Imunofluorescência combinados e FISH DNA em 3D preservado núcleos interfásicos para estudar mudanças na organização nuclear 3D

Resumo

Aqui nós descrevemos um protocolo para a detecção simultânea de modificações de histonas por imunofluorescência e seqüências de DNA por FISH DNA seguido por microscopia 3D e análises (3D FISH imuno-DNA).

Resumo

Hibridização fluorescente in situ utilizando sondas de DNA em 3-dimensionalmente núcleos preservados seguido por microscopia confocal 3D (3D FISH DNA) representa a forma mais direta de visualizar a localização de locos gênicos, cromossômica sub-regiões ou territórios inteiros em células individuais. Este tipo de análise fornece insights sobre a arquitetura global do núcleo, bem como o comportamento de loci genômicos e regiões específicas dentro do espaço nuclear. Imunofluorescência, por outro lado, permite a detecção de proteínas nucleares (histonas modificados, variantes de histonas e modificadores, maquinaria de transcrição e factores nucleares, sub-compartimentos, etc.) O principal desafio na combinação FISH DNA imunofluorescência e 3D é, por um lado, para preservar o epitopo detectada pelo anticorpo, bem como a arquitectura 3D do núcleo, e, por outro lado, para permitir a penetração da sonda de ADN para detectar locos gênicos ou territórios cromossômicos ^1-5. Aqui nós fornecemos um protocolo que combina visualização de modificações da cromatina com loci genômicos em núcleos preservados 3D.

Introdução

Estabelecimento de mecanismos epigenéticos gatilho e herança de desenvolvimento e de células do tipo perfis específicos de transcrição. Em um nível, este envolve a modulação da embalagem da cromatina, que define as regiões genômicas ativas ou em silêncio. Numa escala maior, a organização 3D global do genoma e arquitectura nuclear também desempenhar um papel no controlo da transcrição de padrões. Assim, o esvaziamento desses recursos epigenômico é essencial para um entendimento completo de como os genes são regulados ^6-11.

FISH DNA combinado imunofluorescência e 3D fornecem uma oportunidade única para complementar análises moleculares e bioquímicos, avaliando interacções específicas / associações de sequências de ADN e / ou proteínas dentro do núcleo. Além disso, enquanto do genoma técnicas de alto rendimento, como cromatina imunoprecipitação (CHIP-seq) ou conformação cromossomo captura juntamente com o seqüenciamento de profundidade (4C-seq, 5C, Hi-C) fornecer dat mundialuma população de células em ^12, técnicas de imunofluorescência / ADN FISH permitir análises ao nível da célula individual.

Aqui nós descrevemos um protocolo para a detecção simultânea de modificações de histonas por seqüências de DNA por imunofluorescência e FISH DNA seguido por microscopia 3D e análises (3D imuno-FISH). A vantagem deste protocolo é a visualização conjunta de DNA e preservação de estruturas de proteínas. A nossa experiência neste campo nos permitiu melhorar e simplificar os protocolos existentes. Apesar de termos utilizados neste protocolo para a detecção de ADN de cadeia dupla em intervalos linfócitos submetidos a recombinação, este método pode ser aplicado a outras proteínas e de outros tipos de células.

Protocolo

1. DNA Labeling Sonda com fluoróforos: Nick Tradução (~ 6 horas)

1. Limpeza BAC DNA (preparado por maxi-prep) ou plasmídeos ou produtos de PCR, todos ressuspenso em H ₂ O, podem ser utilizados para a rotulagem. Note-se que para um sinal de FISH robusto, as sondas devem abranger pelo menos 10 kb.
2. Incubar DNA em RNase A durante 30 min a 37 ° C (todos os reagentes estão listados na Tabela 1).
3. Incubar a reacção de tradução de nick durante 2 horas a 16 ° C (ver Tabelas 2 e 3). Os métodos alternativos de marcação directa pode ser utilizado (exemplo: Tag FISH, Invitrogen).
4. Inactivar a reacção durante uma hora à temperatura de -80 ° C ou durante a noite a -20 ° C.
5. Determinar o tamanho da sonda sobre um gel de agarose a 2%. O esfregaço deve estar entre 100 e 1000 pb, com a maioria a cerca de 300-500 pb (Note-se que a mancha de Cy5 sondas não é visível). Se o DNA não é digerida suficiente, mais DNA Pol I eDNase I pode ser adicionado à mistura reaccional e incubou-se durante mais duas horas a 16 ° C.
6. Purifica-se as sondas de 0,025 milímetros filtros em duas provetas de litros cheio com H ₂ 0 por duas horas no escuro.
7. Adicionar factores de bloqueio para as sondas como se segue: 10 ug de ADN Cot-1, 10 ug de DNA Hybloc e 100 ug de esperma de salmão de 10 ^ g de sondas de DNA. Loja de sondas de ADN a -20 ° C.

2. Probe Precipitation / desnaturação / pré-hibridação (3-4 horas)

1. Entre 0,3 ug e 1 ug de DNA de sonda é usada por lamela. Sondas de mistura com 0,1 volumes de NaAc 3M (pH 5,2) e 2,5 volumes de etanol a 100%, a incubação durante uma hora a -80 ° C ou durante a noite a -20 ° C e centrifugação a 13.000 rpm para baixo a 4 ° C durante 30 min. Note-se que a quantidade de sonda de DNA pode ser ajustada em função da qualidade do DNA e da região nuclear de hibridação. Os métodos alternativos de marcação directa podem permitir a utilização de quantidades reduzidas desonda. Para a detecção de sinais de DNA várias peixe em um slide, as diferentes sondas pode ser precipitada juntos (exceto sondas que não deve ser pré-recozido, como seqüências de repetição). Sondas para várias experiências realizadas ao mesmo tempo, podem também ser precipitados juntos. Pellets deve ser levemente coloridos de acordo com os fluoróforos usados ​​(se pequenas quantidades de sondas são precipitados, o sedimento pode não ser visível).
2. Pelotas secas e ressuspender-los em 15 ul de tampão de hibridação (ver Tabela 4) por cada lamela com agitação (usando um Thermomixer de Eppendorf) no escuro a 37-45 ° C (durante cerca de 20 min).
3. Sondas desnaturar durante 5 min a 75-95 ° C.
4. Pré-recozer sondas, a 37 ° C durante 30-60 min. Comprimento de pré-hibridação pode ser ajustada em função da complexidade e da qualidade das sondas.
5. Aplicar sondas para as lamelas para cruzamentos durante a noite (ver Seção 3).

3. 3PEIXES-dimensional DNA - Primeiro Dia (~ 3 horas)

1. As células não aderentes são concentrados num pequeno volume de 1x PBS (~ 2x10 ⁵ células em 5-10 ul de PBS 1x por lamela) e deixado cair no centro de uma lamela de poli-L-lisina revestido. As células aderentes deverá ser cultivadas em lamelas durante pelo menos 24 h (~ 70% de confluência) (lamelas podem ser revestidos com gelatina a 0,1%). Quadrados 18x18 para lamelas 24-24 mm são colocados em placas de 6 poços, e ao longo do protocolo, dois ml de cada solução é usada por poço (alternativamente redondo 1,5 mm, podem ser lamelas colocadas em placas de 12/24-well).
2. Fixar as células em paraformaldeído a 2% / PBS 1x, pH 7-7,4, durante 10 min à TA (stocks PFA a 4% pode ser dividido em alíquotas, armazenado a -20 ° C). Paraformaldeído podem ser comprados em solução (16%), ou as soluções de reserva de 4% pode ser preparada a partir de pó / grânulos. Paraformaldeído em pó é dissolvido em 1x PBS a> 60 ° C (pH pode ser aumentado para 8-9 para facilitar a dissolução), arrefecido para baixo sobre o gelo, ajustared a pH 7-7,4, filtrada, aliquotadas e armazenadas em falcões durante semanas à temperatura de -20 ° C.
3. Após três lavagens em PBS 1x, permeabilizar as células em gelado fria de 0,4% de Triton-X-100/1 x PBS durante 5 min em gelo. Comprimento de permeabilização pode ser ajustado dependendo do tipo de célula-NB:. PEIXES Se o DNA é combinado com imunofluorescência, a imunomarcação devem ser realizados nesta fase (ver secção 4).
4. Após três lavagens em PBS 1x, as células a incubar com 0,1 ug / ul de ARNase A em 1x PBS, durante uma hora a 37 ° C. As lamelas são colocadas lado a célula para baixo sobre uma gota de 100 ul de solução em parafilme ou uma lâmina em câmara húmida. As lamelas são em seguida cuidadosamente removida com uma pinça. Se alguma resistência é encontrada, lamelas devem ser inundado com 1x PBS, a fim de evitar danificar as células.
5. Após três lavagens em PBS 1x, permeabilizar as células em gelado fria de 0,7% de Triton-X-100 / HCl 0,1 M durante 10 minutos em gelo.
6. Após três lavagens in 1x PBS, as células desnaturam em HCl 1,9 M durante 30 min à temperatura ambiente. Alternativamente, as células podem ser desnaturadas em formamida 50% / 2x SSC a 75-80 ° C durante pelo menos 30 min. Note-se que a hibridação comprimento (e da temperatura), pode ser optimizada, dependendo do tipo de célula.
7. Após três lavagens em gelo frio 1x PBS, hibridar com sondas de células durante a noite a 37 ° C numa câmara escura e húmida. Lamelas são colocados lado a célula para baixo em uma queda de 15 ul de sonda em um slide, e selado com cimento de borracha.

4. 3-dimensional Imuno-FISH - Primeiro dia (~ 6-7 horas)

1. Por combinados FISH imunofluorescência / DNA, imuno-coloração deve ser realizada após a permeabilização em 0,4% de Triton-X-100 (Passo 3.3).
2. Incubar as células em solução de bloqueio durante 30 minutos a RT (2,5% de albumina sérica bovina (BSA), soro de cabra normal a 10%, 0,1% de Tween-20). A solução de bloqueio é filtrado, aliquotadas em 1,5 ml eppendorfs e armazenado para meses a -20 ° C.
3. Incubar as células com o anticorpo primário produzido contra a proteína ou a modificação das histonas de interesse diluído em solução de bloqueio, por uma hora, à temperatura ambiente numa câmara húmida. Aqui, mostramos o exemplo de um anticorpo contra a serina-139 fosforilada da H2AX (γ-H2AX, Millipore; Consulte a Tabela 5 para detalhes). As lamelas são colocadas lado a célula para baixo sobre uma gota de 100 ul de solução em parafilme ou uma lâmina em câmara húmida. As lamelas são em seguida cuidadosamente removida com uma pinça (inundado com 1x PBS, se necessário). Note-se que a diluição e tempo de incubação pode ser ajustada em função da qualidade do anticorpo e tipos de células.
4. Lave as células em 0,2% BSA / 0,1% de Tween-20/1 x PBS, três vezes 5 min à temperatura ambiente com agitação.
5. Incubar as células com o anticorpo conjugado com fluoróforo adequado secundário diluído em solução de bloqueio durante uma hora, à temperatura ambiente numa câmara escura e húmida. Aqui vamos mostrar um exemplo de detecção com umasecundário anticorpo de cabra anti-rato (Alexa Fluor 488 ou 555, Invitrogen; Consulte a Tabela 5 para detalhes). Hapteno-anticorpos secundários conjugados (biotina, digoxigenina, etc) podem também ser usados. Neste caso, um passo adicional para a detecção apropriada (estreptavidina, anti-dig, etc) pode ser realizada antes ou depois durante a noite a hibridação de DNA-FISH.
6. Enxaguar as células em 0,1% de Tween-20/1 x PBS, três vezes 5 min à temperatura ambiente com agitação no escuro.
7. Pós-fix células em paraformaldeído a 2% / PBS 1x durante 10 min à RT, no escuro.
8. Continuar FISH DNA como acima de incubação em RNase A (Passo 3.4).

5. 3-dimensional DNA FISH / Imuno-FISH - Segundo dia (~ 2 horas)

1. Remova cuidadosamente cimento de borracha, lamínulas de inundação com 2x SSC, remova cuidadosamente com uma pinça e colocá-los em poços contendo solução de lavagem.
2. Lave as células em 2x SSC durante 30 min a 37 ° C no escuro, com agitação.
3. Lave as células em 2x SSC durante 30 min à RT, no escuro, com agitação.
4. Lave as células em 1x SSC durante 30 min à RT, no escuro, com agitação Note-se que em caso de desnaturação com formamida, lavagens deve ser substituído pelo seguinte:. Lavagens três lavagens em 50% de formamida / SSC 2x e 3 em 2x SSC, 5 min cada, a 37 ° C.
5. Montar as células em meio de prolongar a ouro de montagem contendo 1,5 ug / ml de DAPI (4,6-diamidino-2-fenilindol) para contracoloração de DNA total. Lamelas são colocados lado a célula para baixo em uma queda de 10-15 ul de meio de montagem de um slide e selado com unha polonês. As lâminas são mantidos durante meses a -20 ° C.

6. Microscopia 3D e Análise

1. Imagens em 3D podem ser adquiridos com diversos sistemas de microscópio. Nas nossas experiências, secções ópticas separadas por 0,3 pm são recolhidas num AOBS SP5 Leica sistema confocal (acústico-óptico divisor de feixe). Note-se que a separação entre optical aviões pode ser ajustada dependendo do tipo de análise.
2. Pilhas de imagens em 3D podem ser analisados ​​utilizando um software diferente e ferramentas. Usamos o software Image J para avaliar medidas de distância entre loci de interesse e analisar diferentes tipos de associação dos locos de interesse com sub-compartimentos nucleares ou proteínas.
3. Todas as análises estatísticas foram realizadas para comparar dois (ou mais) diferentes condições biológicas com pairwise avaliação (s) de significância: comparação entre diferentes tipos de células ou estágios, a comparação entre os diferentes loci de interesse. Em todos os testes estatísticos, valores de P ≤ 5.00E-2 (a = 0,05) estão a ser tomadas significativa (1.00E-2 ≤ P ≤ 5.00E-2 * significativo; 1.00E-3 ≤ P ≤ 1.00E-2 * * muito significativa, P <1.00E-3 *** altamente significativo).

A análise estatística das distribuições inteiras de distâncias entre dois alelos. Nós c primeiroonstruct curvas de freqüência acumulada em toda a faixa de distâncias entre dois alleles.To avaliar a significância das diferenças nas distribuições de empíricos inter-alélicas distâncias usamos o teste não paramétrico de duas amostras de Kolmogorov-Smirnov (KS) ^13,14.

A análise estatística da associação estreita (ou seja, o emparelhamento) de dois alelos usando uma distância ideal de corte. Para identificar a gama de a maioria das diferenças robustas em distâncias entre dois alelos ou loci, usamos uma série de bicaudal teste exato de Fisher ¹⁵ s. Ou seja, em cada distância medida que testa se uma condição é significativamente sobre-representados em distâncias mais curtas entre as duas amostras. A mínima na distribuição dos valores de P indica a gama de distâncias que devem ser considerados como um ponto de corte para a íntima associação (emparelhamento ie) um dos dois alelos. Posteriormente, a bicaudal teste exato de Fisher é usado tó avaliar a importância do emparelhamento de dois alelos identificados no valor de corte ^15. Correcções de teste são aplicados a contabilizar o número total de testes de Fisher realizada ^16.

A análise estatística da associação entre o locus de interesse com sub-compartimentos nucleares ou proteínas. O teste de duas caudas exacto de Fisher-é utilizado para analisar a importância da associação do locus de interesse com compartimentos diferentes ou proteínas ^15.

Resultados

DNA e imuno-FISH são utilizados no laboratório Skok para estudar as alterações na organização nuclear associadas com o processo de recombinação V (D) J de receptor de antigénio, durante loci B e T o desenvolvimento de linfócitos. As técnicas acima descritas nos permitir i) medir distâncias entre as duas extremidades de um locus (contração) ii) medir distâncias entre alelos ou loci (emparelhamento), iii) analisar os danos no DNA que ocorrem dentro loci, iv) avaliar a localização de alelos e locos em rela...

Discussão

As técnicas descritas acima foram usadas no nosso laboratório para analisar a regulação da recombinação V (D) J de imunoglobulina e Tcra / d loci no desenvolvimento de linfócitos ^30,31. Estamos confiantes de que esta técnica pode ser adaptada para a detecção de várias proteínas nucleares, compartimentos nucleares e locos, em diferentes tipos de células. Modificações do protocolo pode ser necessário, e, neste caso, os passos principais para se concentrar são as seguintes. Em ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente / Material	Companhia	Número de Catálogo	Comentários
H 2 O	Pescador	# BP2470
RNase A	Sigma	# R4642
dNTP	Sigma	# DNTP100
Alexa dUTP	Invitrogen	# C11397 a C-11401
Cy3 ou Cy5 dUTP	Pescador	N º 45-001-xxx
DNase I	Roche	# 04536282001
DNA Pol I	Biolabs	# M0209
0,025 mM filtros	Millipore	# VSWP02500
Cot-1 DNA 1 mg / ml	Invitrogen	# 18440
Hybloc ADN de 1 mg / ml	Genética Aplicada	# MHB
Esperma de salmão	Sigma	# D1626	pó a serem ressuspensas a 10 mg / ml em H2O
NaAc (Acetato de sódio, pH 5,2, solução tampão)	Sigma	# S7899
Ficoll 400 (Mol. Biol grau)	Pescador	# 525
Polivinilpirrolidona (Mol Biol grau)	Pescador	# BP431
Dextran pó de sulfato	Sigma	# D8906
SSPE (Solução salina-fosfato de sódio-EDTA) solução 20x	Pescador	# BP1328
Formamida	Pescador	# BP227
Lamelas	Pescador	º 12-548-B
Slides	Pescador	# 12-550
Placas de 6 poços	Pescador	# 0720080
PBS, 10x	Pescador	# MT-46-013-CM
Poli-L-lisina solução	Sigma	# P8920
Paraformaldeído, grânulos, 95%	Sigma	# 441244
Triton-X-100, Mol Biol grau	Sigma	# T8787
BSA (Albumina de Soro Bovino) Fracção V	Pescador	# BP 1600
Soro normal de cabra	Vector Labs	# S-1000
Tween-20, Mol Biol grau	Sigma	# P9416
SSC (citrato de sódio Saline) solução 20x	Pescador	# BP1325
Prolongar reagente Antifade Ouro	Invitrogen	# P36930
DAPI (4 ',6-diamidino-2-fenilindol)	Sigma	# D9542
Melhor teste de um cimento de borracha casaco	Abastecimento de lojas de arte ou de escritório
			Tabela 1. Reagentes específicos e pequenos equipamentos.