peut être ajustée en fonction de la qualité de l'ADN et la région nucléaire de l'hybridation. D'autres méthodes de marquage direct peut permettre l'utilisation de quantités réduites desonde. Pour la détection de multiples signaux FISH ADN sur une diapositive, les différentes sondes peuvent être précipités ensemble (à l'exception des sondes qui ne doit pas être pré-recuit, comme des séquences répétées). Sondes pour plusieurs expériences réalisées dans le même temps peut également être précipité en même temps. Pellets doivent être légèrement colorés selon les fluorophores utilisés (si de petites quantités de sondes sont précipités, le culot peut ne pas être visible).
2. Granulés secs et les remettre en suspension dans 15 ul de tampon d'hybridation (voir tableau 4) par lamelle avec agitation (à l'aide d'un thermomixer Eppendorf) dans l'obscurité à 37-45 ° C (pendant environ 20 mn).
3. Sondes dénaturer pendant 5 min à 75-95 ° C.
4. Pré-recuit sondes à 37 ° C pendant 30-60 min. Longueur de pré-recuit peut être ajustée en fonction de la complexité et de la qualité des sondes.
5. Appliquer des sondes pour les lamelles d'hybridation pendant la nuit (voir la section 3).

3. 3Dimensions FISH ADN - Premier Jour (~ 3 h)

1. Les cellules non adhérentes sont concentrés dans un petit volume de PBS 1x (~ 2x10 ⁵ cellules à 5-10 pl de PBS 1x par lamelle) et tombe sur le centre d'une lamelle couvre-poly-L-lysine enrobée. Les cellules adhérentes doivent être cultivées sur des lamelles pendant au moins 24 heures (~ 70% de confluence) (lamelles peuvent être revêtus de gélatine à 0,1%). Lamelles carrées 18x18 mm à 24-24 sont placées dans des plaques 6 puits, et tout au long du protocole, deux ml de chaque solution est utilisée par puits (alternativement rondes 1,5 mm lamelles peuvent être placés dans des plaques 12/24-well).
2. Fixer les cellules dans du paraformaldéhyde à 2% / PBS 1x, pH 7 à 7,4, pendant 10 min à température ambiante (4% des stocks PFA peut être aliquotés, stocké à -20 ° C). Paraformaldéhyde peuvent être achetés en solution (16%), ou des solutions mères 4% peut être préparé à partir de poudre / granulés. Paraformaldéhyde en poudre est dissoute dans du PBS 1x à> 60 ° C (pH peut être augmenté à 8-9 pour faciliter la dissolution), refroidie sur la glace, réglezà pH 7 à 7,4 ed, filtré, aliquoté dans des faucons et stockées pendant des semaines à -20 ° C.
3. Après trois rinçages dans PBS 1x, perméabiliser les cellules de glace-froid 0,4% de Triton-X-100/1 x PBS pendant 5 min sur la glace. Longueur de perméabilisation peut être ajustée en fonction de la cellule de type NB:. Si FISH ADN est combiné avec l'immunofluorescence, l'immunomarquage doit être effectuée à ce stade (voir la section 4).
4. Après trois rinçages dans PBS 1x, incuber les cellules avec 0,1 ug / ul RNase A en 1x PBS pendant une heure à 37 ° C. Lamelles sont placées côté cellule vers le bas sur une baisse de 100 pi de solution sur du parafilm ou une diapositive dans une chambre humide. Lamelles sont ensuite soigneusement retiré avec une pince. Si une résistance est rencontrée, lamelles doivent être inondé de 1x PBS afin d'éviter d'endommager les cellules.
5. Après trois rinçages dans PBS 1x, perméabiliser les cellules de glace-froid 0,7% de Triton-X-100 HCl / 0,1 M pendant 10 min sur la glace.
6. Après trois rinçages in 1x PBS, les cellules dénaturer dans HCl 1,9 M pendant 30 min à température ambiante. Alternativement, les cellules peuvent être dénaturées dans 50% de formamide / 2x SSC à 75-80 ° C pendant au moins 30 min. Noter que la longueur d'hybridation (et de la température) peut être optimisée en fonction de la cellule-type.
7. Après trois rinçages dans de la glace-froid 1x PBS, les cellules s'hybrider avec des sondes nuit à 37 ° C dans une chambre sombre et humide. Lamelles sont placées côté cellule vers le bas sur une baisse de 15 pl de sonde sur une diapositive, et scellé avec du ciment de caoutchouc.

4. 3-dimensionnelle d'immuno-FISH - Premier jour (~ 6-7 h)

1. Pour combiner immunofluorescence / DNA FISH, l'immuno-marquage doit être effectué après la perméabilisation de 0,4% de Triton-X-100 (étape 3.3).
2. Incuber les cellules dans une solution de blocage pendant 30 min à température ambiante (2,5% de sérumalbumine bovine (BSA), sérum de chèvre normal à 10%, 0,1% Tween-20). La solution de blocage est filtré, aliquoté dans eppendorfs de 1,5 ml et stocké pour mois à -20 ° C.
3. Incuber les cellules avec l'anticorps primaire dirigé contre la protéine ou la modification d'histone d'intérêt dilué dans une solution de blocage, pendant une heure à température ambiante en chambre humide. Ici, nous montrons l'exemple d'un anticorps contre phosphorylés sérine-139 de H2AX (γ-H2AX, Millipore, voir le tableau 5 pour plus de détails). Lamelles sont placées côté cellule vers le bas sur une baisse de 100 pi de solution sur du parafilm ou une diapositive dans une chambre humide. Lamelles sont ensuite soigneusement retiré avec une pince (inondé de PBS 1x, si nécessaire). Notez que la dilution et la durée d'incubation peut être ajustée en fonction de la qualité de l'anticorps et de cellules-types.
4. Laver les cellules dans 0,2% de BSA / 0,1% Tween-20 / PBS 1x, trois fois 5 min à température ambiante sous agitation.
5. Incuber les cellules avec le cas échéant un fluorophore conjugué anticorps secondaire dilué dans une solution de blocage pendant une heure à température ambiante dans une chambre sombre et humide. Ici, nous montrons un exemple de détection d'unsecondaire de chèvre anti-anticorps de souris (Alexa Fluor 488 ou 555, Invitrogen; Voir le tableau 5 pour plus de détails). Haptène-anticorps secondaires conjugués (biotine, la digoxigénine, etc) peuvent également être utilisés. Dans ce cas, une étape supplémentaire pour la détection approprié (streptavidine, anti-dig, etc) peut être effectuée avant ou après pendant la nuit ADN-FISH hybridation.
6. Rincer les cellules dans 0,1% de Tween-20 / PBS 1x, trois fois 5 min à température ambiante sous agitation dans l'obscurité.
7. Post-fix cellules dans du paraformaldéhyde à 2% / PBS 1x pendant 10 min à température ambiante dans l'obscurité.
8. Continuer FISH ADN comme ci-dessus à partir d'incubation de la RNase A (étape 3.4).

5. 3-dimensions ADN FISH / Immuno-FISH - Deuxième jour (~ 2 h)

1. Retirez délicatement la colle de caoutchouc, des lamelles crues avec 2x SSC, retirer délicatement avec une pince et placez-les dans des puits contenant la solution de lavage.
2. Laver les cellules dans du SSC 2X pendant 30 min à 37 ° C dans l'obscurité sous agitation.
3. Laver les cellules dans du SSC 2X pendant 30 min à température ambiante dans l'obscurité sous agitation.
4. Laver les cellules en 1x SSC pendant 30 min à température ambiante dans l'obscurité sous agitation à noter que dans le cas de la dénaturation de formamide, lavages doit être remplacé par le texte suivant:. Lavage 3 en lavages formamide / 2x SSC et 3 50% en 2x SSC, 5 min chacun, à 37 ° C.
5. Monter les cellules dans ProLong moyen de montage d'or contenant 1,5 mg / ml DAPI (4,6-diamidino-2-phénylindole) pour la contre de l'ADN total. Lamelles sont placées côté cellule vers le bas sur une baisse de 10-15 ul de milieu de montage sur une lame et scellé avec du vernis à ongles. Les lames sont conservées pendant plusieurs mois à -20 ° C.

6. Microscopie 3D et d'analyse

1. Images en 3D peuvent être acquises avec des systèmes différents microscope. Dans nos expériences, des sections optiques séparées par 0,3 um sont recueillies sur un système Leica SP5 AOBS confocale (acousto-optique Beam Splitter). Notez que la séparation entre opticaavions l peut être réglée en fonction du type d'analyse.
2. Piles d'images 3D peuvent être analysées à l'aide du logiciel et des outils différents. Nous utilisons le logiciel Image J pour évaluer les mesures de distance entre les loci d'intérêt et d'analyser les différents types d'associations des loci d'intérêt avec des sous-compartiments nucléaires ou des protéines.
3. Toutes les analyses statistiques sont effectuées pour comparer les deux (ou plus) différentes conditions biologiques de paires évaluation (s) d'importance: comparaison entre les différents types de cellules ou de stades, la comparaison entre les différents loci d'intérêt. Dans tous les tests statistiques, les valeurs P ≤ 5,00 E-2 (a = 0,05) sont considérées comme significatives (1,00 E-2 ≤ P ≤ 5,00 E-2 * significatif; 1.00E-3 ≤ P ≤ 1,00 E-2 * * très significative, p <1,00 E-3 *** très important).

L'analyse statistique des distributions entières de distances entre deux allèles. Nous avons d'abord construct cumulatifs courbes de fréquence de distribution sur toute la plage de distances mesurées entre les deux alleles.To évaluer l'importance des différences entre les distributions empiriques des inter-distances alléliques nous utilisons le test non paramétrique de deux échantillons de Kolmogorov-Smirnov (KS) ^13,14 essai.

L'analyse statistique de près association (association par exemple) à l'aide de deux allèles à une distance optimale de coupure. Afin d'identifier la gamme de la plupart des différences dans les distances robustes entre deux allèles ou loci, nous utilisons une série de deux-tail test exact de Fisher ¹⁵ s. Plus précisément, à chaque distance mesurée nous tester si une condition est nettement surreprésentés à des distances plus courtes entre les deux échantillons. Le minimum de la distribution des valeurs de p indique la plage de distances qui doivent être considérées comme une coupure de près association (c.-à-appariement) des deux allèles. Par la suite le test de Fisher bilatéral exact est utilisé to évaluer l'importance de l'appariement de deux allèles identifiés à la valeur seuil ^15. Corrections de tests multiples sont appliqués pour tenir compte du nombre total de tests de Fisher effectué ^16.

L'analyse statistique de l'association du locus d'intérêt avec des sous-compartiments nucléaires ou des protéines. Le test bilatéral exact de Fisher-est utilisée pour analyser l'importance de l'association du locus d'intérêt avec différents compartiments ou des protéines ^15.

Résultats

ADN et immuno-FISH sont utilisés dans le laboratoire Skok pour étudier les changements dans l'organisation nucléaire associés au processus de V (D) J du locus récepteurs des antigènes au cours du développement des lymphocytes B et T. Les techniques décrites ci-dessus nous permettent de mesurer des distances i) entre les deux extrémités d'un locus (contraction) ii) mesurer les distances entre les allèles ou loci (appariement), iii) analyser l'endommagement de l'ADN survenant dans les lieux, iv)...

Discussion

Les techniques décrites ci-dessus ont été utilisées dans notre laboratoire pour analyser la réglementation de V (D) J de l'immunoglobuline et TCRA / j loci dans le développement des lymphocytes ^30,31. Nous sommes convaincus que cette technique peut être adaptée pour la détection de diverses protéines nucléaires, des compartiments nucléaires et les lieux, dans différents types cellulaires. Modifications du protocole peut être nécessaire, et dans ce cas les étapes majeures ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom de réactif / Matériel	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
H 2 O	Pêcheur	# BP2470
RNase A	Sigma	# R4642
dNTP	Sigma	# DNTP100
Alexa dUTP	Invitrogen	# C11397 à C-11401
Cy3 ou Cy5 dUTP	Pêcheur	# 45-001-xxx
DNase I	Roche	# 04536282001
ADN Pol I	Biolabs	# M0209
0.025 filtres pm	Millipore	# VSWP02500
ADN Cot-1 1 mg / ml	Invitrogen	# 18440
Hybloc ADN 1 mg / ml	Applied Genetics	# MHB
De sperme de saumon	Sigma	# D1626	poudre pour être remises en suspension à 10 mg / ml dans du H 2 O
NaAc (acétate de sodium, pH 5,2, solution tampon)	Sigma	# S7899
Ficoll 400 (Mol Biol grade)	Pêcheur	N ° 525
Polyvinylpyrrolidone (Mol Biol grade)	Pêcheur	# BP431
Poudre de sulfate de dextrane	Sigma	# D8906
PESS (Saline-phosphate de sodium-EDTA) solution 20x	Pêcheur	# BP1328
Formamide	Pêcheur	# BP227
Lamelles de	Pêcheur	N ° 12-548-B
Diapositives	Pêcheur	# 12-550
Plaques de 6 puits	Pêcheur	# 0720080
PBS, 10x	Pêcheur	# MT-46-013-CM
La poly-L-lysine solution	Sigma	# P8920
Paraformaldéhyde, granulés, 95%	Sigma	# 441244
Triton-X-100, Mol Biol qualité	Sigma	# T8787
Fraction BSA (Bovine Serum Albumin) V	Pêcheur	# BP 1600
Sérum normal de chèvre	Vector Labs	# S-1000
Tween-20, Mol Biol qualité	Sigma	# P9416
SSC (citrate de sodium salin) 20x solution	Pêcheur	# BP1325
ProLong réactif antifade Or	Invitrogen	# P36930
DAPI (4 ',6-diamidino-2-phénylindole)	Sigma	# D9542
Meilleur essai un ciment enveloppe en caoutchouc	Magasins de fournitures d'art ou de bureau
			Tableau 1. Réactifs spécifiques et du petit matériel.