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요약

여기 3D 현미경 및 분석 (3D immuno-DNA의 물고기)에 의해 다음 DNA 생선의 immunofluorescence와 DNA 시퀀스에 의한 히스톤 수정의 동시 검출을위한 프로토콜을 설명합니다.

초록

3D 공 촛점 현미경에 이어 3 치수 보존 핵에 DNA 프로브를 사용하여 원위치 하이브리드 화에 형광은 (3 차원 DNA 물고기) 각 셀의 하위 지역 염색체 유전자 loci의 위치, 또는 전체 지역을 시각화 할 수있는 가장 직접적인 방법을 나타냅니다. 분석이 유형의 핵의 글로벌 아키텍처뿐만 아니라 핵 공간 내의 특정 게놈의 loci와 지역의 행동에 대한 통찰력을 제공합니다. Immunofluorescence는 반면에, 핵 단백질의 검출을 (수정 histones, 히스톤 변형과 수식, 전사 기계 요소, 핵 하위 구획 등) 할 수 있습니다. immunofluorescence 및 3D DNA 물고기를 결합의 주요 과제는 핵의 3D 아키텍처뿐만 아니라 항체에 의해 검출 된 에피토프를 유지하기 위해 한 손에 있으며, 반면에, DNA 프로브의 침투가 감지 할 수 있도록 유전자 loci 또는 염색체 지역 1-5. 여기 3D 보존 핵의 게놈 loci과 염색질 수정 시각화를 결합한 프로토콜을 제공합니다.

서문

Epigenetic 메커니즘을 트리거 설치 및 발달 및 세포 유형의 특정 전사의 프로필 상속. 한 수준에서이 활성 또는 자동 게놈 영역을 정의 염색질 포장 변조를 포함합니다. 큰 규모에서 게놈과 핵 건축의 글로벌 3D 조직은 전사 패턴의 제어 역할을한다. 따라서, 이러한 epigenomic 기능의 해부는 유전자 6-11을 규제하는 방법의 전체 이해 필수적입니다.

결합 immunofluorescence 및 3D DNA의 물고기는 특정 상호 작용 / 핵 내에서 DNA 시퀀스 및 / 또는 단백질의 연결을 평가하여 분자 및 생화학 분석을 보완 할 수있는 독특한 기회를 제공합니다. 동안 또한, 같은 염색질 immunoprecipitation (칩 seq) 또는 깊은 시퀀싱와 결합 염색체 캡쳐 형태로 게놈 전체의 높은 처리량 기술 (4C-seq, 5C는, 하이-C) 글로벌 DAT를 제공합니다세포 인구 12, immunofluorescence / DNA 물고기 기술은 단일 세포 수준에서 분석 할 수 있습니다.

여기 3D 현미경 및 분석 (3D immuno - 물고기) 다음 DNA 생선의 immunofluorescence와 DNA 시퀀스에 의한 히스톤 수정의 동시 검출을위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜의 장점은 DNA와 단백질 구조의 보존을 결합 시각화입니다. 이 분야에 경험은 기존 프로토콜을 개선하고 단순화 할 수있게되었습니다. 우리가 재조합를 겪고 림프구에 DNA 이중 좌초 휴식을 감지하는이 프로토콜을 사용했지만,이 방법은 다른 단백질과 다른 세포 유형에 적용 할 수 있습니다.

프로토콜

1. Fluorophores있는 DNA 프로브 레이블 : 닉 번역 (~ 6 시​​간)

  1. 클린 BAC DNA (맥시 사립으로 작성) 또는 plasmids 또는 PCR 제품, H 2 O에 resuspended 모두, 라벨에 사용할 수 있습니다. 참고 강력한 생선 신호, 프로브 적어도 10킬로바이트에 걸쳐해야.
  2. RNase에서 DNA를 배양 37 번 30 분에 대한 ° C (모든 시약은 표 1에 나열되어 있습니다).
  3. 16에서 2 시간의 대화명 번역 반응을 길러 ° C (표 2, 3 참조). 직접 라벨의 다른 방법은 (: 생선 태그, Invitrogen 예) 사용할 수 있습니다.
  4. -80에 하나의 시간에 대한 반응을 비활성화 -20 ° C.에서 ° C 또는 특급
  5. 2 % 아가로 오스 겔에서 프로브의 크기를 결정합니다. 얼룩은 약 300-500 BP (Cy5-프로브의 비방이 표시되지합니다)에서 대부분의과 100 1,000 BP 사이 여야합니다. DNA가 충분히 소화되지 않은 경우, 더 많은 DNA 폴 I 및DNase I은 반응에 추가 및 16 ° C.에서 두 시간에 incubated 수 있습니다
  6. 어둠의 두 시간에 H와 2 0을 채워 이리터 비커에서 0.025 mm 필터에 프로브를 정화.
  7. 다음과 같이 프로브에 차단 요소를 추가 침대-1 DNA 10 μg, Hybloc의 DNA 10 μg과 DNA 프로브의 10 μg을위한 연어 정자의 100 μg. -20 ° C.에 저장 DNA 프로브

2. 프로브 강수량 / 변성 / 사전 어닐링 (3-4 시간)

  1. 0.3 μg과 DNA 프로브의 1 μg 사이는 coverslip 당 사용됩니다. 3M NaAc (산도 5.2)와 100 % 에탄올 2.5 볼륨의 0.1 볼륨 믹스 탐사선이 -80에 하나의 시간에 품다 ° C 또는 야간 -20 ° C에서와 4에서 13,000 rpm으로 스핀 다운 ° C를 30 분에. DNA 프로브의 양이 DNA의 품질과 하이브리드의 핵 지역에 따라 조정 될 수 있습니다. 직접 라벨의 대체 방법의 감소 금액의 사용을 허용 할 수 있습니다프로브. 하나의 슬라이드에 여러 개의 DNA 생선 신호 감지를 들어, 다른 프로브는 (반복 시퀀스처럼, 사전 annealed이 아니어야 프로브 제외) 함께 유발 될 수 있습니다. 같은 시간에 수행 여러 가지 실험에 대한 프로브도 함께 유발 될 수 있습니다. 펠렛은 가볍게 (프로브의 작은 금액이 유발되는 경우, 펠릿이 표시되지 않을 수 있습니다)를 사용 fluorophores에 따라 색상이되어야합니다.
  2. 드라이 알약과 37-45에서 어둠 속에서 (Eppendorf thermomixer를 사용하여) 진동과 coverslip 당 (표 4 참조) 15 μl 하이브 리다이 제이션 버퍼에서 그들을 resuspend ° C (약 20 분) 등이 있습니다.
  3. 75-95에서 5 분에 변성 프로브 ° C.
  4. 30-60 분에 대한 ° C 37 프로브를 사전 어닐링. 사전 어닐링의 길이는 프로브의 복잡성과 품질에 따라 조정될 수 있습니다.
  5. 밤새 하이브리드에 대한 coverslips (제 3 항 참조)에 탐사선을 적용합니다.

3. 3차원 DNA 물고기 - 첫 번째 날 (~ 3 시간)

  1. 비 점착성의 세포는 1X PBS (coverslip 당 5-10 μl 1X PBS에서 ~ 2x10 5 세포)의 작은 볼륨에 집중하고 폴리-L-라이신 코팅 coverslip의 중심에 놓을 수 있습니다. 자기편 세포는 최소 24 시간 (~ 70 % 합류) (coverslips는 0.1 % 젤라틴으로 코팅 할 수 있습니다)에 coverslips에 배양해야합니다. 광장 18x18에 24~24mm의 coverslips는 6 잘 접시에 배치되며, 프로토콜에 걸쳐, 각 솔루션의 두 ML은 (또는 원형 1.5 mm의 coverslips는 12/24-well 판에 배치 할 수 있습니다) 잘 당 사용됩니다.
  2. RT (4 % PFA 주식은 -20 ° C에서 저장 aliquoted 할 수 있습니다)에서 10 분 동안 2 % paraformaldehyde / 1X PBS, pH를 7-7.4에서 셀을 수정합니다. Paraformaldehyde가 (16 %) 용액에 구입할 수 있습니다, 또는 4 %의 주식 솔루션은 분말 / prills에서 준비하실 수 있습니다. Paraformaldehyde 가루는> 60 ° 얼음에 C (산도가 해산을 촉진하기 8-9으로 증가 될 수있다), 냉각 다운이 조정에 1X PBS에 용해되어에드 산도 7-7.4까지, 필터링, 매에 aliquoted 및 -20 ° C.에 주 저장
  3. 1X PBS에 세 린스 후, 얼음에 5 분을 위해 아이스처럼 차가운 0.4 % 트리톤 - X-100 / 1X PBS로 세포를 permeabilize. permeabilization의 길이는 세포 종류에 따라 조정될 수 있습니다 NB는 :. DNA 물고기가 immunofluorescence와 결합되어있는 경우, immunostaining는 (제 4 참조)이 단계에서 수행해야합니다.
  4. 37 한 시간에 0.1 μg / 1X PBS에서 μl RNase ° C.와 1X PBS, 배양 세포에서 세 린스 후 Coverslips는 parafilm의 솔루션이나 습기 챔버에서 슬라이드의 100 μl의 드롭에 셀 측을 배치하고 있습니다. Coverslips 그런 다음 조심스럽게 집게로 제거됩니다. 어떠한 저항도가 발생하는 경우 coverslips는 세포 손상을 방지하기 위해 1X PBS로 넘쳐해야합니다.
  5. 1X PBS에 세 린스 후, 얼음에 10 분 동안 아이스처럼 차가운 0.7 % 트리톤 - X-100 / 0.1 M HCL에 셀을 permeabilize.
  6. 세 린스 후N 1X PBS, RT 30 분에 1.9 M HCL에 변성 세포. 반면, 세포는 적어도 30 분 동안 75-80 ° C 50 % 포름 아미드 / 2 배 SSC에 변성 될 수 있습니다. 하이브리드 길이 (및 온도) 세포 유형에 따라 최적화 될 수 있습니다.
  7. 얼음처럼 차가운 1X PBS에 세 린스 후, ° C 어둡고 습한 챔버 37에서 잠을 자면 프로브와 세포 잡종을 만들다. Coverslips는 슬라이드 프로브의 15 μl의 드롭에 셀 측을 배치하고, 고무 시멘트로 밀봉되어 있습니다.

4. 3 차원 Immuno - 물고기 - 1 일 (~ 6-7 시간)

  1. 결합 immunofluorescence / DNA 생선, immuno-얼룩은 0.4 % 트리톤 - X-100 (단계 3.3)의 permeabilization 한 후 수행해야합니다.
  2. RT 30 분 (2.5 % 소 혈청 알부민 (BSA), 10 % 정상 염소 혈청, 0.1 % 십대 초반 - 2​​0)에 대한 솔루션을 차단에 세포를 배양. 차단 솔루션, 필터링 1.5 ML의 Eppendorfs에 aliquoted과 m에 저장-20 ° C.에 onths
  3. 습기 챔버에서 RT 한 시간 동안 단백질 또는 차단 솔루션에 희석 관심 히스톤 수정에 대해 제기 된 주요 항체와 세포를 배양. 여기 H2AX (; 자세한 내용은 표 5를 참조 γ-H2AX, Millipore)의 phosphorylated 세린-139에 대한 항체의 예를 보여줍니다. Coverslips는 parafilm의 솔루션이나 습기 챔버에서 슬라이드의 100 μl의 드롭에 셀 측을 배치하고 있습니다. Coverslips 그 다음 신중하게 포셉 (1X PBS 필요한 경우와 홍수)로 제거됩니다. 참고 희석과 부화 길이는 항체 및 세포 유형의 품질에 따라 조정 될 수있다.
  4. 0.2 %에 BSA / 0.1 % 십대 초반 - 2​​0 / 1X PBS, 흔들림과 RT의 세 배 5 분 거리에 있습니다. 세포를 씻으십시오
  5. 어두운 습윤 챔버에 RT 한 시간에 대한 솔루션을 차단에 희석 적절한 형광 - 복합 차 항체와 세포를 배양. 여기로 검출의 예를 보여보조 염소 항 마우스 항체 (알렉사 형석 488 또는 555, Invitrogen, 자세한 내용은 표 5 참조). Hapten - 복합 이차 항체는 (비오틴, digoxigenin 등)도 사용할 수 있습니다. 이 경우, 적절한 감지 (streptavidin, 안티 - 파 등)에 대한 추가 단계가 넘는 박 DNA - 생선 하이브리드 전이나 후에 수행 할 수 있습니다.
  6. 0.1 %에서 세포를 씻어 십대 초반 - 2​​0 / 1X PBS, 어둠 속에서 떨고있는 RT 세 번 5 분 거리에 있습니다.
  7. 어둠 속에서 RT 10 분에 2 % paraformaldehyde / 1X PBS의 사후 수정 세포.
  8. 위의 RNase A (단계 3.4)의 부화에서 DNA 생선을 계속합니다.

5. 3 차원 DNA 물고기 / Immuno - 물고기 - 두 번째 날 (~ 2 시간)

  1. 조심스럽게 조심스럽게 집게로 제거하고 세척 솔루션을 포함 우물에 넣고, 배 SSC과 함께 홍수 coverslips을 고무 시멘트를 제거합니다.
  2. 37 번 30 분 ° 흔들림과 어둠 속에서 C에 2 배 SSC에 세포를 씻으십시오.
  3. 흔들림과 어둠 속에서 RT 30 분 동안 2 배 SSC에 세포를 씻으십시오.
  4. 흔들림과 어둠 속에서 RT 30 분 동안 1X SSC에 세포를 씻어 포름 아미드와 변성의 경우, 세차는 다음으로 대체되어야합니다 :. 3 세차를 배 SSC, 5 50 % 포름 아미드 / 2 배 SSC와 3 세차의 37 각을 분 ° C.
  5. 총 DNA의 counterstaining에 대해 1.5 μg / ML DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole)를 포함하는 골드 장착 매체 연장에 세포를 탑재합니다. Coverslips은 슬라이드에 미디어를 마운트의 10-15 μl의 드롭에 셀 측을 배치하고 매니큐어로 봉인되어 있습니다. 슬라이드는 -20 ° C.에 몇 달 동안 보관됩니다

6. 3D 현미경 및 분석

  1. 3D 이미지는 다른 현미경 시스템과 획득 할 수 있습니다. 우리의 실험에서, 0.3 μm로 구분하여 광학 섹션은 Leica SP5 AOBS 공 촛점 시스템 (음향 광학 빔 스플리터)를 수집합니다. 참고 그 optica 사이의 분리난 비행기가 분석의 유형에 따라 조정될 수 있습니다.
  2. 3D 이미지 스택은 다른 소프트웨어와 도구를 사용하여 분석 할 수 있습니다. 우리는 관심 loci 사이의 거리 측정을 평가하고 하위 핵 구획 또는 단백질과 관심 loci의 협회의 다른 유형을 분석 할 이미지 J 소프트웨어를 사용합니다.
  3. 다른 셀 유형 또는 단계 사이의 비교, 관심의 다른 loci 사이의 비교 : 모든 통계 분석은 중요한 pairwise 평가 (들)과 (또는 이상) 다른 생물 조건을 두 비교 수행됩니다. 모든 통계 테스트에서 P-값 ≤ 5.00E-2 (= 0.05)이 (1.00E-2 중요 할로 이동합니다 ≤ P ≤ 5.00E-2 * 중요한, 1.00E-3 ≤ P ≤ 1.00E-2 * * 매우 중요한, P <1.00E-3 *** 매우 중요).

두 대립 유전자 사이의 거리의 전체 분포의 통계적 분석. 우리가 처음 C우리가 nonparametric 두 샘플 Kolmogorov-스 미르 노프 (KS) 테스트 13,14을 사용하여 경험적 간 allelic 거리의 배포판의 차이의 중요성을 평가 두 alleles.To 사이의 측정 거리의 전체 범위에 걸쳐 누적 분포 주파수 곡선을 onstruct.

최적의 거리 컷 - 오프를 사용하여 두 개의 대립 유전자의 가까운 연결 (예 : 페어링)의 통계 분석. 2 개의 대립 유전자 또는 loci 사이의 거리에서 가장 강력한 차이의 범위를 확인하려면, 우리는 두 꼬리 피셔 정확한 테스트 15 s의 시리즈를 사용합니다. 즉, 각 측정 거리 조건이 하나이 크게 두 샘플 사이의 짧은 거리에서 오버 표시되어 있는지 여부를 우리가 시험에서. P-값의 분포에서 최소 두 대립 유전자의 가까운 연결 (예 : 페어링)의 컷 - 오프로 간주되어야 거리의 범위를 나타냅니다. 이후 두 꼬리 피셔 정확한 테스트는 t를 사용확인 된 컷 - 오프 값이 15에서 두 대립 유전자의 페어링의 중요성을 평가 Ø. 여러 테스트 수정 16을 수행 피셔 테스트의 총 수에 계정에 적용됩니다.

하위 핵 구획 또는 단백질과 관심 궤적의 협회의 통계 분석. 두 꼬리 피셔 - 정확한 ​​테스트는 서로 다른 구획 또는 단백질 15 관심 궤적의 협회의 중요성을 분석하는 데 사용됩니다.

결과

DNA와 immuno-생선은 B와 T 림프구 개발하는 동안 항원 수용체 loci의 V (D) J 재조합의 과정과 관련된 핵 조직의 변화를 연구하기 위해 Skok 실험실에 사용됩니다. 위에 설명 된 기법은) 우리는 전 현장의 두 끝 (수축) 사이) 측정 거리에 ii) 대립 유전자 또는 loci (페어링) 사이를 측정 거리, III)가, loci에서 IV를 발생하는 DNA 손상을 분석 가능하게 대립 유전자의 위치를​​ 평가 및 하위 구획 (우리의 연구에...

토론

위에 설명 된 기술은 림프구에게 30,31 개발에 면역 글로불린 및 Tcra / D loci의 V (D) J 재조합의 규정을 분석하기 위해 실험실에서 사용되었습니다. 우리는이 기술이 다른 세포 유형의 다양한 핵 단백질, 핵 구획과 loci의 감지,에 적응 될 수 있다는 확신합니다. 프로토콜의 수정이 필요할 수 있습니다,이 경우에 초점을 주요 단계는 다음과 같습니다. 첫째, permeabilization의 길이는 ?...

공개

제작자들은 더 경쟁 금융 이익이 없다는 점 선언합니다.

감사의 말

우리는 토론과 의견 Skok 실험실, 특히 수잔나 휴잇의 회원 감사드립니다. 이 작품은 건강 교부금의 국립 연구소 R01GM086852, RC1CA145746 (JAS)에 의해 지원됩니다. JAS는 백혈병과 림프종 사회 학자이다. JC는 암 연구소의 Irvington 연구소 연구원입니다. MM은 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 기금 통합 대학원 교육과 연구 Traineeship (NSF IGERT 0,333,389)에 의해 지원됩니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
시약 / 재료의 이름 회사 카탈로그 번호 코멘트
H 2 O 어부 # BP2470
RNase 시그마 # R4642
dNTP 시그마 # DNTP100
알렉사 dUTP Invitrogen # C11397에 대한 C-11401
Cy3 또는 Cy5 dUTP 어부 # 45-001-XXX
DNase I 로슈 # 04536282001
DNA 폴 I Biolabs # M0209
0.025 μm 필터 Millipor전자 # VSWP02500
침대-1 DNA 1 MG / ML Invitrogen # 18440
Hybloc DNA 1 MG / ML 응용 유전학 # MHB
연어 정자 시그마 # D1626 분말은 H 2 O에 10 밀리그램 / ML에 resuspended 할
NaAc (나트륨 아세테이트, 산도 5.2 완충 용액) 시그마 # S7899
Ficoll 400 (몰 Biol 학년) 어부 # 525
Polyvinylpyrrolidone (몰 Biol 학년) 어부 # BP431
Dextran 황산 분말 시그마 # D8906
SSPE (식염 - 나트륨 인산-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)) 20x 솔루션 어부 # BP1328
포름 아미드 어부 # BP227
Coverslips 어부 # 12-548-B
슬라이드 어부 # 12-550
6 - 잘 접시 어부 # 0720080
10X PBS, 어부 # MT-46-013-CM
폴리-L-라이신 솔루션 시그마 # P8920
Paraformaldehyde, prills, 95 % 시그마 # 441244
트리톤-X-100, 몰 Biol 학년 시그마 # T8787
BSA (소 혈청 알부민) 분수 V 어부 # BP 1600
일반 염소 혈청 벡터 연구소 # S-1000
십대 초반 - 2​​0 몰 Biol 학년 시그마 # P9416
SSC (식염 나트륨 시트르산) 20x 솔루션 어부 # BP1325
골드 antifade 시약을 연장 Invitrogen # P36930
DAPI (4 ', 6 diamidino-2-phenylindole) 시그마 # D9542
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표 1. 특정 시약 및 소형 장비.

참고문헌

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