Immunofluorescenza combinato e FISH DNA 3D conservato nuclei in interfase di studiare i cambiamenti in 3D Organizzazione nucleare

Riepilogo

Qui si descrive un protocollo per la rilevazione simultanea di modificazioni istoniche da sequenze di DNA di immunofluorescenza e FISH DNA seguita da microscopia e analisi 3D (3D immuno-DNA FISH).

Abstract

Ibridazione fluorescente in situ con l'utilizzo di sonde a DNA, il 3-dimensionale nuclei conservati seguito da 3D microscopia confocale (FISH DNA 3D) rappresenta il modo più diretto per visualizzare la posizione di loci genici, cromosomica sub-regioni o interi territori in celle singole. Questo tipo di analisi permette di comprendere meglio l'architettura globale del nucleo e il comportamento dei loci genomici e regioni nello spazio nucleare. Immunofluorescenza, invece, permette la rilevazione di proteine ​​nucleari (istoni modificati, varianti istoniche e modificatori, macchinari e fattori di trascrizione nucleari, sotto-compartimenti, ecc). La sfida in combinazione FISH DNA immunofluorescenza e 3D è, da un lato di preservare l'epitopo riconosciuto dagli anticorpi così come l'architettura 3D del nucleo, e dall'altro, per consentire la penetrazione della sonda di DNA per rilevare loci genici o territori cromosomici ^1-5. Qui forniamo un protocollo che combina la visualizzazione di modificazioni della cromatina con loci genomici in 3D nuclei conservato.

Introduzione

Epigenetica meccanismi di creazione di trigger e l'eredità di profili specifici di sviluppo e delle cellule di tipo trascrizionale. A un certo livello si tratta di modulazione degli imballaggi cromatina che definisce regioni genomiche attive o in silenzio. Su una scala più ampia, globale organizzazione 3D del genoma e architettura nucleare anche svolgere un ruolo nel controllo trascrizionale di modelli. Così, la dissezione di queste caratteristiche epigenomic è essenziale per una piena comprensione di come i geni sono regolati ^6-11.

Combinato FISH DNA immunofluorescenza e 3D offrono una possibilità unica per integrare le analisi molecolari e biochimici valutando specifiche interazioni / associazioni di sequenze di DNA e / o proteine ​​all'interno del nucleo. Inoltre, mentre il genoma tecniche ad alto rendimento, come immunoprecipitazione della cromatina (ChIP-seq) o la cattura conformazione cromosoma accoppiata con sequenziamento profondo (4C-seq, 5C, Hi-C) forniscono dat globaleuna su popolazioni cellulari ^12, immunofluorescenza / DNA tecniche FISH affinché le analisi a livello di singola cellula.

Qui si descrive un protocollo per la rilevazione simultanea di modificazioni istoniche da sequenze di DNA di immunofluorescenza e FISH DNA seguita da microscopia e analisi 3D (3D immuno-FISH). Il vantaggio di questo protocollo è la visualizzazione combinata di DNA e conservazione delle strutture proteiche. La nostra esperienza in questo campo ci ha consentito di migliorare e semplificare i protocolli esistenti. Anche se abbiamo usato questo protocollo per rilevare il DNA a doppio filamento rompe in linfociti sottoposti ricombinazione, questo metodo può essere applicato ad altre proteine ​​e altri tipi di cella.

Protocollo

1. DNA Etichettatura Sonda con Fluorofori: Nick Traduzione (~ 6 ore)

1. Pulito BAC DNA (preparato da maxi-prep) o plasmidi o prodotti PCR, tutti risospeso in H ₂ O, possono essere utilizzati per l'etichettatura. Noti che per un segnale FISH robusta, le sonde devono estendersi almeno 10 kb.
2. Incubare DNA in RNasi A per 30 min a 37 ° C (Tutti i reagenti sono elencati nella Tabella 1).
3. Incubare la reazione traduzione nick per 2 ore a 16 ° C (vedi tabelle 2 e 3). Metodi alternativi di etichettatura diretta può essere utilizzato (esempio: Tag FISH, Invitrogen).
4. Inattivare la reazione per un ora a -80 ° C o per una notte a -20 ° C.
5. Determinare le dimensioni della sonda su un gel di agarosio al 2%. Lo striscio dovrebbe essere compreso tra 100 e 1.000 bp, con la maggioranza di circa 300-500 bp (Si noti che la macchia di Cy5-sonde non è visibile). Se il DNA non è digerito abbastanza, più DNA Pol I eDNasi I può essere aggiunto alla reazione ed incubata per due ore più a 16 ° C.
6. Purificare sonde su filtri 0,025 mm in due bicchieri litro riempite con H ₂ 0 per due ore al buio.
7. Aggiungere fattori bloccanti alle sonde come segue: 10 mg di DNA Cot-1, 10 ug di DNA Hybloc e 100 pg di sperma di salmone per 10 pg di sonde di DNA. DNA sonde Conservare a -20 ° C.

2. Sonda Precipitazioni / Denaturazione / Pre-ricottura (ore 3-4)

1. Tra 0,3 mg e 1 mg di test sul DNA viene utilizzato per coprioggetto. Sonde mescolare con 0,1 volume di 3M NaAc (pH 5,2) e 2,5 volumi di etanolo al 100%, incubare per un ora a -80 ° C o per una notte a -20 ° C e centrifugare a 13.000 rpm a 4 ° C per 30 min. Si noti che la quantità di sonda di DNA può essere regolata a seconda della qualità del DNA nucleare e la regione di ibridazione. Metodi alternativi di etichettatura diretta può consentire l'utilizzo di ridotte quantità disonda. Per il rilevamento di segnali multipli FISH DNA su una diapositiva, diverse sonde può essere precipitato insieme (tranne le sonde che non dovrebbero essere pre-cotto, come sequenze ripetute). Sonde per diversi esperimenti eseguiti contemporaneamente può anche essere precipitato insieme. Pellet dovrebbe essere leggermente colorata secondo i fluorofori utilizzati (se piccole quantità di sonde vengono precipitati, il pellet può non essere visibile).
2. Pellet secco e risospendere in 15 microlitri tampone di ibridazione (cfr. tabella 4) per coprioggetto con agitazione (con un Thermomixer Eppendorf) al buio a 37-45 ° C (per circa 20 min).
3. Sonde Denaturare per 5 minuti a 75-95 ° C.
4. Pre-ricottura sonde a 37 ° C per 30-60 min. Lunghezza del pre-ricottura può essere regolata a seconda della complessità e qualità delle sonde.
5. Applicare i coprioggetti sonde per l'ibridazione durante la notte (cfr. sezione 3).

3. 3-Dimensionale FISH DNA - Primo Giorno (~ 3 ore)

1. Cellule non aderenti sono concentrate in un piccolo volume di PBS 1x (~ 2x10 ⁵ cellule in 5-10 microlitri 1x PBS per vetrino) e scaricati sul centro di un poli-L-lisina coprioggetto rivestiti. Cellule aderenti dovrebbero essere coltivate su vetrini per almeno 24 ore (confluenza ~ 70%) (vetrini possono essere rivestiti con gelatina 0,1%). Quadrati 18x18 a 24-24 coprioggetti mm sono poste in piastre da 6 pozzetti, e tutto il protocollo, due ml di ciascuna soluzione viene usato per pozzetto (in alternativa rotonde coprioggetto 1,5 millimetri può essere posto in piastre 12/24-well).
2. Fissare cellule in paraformaldeide al 2% / PBS 1x, pH 7-7,4, per 10 minuti a RT (4% PFA scorte possono essere aliquotati, conservati a -20 ° C). Paraformaldeide possono essere acquistati in soluzione (16%), o soluzioni di riserva del 4% può essere preparato da polvere / granuli. Paraformaldeide in polvere viene dissolto in PBS 1x a> 60 ° C (pH può essere portato a 8-9 per facilitare la dissoluzione), raffreddato in ghiaccio, regolareed a pH 7-7,4, filtrata, aliquotare falchi e conservati per settimane a -20 ° C.
3. Dopo tre lavaggi in PBS 1x, permeabilizzare le cellule in ghiaccio-freddo 0,4% Triton-X-100 / 1x PBS per 5 minuti in ghiaccio. Lunghezza di permeabilizzazione può essere regolata a seconda del tipo cellulare. NB: Se FISH DNA viene combinato con immunofluorescenza, l'immunocolorazione deve essere eseguita in questa fase (vedi sezione 4).
4. Dopo tre lavaggi in PBS 1x, incubare le cellule con 0,1 mg / microlitri RNasi A in PBS 1x per un ora a 37 ° C. Coprioggetti sono posti cellula-lato giù su un carico di 100 pl di soluzione su parafilm o un vetrino in una camera umida. Coprioggetto vengono poi accuratamente rimosso con una pinza. Se si incontra una resistenza, coprioggetto deve essere allagato con PBS 1x per evitare di danneggiare le cellule.
5. Dopo tre lavaggi in PBS 1x, permeabilizzare le cellule in ghiaccio-freddo 0,7% Triton-X-100 / HCl 0,1 M per 10 min in ghiaccio.
6. Dopo tre lavaggi in 1x PBS, le cellule denaturate in HCl 1,9 M per 30 minuti a RT. Alternativamente, le cellule possono essere denaturati in 50% di formammide / 2x SSC a 75-80 ° C per almeno 30 min. Notare che la lunghezza ibridazione (e temperatura) può essere ottimizzato a seconda del tipo cellulare.
7. Dopo tre lavaggi in ghiacciata 1x PBS, le cellule ibridare con sonde notte a 37 ° C in una camera oscura e umida. Coprioggetto sono posti cellulare rivolto verso il basso su un calo del 15 microlitri di sonda su un vetrino, e sigillato con mastice.

4. 3-dimensionale Immuno-FISH - Primo Giorno (~ 6-7 ore)

1. Per combinato immunofluorescenza / DNA FISH, immuno-colorazione deve essere eseguita dopo la permeabilizzazione nello 0,4% Triton-X-100 (punto 3.3).
2. Incubare le cellule in soluzione di blocco per 30 minuti a RT (2,5% di sieroalbumina bovina (BSA), 10% siero di capra normale, 0,1% Tween-20). La soluzione bloccante è filtrata, aliquotare Eppendorfs 1,5 ml e conservati per mesi a -20 ° C.
3. Incubare le cellule con l'anticorpo primario sollevata contro la proteina o la modificazione degli istoni di interesse diluito in soluzione di bloccaggio, per un ora a RT in una camera umida. Qui vi mostriamo l'esempio di un anticorpo contro fosforilati della serina-139 di H2AX (γ-H2AX, Millipore: vedi Tabella 5 per i dettagli). Coprioggetti sono posti cellula-lato giù su un carico di 100 pl di soluzione su parafilm o un vetrino in una camera umida. Coprioggetti sono poi accuratamente rimosso con una pinza (inondato con PBS 1x se necessario). Notare che la diluizione e la lunghezza di incubazione può essere regolata a seconda della qualità del anticorpo e cellule-tipi.
4. Lavare le cellule in 0,2% BSA / 0,1% Tween-20 / PBS 1x, tre volte 5 min a temperatura ambiente con agitazione.
5. Incubare le cellule con il fluoroforo appropriato anticorpo secondario coniugato diluito in soluzione di blocco per un ora a RT in una camera oscura e umida. Qui mostriamo un esempio di rilevamento con unsecondario di capra anti-topo (Alexa Fluor 488 o 555, Invitrogen, vedere la Tabella 5 per i dettagli). Anticorpi secondari coniugati aptene-(biotina, digossigenina, etc) potrebbe anche essere usato. In questo caso, un ulteriore passaggio per il rilevamento appropriato (streptavidina, anti-dig, ecc) può essere eseguita prima o dopo over-notte ibridazione DNA-FISH.
6. Risciacquare le cellule in 0,1% di Tween-20 / PBS 1x, tre volte 5 min a temperatura ambiente con agitazione al buio.
7. Post-fix cellule nel 2% paraformaldeide / 1x PBS per 10 min a temperatura ambiente al buio.
8. Continua FISH DNA come sopra da incubazione a RNasi A (passo 3.4).

5. 3-dimensionale DNA FISH / Immuno-FISH - Secondo giorno (circa 2 ore)

1. Rimuovere con cautela cemento di gomma, vetrini alluvione con 2x SSC, rimuovere con cautela con una pinza e metterli in pozzetti contenenti soluzione di lavaggio.
2. Lavare le cellule in 2x SSC per 30 min a 37 ° C al buio con agitazione.
3. Lavare le cellule in 2x SSC per 30 minuti a RT al buio con agitazione.
4. Lavare le cellule in 1x SSC per 30 minuti a RT al buio con agitazione noti che in caso di denaturazione con formammide, lavaggi deve essere sostituito dal seguente:. 3 lavaggi a 50% formammide lavaggi / 2x SSC e 3 in 2x SSC, 5 min ciascuna, a 37 ° C.
5. Montare cellule in mezzo prolungare oro montaggio contenente 1,5 mg / ml DAPI (4,6-Diamidino-2-fenilindolo) per controcolorazione di DNA totale. Coprioggetto sono posti cellulare rivolto verso il basso su un calo di 10-15 ml di mezzo di montaggio su un vetrino e sigillato con smalto. I vetrini sono conservati per mesi a -20 ° C.

6. Microscopia e analisi 3D

1. Le immagini 3D possono essere acquisite con sistemi microscopio diversi. Nei nostri esperimenti, sezioni ottiche separate di 0,3 micron vengono raccolti su un sistema Leica SP5 AOBS confocale (acusto-ottico Beam Splitter). Notare che la distanza tra ottical piani possono essere regolati a seconda del tipo di analisi.
2. Stack di immagini 3D possono essere analizzati utilizzando diversi software e strumenti. Usiamo il software J immagine per valutare le misure di distanza tra i loci di interesse e di analizzare i diversi tipi di associazione dei loci di interesse con sub-nucleare compartimenti o proteine.
3. Tutte le analisi statistiche sono effettuate per confrontare due (o più) diverse condizioni biologiche con coppie di valutazione (s) di importanza: confronto tra diversi tipi di cellule o fasi, il confronto tra i diversi loci di interesse. In tutti i test statistici, P-value ≤ 5.00E-2 (a = 0.05) sono presi per essere significativo (1,00 E-2 ≤ P ≤ 5.00E-2 * significativo; 1.00E-3 ≤ P ≤ 1,00 E-2 * * molto significativo, p <1,00 E-3 *** altamente significativo).

Analisi statistica delle distribuzioni intero distanze tra due alleli. Abbiamo prima construct cumulativi curve di frequenza di distribuzione su tutta la gamma di distanze misurate tra i due alleles.To valutare la significatività delle differenze tra le distribuzioni empiriche di inter-alleliche distanze che utilizziamo il non parametrico due campioni di Kolmogorov-Smirnov (KS) prova ^13,14.

L'analisi statistica di una stretta associazione (pairing cioè) di due alleli con una distanza ottimale di cut-off. Per identificare la gamma di robusti maggior parte delle differenze in termini di distanze tra due alleli o loci, si usa una serie di due code test esatto di Fisher ¹⁵ s. Vale a dire, ad ogni distanza misurata abbiamo verificare se una condizione è significativamente sovrarappresentati a brevi distanze tra i due campioni. Il minimo nella distribuzione dei valori p indica l'intervallo di distanze che devono essere considerati come un cut-off per la stretta associazione (pairing cioè) dei due alleli. Successivamente il due code test esatto di Fisher è usato to valutare l'importanza di accoppiamento di due alleli al identificato cut-off ^15. Correzioni test multipli vengono conteggiati per il numero totale di test eseguiti Fisher ^16.

Analisi statistica di associazione del locus di interesse con compartimenti sub-nucleari o proteine. La due code esatto di Fisher-test viene utilizzato per analizzare il significato di associazione del locus di interesse con diversi scomparti o proteine ^​​15.

Risultati

DNA e immuno-FISH vengono utilizzate in laboratorio Skok di studiare le variazioni dell'organizzazione nucleare associati al processo di V (D) J ricombinazione dei loci recettore per l'antigene durante lo sviluppo dei linfociti B e T. Le tecniche sopra descritte ci permettono di i) misurare le distanze tra le due estremità di un locus (contrazione), ii) misurare le distanze tra alleli o loci (pairing), iii) analizzare il danno al DNA che si verificano all'interno loci, iv) verificare la posizione degli alle...

Discussione

Le tecniche sopra descritte sono state usate nel nostro laboratorio per analizzare la regolazione di V (D) J ricombinazione delle immunoglobuline e TCRA / d loci nello sviluppo linfociti ^30,31. Siamo certi che questa tecnica può essere adattata per il rilevamento di varie proteine ​​nucleari, vani loci nucleari e, in diversi tipi di cellule-. Modifiche del protocollo può essere necessario, e in questo caso le fasi principali di concentrarsi su sono i seguenti. Primo, la lunghezza di pe...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente / materiale	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
H 2 O	Pescatore	# BP2470
RNasi A	Sigma	# R4642
dNTP	Sigma	# DNTP100
Alexa dUTP	Invitrogen	# C11397 a C-11401
Cy3 o Cy5 dUTP	Pescatore	# 45-001-xxx
DNasi I	Roche	# 04536282001
DNA Pol I	Biolabs	# M0209
0,025 micron filtri	Millipore	# VSWP02500
Cot-1 DNA 1 mg / ml	Invitrogen	# 18440
Hybloc DNA 1 mg / ml	Applied Genetics	# MHB
Salmone sperma	Sigma	# D1626	polvere da risospese a 10 mg / ml in H 2 O
NaAc (Acetato di sodio, pH 5.2, soluzione tampone)	Sigma	# S7899
Ficoll 400 (Mol Biol grado)	Pescatore	# 525
Polivinilpirrolidone (Mol Biol grado)	Pescatore	# BP431
Destrano solfato polvere	Sigma	# D8906
SSPE (Saline-Sodio Fosfato-EDTA) soluzione 20x	Pescatore	# BP1328
Formammide	Pescatore	# BP227
Coprioggetto	Pescatore	# 12-548-B
Diapositive	Pescatore	# 12-550
6-pozzetti	Pescatore	# 0720080
PBS, 10x	Pescatore	# MT-46-013-CM
Poli-L-lisina soluzione	Sigma	# P8920
Paraformaldeide, granuli, 95%	Sigma	# 441244
Triton-X-100, Mol Biol grade	Sigma	# T8787
BSA (albumina di siero bovino) Frazione V	Pescatore	# BP 1600
Siero di capra normale	Vector Labs	# S-1000
Tween-20, Mol Biol grade	Sigma	# P9416
SSC (citrato di sodio Saline) 20x soluzione	Pescatore	# BP1325
Prolungare reagente Oro antifade	Invitrogen	# P36930
DAPI (4 ',6-Diamidino-2-phenylindole)	Sigma	# D9542
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			Tabella 1. Reagenti specifici e piccole attrezzature.