Kombiniert Immunfluoreszenz und DNA FISH auf 3D erhaltene Interphase Nuclei, um Änderungen in 3D Nuclear Organization Study

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur gleichzeitigen Detektion von Histonmodifikationen durch Immunfluoreszenz und DNA-Sequenzen von DNA-FISH durch 3D-Mikroskopie und-Analysen (3D Immuno-DNA FISH) gefolgt.

Zusammenfassung

Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung mit DNA-Sonden auf 3-dimensional erhalten Kerne durch 3D-konfokale Mikroskopie verfolgt (3D DNA FISH) stellt die direkteste Weg, um die Lage der Gen-Loci, chromosomalen Subregionen oder ganze Gebiete in einzelnen Zellen zu visualisieren. Diese Art der Analyse gibt einen Einblick in die globale Architektur des Zellkerns als auch das Verhalten der spezifischen genomischen Loci und Regionen innerhalb der nuklearen Raum. Immunfluoreszenz, auf der anderen Seite erlaubt die Detektion von nuklearen Proteinen (modifizierte Histone, Histon-Varianten und Modifikatoren, Transkription Maschinen und Faktoren, Atom-U-Fächer, etc). Die große Herausforderung in der Kombination Immunfluoreszenz und 3D DNA FISH ist, einerseits um das Epitop von dem Antikörper sowie die 3D-Architektur des Kerns detektiert erhalten und andererseits, damit das Eindringen der DNA-Sonde zu detektieren Genloci oder Chromosom Gebieten ^1-5. Hier bieten wir ein Protokoll, das die Visualisierung von Chromatin Modifikationen mit genomischen Loci in 3D erhalten Kernen kombiniert.

Einleitung

Epigenetische Mechanismen auslösen Aufbau und Vererbung von Entwicklungs-und Zelltyp-spezifische Transkriptions-Profilen. Auf einer Ebene Dies beinhaltet Modulation der Chromatinstruktur Verpackungen, die aktive oder stille genomischen Regionen definiert. In einem größeren Maßstab, globale 3D Organisation des Genoms und Zellkernarchitektur spielen ebenfalls eine Rolle bei der Kontrolle der Transkriptions-Mustern. So ist Dissektion dieser epigenomischen wesentliche Merkmale für ein volles Verständnis, wie Gene ^6-11 geregelt.

Kombiniert Immunfluoreszenz-und 3D-DNA FISH bieten eine einzigartige Möglichkeit, molekulare und biochemische Analysen Beurteilung spezifischer Interaktionen / Verbände von DNA-Sequenzen und / oder Proteinen im Zellkern zu ergänzen. Hinzu kommt, dass genomweite Hochdurchsatztechniken wie Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP-seq) oder Chromosom capture Konformation mit deep sequencing gekoppelt (4C-seq, 5C, Hallo-C) liefern globale data auf Zellpopulationen ¹² ermöglichen Immunfluoreszenz / DNA FISH-Techniken Analysen der einzelnen Zelle Ebene.

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur gleichzeitigen Detektion von Histonmodifikationen durch Immunfluoreszenz und DNA-Sequenzen von DNA-FISH durch 3D-Mikroskopie und-Analysen (3D Immuno-FISH) gefolgt. Der Vorteil dieses Protokolls ist die kombinierte Visualisierung von DNA und Konservierung von Proteinstrukturen. Unsere Erfahrung in diesem Bereich hat es uns ermöglicht, zu verbessern und zu vereinfachen bestehende Protokolle. Obwohl wir dieses Protokoll verwendet wurden, um DNA-Doppelstrang-Pausen in Lymphozyten unterziehen Rekombination detektieren kann dieses Verfahren an andere Proteine ​​und andere Zelltypen verwendet werden.

Protokoll

Ein. DNA Probe Labeling mit Fluorophoren: Nick Translation (~ 6 h)

1. Saubere BAC DNA (hergestellt von Maxi-Prep) oder Plasmiden oder PCR-Produkte, die alle in H ₂ O resuspendiert, kann für die Etikettierung verwendet werden. Beachten Sie, dass für eine robuste FISH Signal, Sonden sollten mindestens 10 kb überspannen.
2. Inkubieren DNA in RNase A während 30 min bei 37 ° C (alle Reagenzien sind in Tabelle 1 aufgeführt).
3. Inkubieren Sie die Nick-Translation Reaktion für 2 h bei 16 ° C (siehe Tabellen 2 und 3). Alternative Methoden der direkten Kennzeichnung verwendet werden (Beispiel: FISH Tag, Invitrogen) werden.
4. Inaktivieren die Reaktion für eine Stunde bei -80 ° C oder über Nacht bei -20 ° C.
5. Bestimmen Sondengröße auf einem 2% Agarosegel. Der Abstrich sollte zwischen 100 und 1.000 bp, wobei die Mehrheit bei ca. 300-500 bp (Beachten Sie, dass der Abstrich von Cy5-Sonden nicht sichtbar ist). Wenn die DNA nicht verdaut ist genug, mehr DNA Pol I undDNase I kann in die Reaktion hinzugefügt und inkubiert für zwei weitere Stunden bei 16 ° C.
6. Läutern Sonden auf 0,025 mm Filter in zwei Liter-Becher gefüllt mit H ₂ 0 für zwei Stunden im Dunkeln.
7. Fügen Sie blockierende Faktoren zu den Sonden wie folgt: 10 ug Cot-1 DNA, 10 ug Hybloc DNA und 100 ug Lachssperma für 10 pg DNA-Sonden. Shop DNA-Sonden bei -20 ° C.

2. Probe Niederschlag / Denaturierung / Pre-Annealing (3-4 Std.)

1. Zwischen 0,3 ug und 1 pg DNA-Sonde wird pro Deckglas verwendet. Mischung Sonden mit 0,1 Vol. 3 M NaAc (pH 5,2) und 2,5 Volumen 100% Ethanol für eine Stunde bei -80 ° C inkubieren oder über Nacht bei -20 ° C und Spin-down bei 13.000 rpm bei 4 ° C für 30 min. Man beachte, dass die Menge an DNA-Sonde eingestellt werden kann, je nach Qualität der DNA und der Kernbereich der Hybridisierung werden. Alternative Methoden der direkten Kennzeichnung kann die Verwendung der reduzierten MengenSonde. Zur Detektion von mehreren DNA FISH-Signale auf einer Folie können die unterschiedlichen Sonden zusammen ausgefällt werden (außer Sonden, die nicht vorher geglüht, sollte ähnlichen Repeat-Sequenzen). Sonden für mehrere Experimente zur gleichen Zeit ausgeführt werden können auch zusammen ausgefällt werden. Pellets sollten leicht nach den Fluorophoren verwendet werden (wenn kleine Mengen von Sonden ausgefällt werden, das Pellet möglicherweise nicht sichtbar) eingefärbt werden.
2. Trockene Pellets und resuspendieren Sie in 15 ul Hybridisierungspuffer (siehe Tabelle 4) pro Deckglas unter Schütteln (mit einem Eppendorf Thermomixer) im Dunkeln bei 37-45 ° C (ca. 20 min).
3. Denaturieren Sonden für 5 min bei 75-95 ° C.
4. Pre-annealen Sonden bei 37 ° C für 30-60 min. Länge Vorglühen kann in Abhängigkeit von der Komplexität und Qualität der Sonden werden.
5. Bewerben Sonden an die Deckgläser über Nacht Hybridisierung (siehe Abschnitt 3).

3. 3-Dimensionalen DNA FISH - First Day (~ 3 Stunden)

1. Nicht-adhärente Zellen werden in einem kleinen Volumen von 1x PBS (~ 2x10 ⁵ Zellen in 5-10 ul PBS 1x pro Deckglas) eingeengt und ließ sich auf der Mitte eines Poly-L-Lysin beschichteten Deckgläschen. Adhärenten Zellen auf Deckgläsern sollte mindestens 24 Stunden (~ 70% Konfluenz) (Deckgläser kann mit 0,1% Gelatine beschichtet sein) kultiviert werden. Quadratischen 18x18 um 24-24 mm-Deckgläschen werden in 6-well Platten gegeben und während des Protokolls, zwei ml jeder Lösung wird pro Vertiefung verwendet (alternativ runde Deckgläser 1,5 mm können in 12/24-well Platten platziert werden).
2. Fix Zellen in 2% Paraformaldehyd / 1x PBS, pH 7-7,4, 10 min bei RT (4% PFA Bestände aliquotiert, gelagert bei -20 ° C). Paraformaldehyd in Lösung erworben werden (16%) bzw. 4% Stammlösungen aus Pulver / Granulat zubereitet werden. Paraformaldehyd Pulver wird in 1x PBS bei> 60 ° C (pH kann auf 8-9 erhöht werden, um die Auflösung zu erleichtern), abgekühlten auf Eis, passen gelösted zu pH 7-7,4, filtriert, in falcons aliquotiert und über Wochen bei -20 ° C.
3. Nach drei Spülungen in 1x PBS, permeabilisieren Zellen in vereisten kalte 0,4% Triton-X-100 / 1x PBS für 5 min auf Eis. Länge der Permeabilisierung kann angepasst je nach Zelltyp werden. Hinweis: Wenn DNA FISH mit Immunfluoreszenz kombiniert wird, die Immunfärbung sollten in dieser Phase durchgeführt werden (siehe Abschnitt 4).
4. Nach drei Spülungen in 1x PBS, inkubieren Zellen mit 0,1 ug / ul RNase A in 1x PBS für eine Stunde bei 37 ° C. Deckgläser werden Zell-Seite nach unten auf einen Rückgang von 100 ul Lösung auf Parafilm oder einer Folie in einer feuchten Kammer. Deckgläser werden dann vorsichtig mit einer Pinzette entfernt. Wenn ein Widerstand auftritt, sollte Deckgläser mit 1x PBS geflutet werden, um eine Beschädigung der Zellen.
5. Nach drei Spülungen in 1x PBS, permeabilisieren Zellen in vereisten kalte 0,7% Triton-X-100 / 0,1 M HCl für 10 min auf Eis.
6. Nach drei Spülungen in 1x PBS, denaturieren Zellen in 1,9 M HCl für 30 min bei RT. Alternativ können Zellen, die in 50% Formamid / 2 × SSC bei 75-80 ° C für mindestens 30 min denaturiert. Beachte, dass Hybridisierung Länge (und Temperatur) können optimiert, je nach Zelltyp werden.
7. Nach drei Spülungen in eiskaltem 1x PBS, hybridisieren Zellen mit Sonden über Nacht bei 37 ° C in einem dunklen und feuchten Kammer. Deckgläser werden Zell-Seite nach unten auf ein Minus von 15 ul der Sonde auf einem Schlitten, und versiegelt mit Gummi-Zement.

4. 3-dimensional Immuno-FISH - First Day (~ 6-7 Std.)

1. Für kombinierte Immunfluoreszenz / DNA FISH sollte Immunfärbung nach Permeabilisierung in 0,4% Triton-X-100 (Schritt 3.3) durchgeführt werden.
2. Inkubieren Zellen in Blocking-Lösung für 30 min bei RT (2,5% Rinderserumalbumin (BSA), 10% normales Ziegenserum, 0,1% Tween-20). Die Blockierungslösung wird filtriert, in 1,5 ml aliquotiert Eppendorfs und gespeichert monate bei -20 ° C.
3. Inkubieren von Zellen mit dem primären Antikörper gegen das Protein oder das Histonmodifikation von Interesse in Blockierungslösung verdünnt angehoben, für eine Stunde bei RT in einer feuchten Kammer inkubiert. Hier zeigen wir am Beispiel eines Antikörpers gegen phosphoryliertes Serin-139 der H2AX (γ-H2AX, Millipore; siehe Tabelle 5 für Details). Deckgläser werden Zell-Seite nach unten auf einen Rückgang von 100 ul Lösung auf Parafilm oder einer Folie in einer feuchten Kammer. Deckgläser Dann gibt man vorsichtig mit einer Pinzette (geflutet mit 1x PBS falls erforderlich) entfernt. Hinweis, dass eine Verdünnung und Inkubation Länge eingestellt werden kann, je nach Qualität des Antikörpers und Zell-Typen verwendet werden.
4. Waschen der Zellen in 0,2% BSA / 0,1% Tween-20 / 1x PBS, dreimal 5 min bei RT mit Schütteln.
5. Inkubieren von Zellen mit dem entsprechenden Fluorophor-konjugierten sekundären Antikörper in Blocking-Lösung für eine Stunde bei RT in einer dunklen und feuchten Kammer verdünnt. Hier zeigen wir ein Beispiel für einen Nachweis mitsekundären Ziege-Anti-Maus-Antikörper (Alexa Fluor 488 oder 555, Invitrogen; siehe Tabelle 5 für Details). Hapten-konjugierten Sekundärantikörper (Biotin, Digoxigenin, etc) könnten ebenfalls verwendet werden. In diesem Fall kann ein zusätzlicher Schritt für geeignete Nachweismethoden (Streptavidin, anti-dig, etc) entweder vor oder nach der Über-Nacht-DNA-FISH-Hybridisierung durchgeführt werden.
6. Spülen Zellen in 0,1% Tween-20 / 1x PBS, dreimal 5 min bei RT mit Schütteln im Dunkeln.
7. Post-Update-Zellen in 2% Paraformaldehyd / 1x PBS für 10 min bei RT im Dunkeln.
8. Weiter DNA FISH wie oben beschrieben aus der Inkubation in RNase A (Schritt 3,4).

5. 3-dimensional DNA FISH / Immuno-FISH - Zweiter Tag (~ 2 h)

1. Entfernen Sie vorsichtig Gummilösung, Überschwemmung Deckgläser mit 2x SSC, vorsichtig mit einer Pinzette zu entfernen und sie in Vertiefungen mit Waschlösung.
2. Waschen der Zellen in 2 × SSC für 30 Minuten bei 37 ° C im Dunkeln unter Schütteln.
3. Waschen der Zellen in 2 × SSC für 30 Minuten bei RT im Dunkeln unter Schütteln.
4. Waschen der Zellen in 1x SSC 30 min lang bei RT im Dunkeln unter Schütteln beachte, dass im Falle der Denaturierung mit Formamid, Waschungen durch die folgende ersetzt werden:. 3 Waschschritten in 50% Formamid / 2 × SSC und 3 Waschungen in 2 × SSC, 5 min jeweils bei 37 ° C.
5. Montieren Zellen in ProLong Gold Montagetyp Medium mit 1,5 g / ml DAPI (4,6-Diamino-2-phenylindole) für Gegenfärbung der Gesamt-DNA. Deckgläser werden Zell-Seite nach unten auf einen Rückgang von 10-15 ul Eindeckmedium auf einer Folie und versiegelt mit Nagellack. Slides sind für Monate bei -20 ° C gehalten

6. 3D-Mikroskopie und Analyse

1. 3D-Bilder können mit verschiedenen Mikroskop-Systeme erworben werden. In unseren Experimenten werden optische Schnitte von 0,3 um getrennt auf einem Leica SP5 AOBS konfokalen System (Akusto-Optical Beam Splitter) gesammelt. Beachten Sie, dass die Trennung zwischen optical Ebenen kann in Abhängigkeit von der Art der Analyse ist.
2. 3D-Bild Stapel analysiert mit unterschiedlichen Software und Tools werden. Wir verwenden das Image J Software Abstandsmessungen zwischen Loci von Interesse zu beurteilen und verschiedene Arten der Assoziation der Loci von Interesse mit sub-atomaren Fächer oder Proteine ​​zu analysieren.
3. Alle statistischen Analysen durchgeführt, um zwei Vergleichen (oder mehr) unterschiedlichen biologischen Bedingungen mit paarweise Beurteilung (en) von Bedeutung: Vergleich zwischen verschiedenen Zelltypen oder Stufen, Vergleich zwischen verschiedenen Loci von Interesse. In allen statistischen Tests, P-Werte ≤ 5,00 E-2 (a = 0,05) werden als signifikant (1,00 E-2 ≤ P ≤ 5,00 E-2 * signifikant; 1.00E-3 ≤ P ≤ 1,00 E-2 * * sehr bedeutsam; P <1,00 E-3 *** hoch signifikant).

Die statistische Analyse der gesamten Verteilungen der Abstände zwischen zwei Allelen. Zunächst construct Verteilungsfunktion Frequenz-Kurven über den gesamten Bereich der gemessenen Abstände zwischen den beiden alleles.To Beurteilung der Signifikanz der Unterschiede in der Verteilung der empirischen inter-Allel Distanzen nutzen wir die nichtparametrische zwei Stichproben Kolmogorov-Smirnov (KS-Test) ^13,14.

Statistische Analyse der engen Verbindung (dh Paarung) zweier Allele mit einem optimalen Abstand abgeschnitten. Um den Bereich der robustesten Unterschieden in der Entfernung zwischen zwei Allele oder Loci zu identifizieren, verwenden wir eine Reihe von zweiseitigen Fisher Exact Test ¹⁵ s. Nämlich an jedem gemessenen Abstand testen wir, ob eine Bedingung signifikant ist bei kürzeren Entfernungen zwischen den zwei Proben überrepräsentiert. Die minimale in der Verteilung der P-Werte gibt den Bereich von Abständen, der als Grenzwert für enge Verbindung (dh Paarung) der beiden Allele berücksichtigt werden sollten. Anschließend wird die zweiseitigen Fisher Exact Test wird t verwendeto Beurteilung der Bedeutung der Paarung zweier Allele bei der identifizierten cut-off-Wert ^15. Mehrere Tests Korrekturen zur Berücksichtigung der Gesamtzahl der Fisher-Tests angewendet durchgeführt ^16.

Statistische Analyse der Assoziation der Ort des Interesses mit sub-atomaren Fächer oder Proteine. Die zweiseitigen Fisher-Exact-Test wird verwendet, um die Bedeutung der Vereinigung der Locus von Interesse mit verschiedenen Fächern oder Proteine ^​​15 zu analysieren.

Ergebnisse

DNA und Immuno-FISH sind im Laborbetrieb Skok um die Änderungen in Atom-Organisation mit dem Verfahren der V (D) J-Rekombination von Antigenrezeptors Loci während der B-und T-Lymphozyten-Entwicklung verbunden studieren. Die Techniken zuvor dargelegten uns ermöglichen, i) Messung Abstände zwischen den beiden Enden eines Locus (Kontraktion) ii) messen Abstände zwischen Allelen oder Loci (Paarung), iii) eine Analyse der DNA-Schädigung, die innerhalb Loci, iv) Bewertung der Standort der Allele und loci Bezug auf Atom-...

Diskussion

Die Techniken detailliert wurden oben in unserem Labor verwendet werden, um die Regulation der V (D) J-Rekombination der Immunglobulin und TCRA / d loci in Entwicklungsländern Lymphozyten ^30,31 analysieren. Wir sind sicher, dass diese Technik für die Detektion verschiedener Kernproteinen, nukleare Abteile und Loci, in verschiedenen Zelltypen angepasst werden kann. Modifikationen des Protokolls notwendig sein kann, und in diesem Fall die Hauptschritte zu konzentrieren sind die folgenden. Er...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenz / Material	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare
H 2 O	Fischer	# BP2470
RNase A	Sigma	# R4642
dNTP	Sigma	# DNTP100
Alexa dUTP	Invitrogen	# C11397-C-11401
Cy3 oder Cy5 dUTP	Fischer	# 45-001-xxx
DNase I	Roche	# 04536282001
DNA Pol I	Biolabs	# M0209
0,025 um Filter	Millipore	# VSWP02500
Cot-1-DNA 1 mg / ml	Invitrogen	# 18440
Hybloc DNA 1 mg / ml	Angewandte Genetik	# MHB
Lachssperma	Sigma	# D1626	Pulver bei 10 mg / ml in H 2 O resuspendiert werden
NaAc (Natriumacetat, pH 5,2, Puffer-Lösung)	Sigma	# S7899
Ficoll 400 (Mol Biol grade)	Fischer	# 525
Polyvinylpyrrolidon (Mol Biol grade)	Fischer	# BP431
Dextransulfat Pulver	Sigma	# D8906
SSPE (Saline-Sodium Phosphate-EDTA) 20x-Lösung	Fischer	# BP1328
Formamid	Fischer	# BP227
Deckgläser	Fischer	# 12-548-B
Slides	Fischer	# 12-550
6-Well-Platten	Fischer	# 0720080
PBS, 10x	Fischer	# MT-46-013-CM
Poly-L-Lysin-Lösung	Sigma	# P8920
Paraformaldehyd, Prills, 95%	Sigma	# 441244
Triton-X-100, Mol Biol Grade	Sigma	# T8787
BSA (Bovine Serum Albumin) Fraktion V	Fischer	# BP 1600
Normalem Ziegenserum	Vector Labs	# S-1000
Tween-20, Mol Biol Grade	Sigma	# P9416
SSC (Saline Sodium Citrate) 20x-Lösung	Fischer	# BP1325
ProLong Gold-antifade Reagenz	Invitrogen	# P36930
DAPI (4 ',6-Diamidino-2-Phenylindol)	Sigma	# D9542
Bester Test eine Schicht Gummi-Zement	Kunst oder Büromärkten
			Tabelle 1. Spezifische Reagenzien und Kleingeräten.