JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы опишем протокол для одновременного обнаружения модификации гистонов с помощью иммунофлуоресценции и ДНК-последовательностей ДНК FISH последующей 3D-микроскопии и анализа (3D иммуно-ДНК FISH).

Аннотация

Флуоресцентные на месте гибридизации с использованием ДНК-зондов на 3-размерной сохранились ядер следуют 3D конфокальной микроскопии (3D ДНК FISH) представляет собой наиболее прямой путь к себе расположение генов локусов, хромосомные суб-регионов или целых территорий в отдельных клетках. Этот тип анализа дает представление о глобальной архитектуре ядра, а также поведение конкретных локусов генома и регионов в ядерном пространстве. Иммунофлюоресценции, с другой стороны, позволяет обнаружения ядерных белков (гистонов изменения, гистонов варианты и модификаторы, транскрипция машин и факторов, ядерных суб-купе и т.д.). Основной проблемой в сочетании иммунофлюоресценции и 3D ДНК рыб, с одной стороны, сохранить эпитопа обнаружены антитела, а также 3D-архитектурой ядра, а с другой стороны, чтобы позволить проникновение ДНК-зонда для обнаружения генных локусов или хромосомных территорий 1-5. Здесь мы предлагаем протокол, который сочетает в себе визуализации хроматина модификации с геномных локусов в 3D сохранил ядер.

Введение

Эпигенетических спусковые механизмы создания и наследования развития и типа клеток конкретной транскрипционных профилей. На одном уровне это связано с модуляцией упаковки хроматина, который определяет активный или тихий регионов генома. В более широком масштабе, глобальной 3D организации генома и ядерных архитектуры также играть роль в контроле транскрипции моделей. Таким образом, рассечение этих эпигеномном функций имеет важное значение для полного понимания того, как гены регулируются 6-11.

Комбинированные иммунофлюоресценции и 3D ДНК FISH предоставляет уникальную возможность дополнить молекулярные и биохимические анализы по оценке специфических взаимодействий / ассоциации последовательностей ДНК и / или белков в ядре. Кроме того, в то время как по всему геному высокой пропускной методы, такие как иммунопреципитации хроматина (ChIP-далее) или хромосомы захвата конформации в сочетании с глубоким секвенирования (4C-след, 5C, Привет-C) обеспечивают глобальную DATна клеточных популяций 12, иммунофлюоресценции / ДНК FISH методы анализа позволяют на одном уровне клетки.

Здесь мы опишем протокол для одновременного обнаружения модификации гистонов с помощью иммунофлуоресценции и ДНК-последовательностей ДНК FISH последующей 3D-микроскопии и анализа (3D иммуно-FISH). Преимущество этого протокола является комбинированным визуализации ДНК и сохранению белковых структур. Наш опыт в этой области позволил нам усовершенствовать и упростить существующие протоколы. Хотя мы использовали этот протокол для обнаружения ДНК двухцепочечной перерывы в лимфоциты проходят рекомбинации, этот метод может быть применен к другим белков и других клеточных типов.

протокол

1. ДНК-зонда маркировки с флуорофоры: Nick перевода (~ 6 часов)

  1. Чистая BAC ДНК (подготовлен макси-подготовки) или плазмиды или ПЦР-продукты, все ресуспендировали в H 2 O, может быть использована для маркировки. Отметим, что для надежного сигнала FISH, зонды должны занимать не менее 10 кб.
  2. Инкубируйте ДНК в РНК в течение 30 мин при 37 ° C (все реагенты приведены в таблице 1).
  3. Инкубируйте реакции ник-трансляцией в течение 2 часов при 16 ° C (см. таблицы 2 и 3). Альтернативные методы прямой маркировки могут быть использованы (Пример: FISH Tag, Invitrogen).
  4. Деактивировать реакции в течение одного часа при температуре -80 ° C или в течение ночи при температуре -20 ° C.
  5. Определить размер зонда на 2% агарозном геле. Мазка должна быть от 100 до 1000 б.п., при этом большинство примерно в 300-500 б.п. (Обратите внимание, что мазок Cy5-зондов не видно). Если ДНК не переваривается достаточно, более ДНК-Pol I иДНКазы I могут быть добавлены к реакции и инкубировали в течение еще двух часов при 16 ° C.
  6. Очищают зондов на 0,025 мм фильтры в двух стаканах литр заполнены H 2 0 в течение двух часов в темноте.
  7. Добавить блокирующих факторов на зонды следующим образом: 10 мкг Cot-1 ДНК, 10 мкг ДНК Hybloc и 100 мкг спермы лосося в течение 10 мкг ДНК-зондов. Магазин ДНК-зондов при температуре -20 ° C.

2. Датчик осадков / Денатурация / Pre-отжига (3-4 часа)

  1. Между 0,3 мкг и 1 мкг ДНК-зонда используется на покровное. Mix зондов с 0,1 объема 3M NaAc (рН 5,2) и 2,5 объема 100% этанола, инкубировать в течение одного часа при температуре -80 ° C или в течение ночи при температуре -20 ° C и спином вниз при 13000 оборотов в минуту при температуре 4 ° С в течение 30 мин. Обратите внимание, что количество ДНК-зонда может быть скорректирована в зависимости от качества ДНК и ядерной области гибридизации. Альтернативные методы прямой маркировки может допускать использование сокращения количествазондом. Для обнаружения нескольких ДНК FISH сигналы на одном слайде, различные зонды могут быть спровоцированы вместе (кроме зондов, которые не должны быть предварительно отожженная, как повторяющиеся последовательности). Зонды для нескольких экспериментов, выполненных в то же время также может быть спровоцирован вместе. Гранулы должны быть слегка окрашены в соответствии с флуорофоров используется (если небольшое количество зондов осаждают, гранулы могут быть не видны).
  2. Гранулы сухого и ресуспендируют них в 15 мкл буфера для гибридизации (см. таблицу 4) на покровное при встряхивании (с использованием Eppendorf Thermomixer) в темноте при 37-45 ° C (в течение примерно 20 мин).
  3. Денатурировать зонды в течение 5 мин при 75-95 ° C.
  4. Предварительно отжига зондов при 37 ° С в течение 30-60 мин. Продолжительность предварительного отжига может быть скорректирована в зависимости от сложности и качества зондов.
  5. Применение зондов для покровные для ночлега гибридизации (см. раздел 3).

3. 3-Мерной ДНК FISH - First Day (~ 3 часа)

  1. Non-прилипшие клетки сконцентрированы в небольшом объеме 1x PBS (~ 2x10 5 клеток в 5-10 мкл 1x PBS в покровным) и упал в центре поли-L-лизин покрытием покровное. Приверженец клетки должны быть выращены на покровных по крайней мере, 24 часа в сутки (~ 70% слияния) (покровные могут быть покрыты 0,1% желатина). Площадь 18x18 до 24-24 мм покровные находятся в 6-луночных планшетах, и на протяжении всего протокола, два мл каждого раствора используется на лунку (в качестве альтернативы круглый 1,5 мм покровные могут быть помещены в пластинах 12/24-well).
  2. Исправить клеток в 2% параформальдегида / 1x PBS, рН 7-7.4, в течение 10 минут при комнатной температуре (4% PFA акции могут быть аликвоты, хранят при температуре -20 ° C). Параформальдегид можно приобрести в растворе (16%), или 4% растворы могут быть получены из порошка / гранул. Параформальдегид порошок растворяют в 1x PBS при> 60 ° C (рН может быть увеличена до 8-9 для облегчения растворения), охлажденные вниз на льду, установитеред до рН 7-7.4, фильтруют аликвоты в соколов и хранятся в течение недели при температуре -20 ° C.
  3. После трех полосканий в 1x PBS, permeabilize клеток в ледяной холодной 0,4% Triton-X-100 / 1x PBS в течение 5 мин на льду. Длина проницаемости может быть скорректирована в зависимости от типа клеток NB:. Если ДНК рыбы в сочетании с иммунофлюоресценции, иммуноокрашивания должны быть выполнены на этом этапе (см. раздел 4).
  4. После трех полосканий в 1x PBS, инкубировать клетки с 0,1 мкг / мкл РНКазы в 1x PBS в течение одного часа при 37 ° C. Покровные размещены ячейки стороной вниз на капле 100 мкл раствора на парафильмом или слайд во влажной камере. Покровные затем осторожно удалить пинцетом. Если сопротивление встречается, покровные должна быть залита 1x PBS для того, чтобы избежать повреждения клеток.
  5. После трех полосканий в 1x PBS, permeabilize клеток в ледяной холодной 0,7% Triton-X-100 / 0,1 М HCl в течение 10 минут на льду.
  6. После трех полосканий яп 1x PBS, денатурация клеток в 1,9 M HCl в течение 30 мин при комнатной температуре. С другой стороны, клетки могут быть денатурировали в 50% формамида / 2x SSC при 75-80 ° С в течение 30 мин. Обратите внимание, что гибридизация длины (и температуры) могут быть оптимизированы в зависимости от типа клеток.
  7. После трех полосканий в ледяной 1x PBS, скрещивать клетки с датчиками в течение ночи при 37 ° C в темной и влажной камере. Покровные размещены ячейки стороной вниз на каплю 15 мкл зонда на слайде, и запечатаны с резиновым клеем.

4. 3-мерные иммуно-FISH - First Day (~ 6-7 часов)

  1. Для комбинированной иммунофлюоресценции / ДНК FISH, иммуно-окрашивания следует проводить после пермеабилизации в 0,4% Triton-X-100 (шаг 3,3).
  2. Инкубировать клетки в блокирующем растворе в течение 30 минут при комнатной температуре (2,5% бычьего сывороточного альбумина (БСА), 10% нормальной козьей сывороткой, 0,1% Твин-20). Блокирующий раствор фильтруют, аликвоты в 1,5 Eppendorfs мл и хранят при тonths при температуре -20 ° C.
  3. Инкубируйте клетки с первичными антителами, выдвигаемые против белка или модификация гистонов интерес разводили в блокирующем растворе, в течение одного часа при комнатной температуре во влажной камере. Здесь мы покажем на примере антитело против фосфорилированного серина-139 из H2AX (γ-H2AX, Millipore, см. таблицу 5 для подробной информации). Покровные размещены ячейки стороной вниз на капле 100 мкл раствора на парафильмом или слайд во влажной камере. Покровные затем осторожно удалить пинцетом (залита 1x PBS при необходимости). Отметим, что разведение и инкубации длина может быть скорректирована в зависимости от качества антител и клеточных типов.
  4. Вымойте клеток в 0,2% BSA / 0,1% Твин-20 / 1x PBS, три раза по 5 минут при комнатной температуре при встряхивании.
  5. Инкубируйте клетки с соответствующим флуорофор-сопряженных вторичные антитела, разведенного в блокировании решения в течение одного часа при комнатной температуре в темном и влажном камеры. Здесь мы покажем пример обнаружения свторичных козьего анти-мышиных антител (Alexa Fluor 488 или 555, Invitrogen; см. Таблицу 5 для подробностей). Гаптен-сопряженных вторичными антителами (биотин, дигоксигенин, и т.д.) также могут быть использованы. В этом случае дополнительный шаг для соответствующего обнаружения (стрептавидин, анти-копать, и т.д.) могут быть выполнены либо до, либо после того, как в течение ночи ДНК-FISH-гибридизации.
  6. Промыть клеток в 0,1% Твин-20 / 1x PBS, три раза по 5 минут при комнатной температуре при встряхивании в темноте.
  7. После исправления клеток в 2% параформальдегида / 1x PBS в течение 10 мин при комнатной температуре в темноте.
  8. Продолжить ДНК FISH, как указано выше от инкубации в РНКазы (шаг 3,4).

5. 3-мерной ДНК FISH / иммуно-FISH - второй день (~ 2 часа)

  1. Осторожно снимите резиновый клей, наводнения покровные с 2x SSC, осторожно удалить пинцетом и поместить их в лунки, содержащие моющего раствора.
  2. Вымойте клетки в 2х SSC в течение 30 мин при 37 ° С в темноте при встряхивании.
  3. Вымойте клетки в 2х SSC в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте при встряхивании.
  4. Вымойте клетки в 1x SSC в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте при встряхивании Обратите внимание, что в случае денатурации формамидом, моет должна быть заменена следующим:. 3 стирок в 50% формамида / 2x SSC и 3 стирок в 2х SSC, 5 мин каждый, при 37 ° C.
  5. Установите клеток в продлит Золотой монтажа среде, содержащей 1,5 мкг / мл DAPI (4,6-диамидино-2-фенилиндола) для counterstaining от общего числа ДНК. Покровные размещены ячейки стороной вниз на капли 10-15 мкл монтаж среды на слайде и опечатаны с лаком для ногтей. Слайды хранятся в течение месяца при температуре -20 ° C.

6. 3D-микроскопии и анализа

  1. 3D-изображения могут быть получены с различными системами микроскопом. В наших экспериментах, оптических секций, разделенных 0,3 мкм собираются на Leica SP5 AOBS конфокальной системы (акустооптического светоделитель). Обратите внимание, что расстояние между Opticaл самолеты могут быть скорректированы в зависимости от типа анализа.
  2. 3D-стека изображение может быть проанализированы с помощью различного программного обеспечения и инструментов. Мы используем программное обеспечение изображение J для оценки измерения расстояния между локусами интерес и для анализа различных типов ассоциаций локусов интерес с суб-ядерный отделения или белки.
  3. Все статистические анализы проводятся для сравнения двух (или более) различных биологических условий с попарно оценки (ы) значение: сравнение между различными типами клеток или этапов, сравнение между различными локусами интерес. Во всех статистических тестов, P-значение ≤ 5.00E-2 (= 0,05), они считаются значимыми (1,00-2 ≤ P ≤ 5.00E-2 * значительным; 1,00 E-3 ≤ P ≤ 1,00 E-2 * * очень значительным, р <1,00-3 *** весьма значительным).

Статистический анализ всей распределения расстояний между двумя аллелями. Сначала мы сonstruct кумулятивные кривые распределения частот во всем диапазоне измеряемых расстояний между двумя alleles.To оценки значимости различий в распределении эмпирических между аллельных расстояния мы используем непараметрический двух выборок Колмогорова-Смирнова (KS) Тест 13,14.

Статистический анализ тесную связь (то есть спаривания) двух аллелей использованием оптимальное расстояние отключения. Чтобы определить круг наиболее надежные различия в расстояниях между двумя аллелями или локусов, мы используем серию из двух хвост точный критерий Фишера 15 с. А именно, в каждом измеренное расстояние мы проверить, является ли одно условие существенно широко представлены на более коротких расстояниях между двумя образцами. Минимум в распределении P-значения указывает диапазон расстояний, которые должны рассматриваться в качестве отсечения для тесную связь (то есть спаривания) из двух аллелей. Впоследствии два хвоста точный критерий Фишера используется тØ оценить значение спаривания двух аллелей определены пороговые значения 15. Многочисленные исправления тестирование применяется для учета общего количества тестов Фишера выполняется 16.

Статистический анализ ассоциации локуса интерес с суб-ядерный отделения или белки. Двух хвост Fisher-точный тест используется для анализа значимости ассоциации локуса интерес с различными отсеками или белков 15.

Результаты

ДНК и иммуно-FISH используются в лаборатории Скок для изучения изменений в ядерной организации, связанные с процессом V (D) J рекомбинации локуса рецептора антигена в В-и Т-лимфоцитов развития. Описанные выше методы позволяют я) мера расстояния между двумя концами локус (сжатие) II) для измер...

Обсуждение

Описанные выше методы были использованы в нашей лаборатории для анализа регулирования V (D) J рекомбинации иммуноглобулинов и TCRA / д локусов в развивающихся лимфоциты 30,31. Мы уверены, что эта техника может быть адаптирована для обнаружения различных ядерных белков, ядерны...

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить членов Скок лаборатории, особенно Сюзанна Хьюитт, для обсуждения и комментариев. Эта работа выполнена при поддержке Национального института здравоохранения грантов R01GM086852, RC1CA145746 (JAS). JAS является лейкемия и лимфома ученого общества. JC является членом Irvington Института исследований института рака. MM поддерживается Национального научного фонда грант интегративной последипломного образования и науки Стажировка (NSF IGERT 0333389).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Название Реагенты / Материал Компания Номер по каталогу Комментарии
H 2 O Рыбак # BP2470
РНКазы Сигма # R4642
дНТФ Сигма # DNTP100
Alexa дУТФ Invitrogen # C11397 С-11401
Cy3 или Cy5 дУТФ Рыбак № 45-001-ххх
ДНКазы I Roche # 04536282001
ДНК-Pol I Biolabs # M0209
0,025 мкм фильтры Milliporэлектронной # VSWP02500
Детская кроватка-1 ДНК 1 мг / мл Invitrogen # 18440
Hybloc ДНК 1 мг / мл Прикладной генетики # MHB
Лосось спермы Сигма # D1626 порошок для ресуспендировали в дозе 10 мг / мл в H 2 O
NaAc (ацетат натрия, рН 5,2, буферный раствор) Сигма # S7899
Ficoll 400 (Молекулярная биология класс) Рыбак # 525
Поливинилпирролидон (Mol Biol класс) Рыбак # BP431
Декстран сульфат порошок Сигма # D8906
ГНПП (Saline-фосфат натрия, EDTA) 20x решения Рыбак # BP1328
Формамид Рыбак # BP227
Покровные Рыбак № 12-548-B
Слайды Рыбак # 12-550
6-луночные планшеты Рыбак # 0720080
PBS, 10x Рыбак # MT-46-013-CM
Поли-L-лизин решения Сигма # P8920
Параформальдегид, гранулы, 95% Сигма # 441244
Triton-X-100, Mol Biol класса Сигма # T8787
BSA (бычий сывороточный альбумин) доля V Рыбак # BP 1600
Нормальной козьей сывороткой Vector Labs # S-1000
Твин-20, Mol Biol класса Сигма # P9416
SSC (солевой раствор цитрата натрия) 20x решения Рыбак # BP1325
Продлить Золотой реагента antifade Invitrogen # P36930
DAPI (4 ',6-диамидино-2-фенилиндол) Сигма # D9542
Лучший тест один слой резинового клея Магазины Искусство или канцелярских товаров
Таблица 1. Специфических реагентов и малого оборудования.

Ссылки

  1. Chaumeil, J., Okamoto, I., Heard, E. X-chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells: analysis of histone modifications and transcriptional activity using immunofluorescence and FISH. Methods in enzymology. , 376-405 (2004).
  2. Cremer, M., et al. Multicolor 3D fluorescence in situ hybridization for imaging interphase chromosomes. Methods Mol. Biol. 463, 205-239 (2008).
  3. Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation. Methods Mol. Biol. 463, 297-308 (2008).
  4. Solovei, I., Cremer, M. 3D-FISH on cultured cells combined with immunostaining. Methods Mol. Biol. 659, 117-126 (2010).
  5. Markaki, Y. The potential of 3D-FISH and super-resolution structured illumination microscopy for studies of 3D nuclear architecture: 3D structured illumination microscopy of defined chromosomal structures visualized by 3D (immuno)-FISH opens new perspectives for studies of nuclear architecture. BioEssays : news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 34, 412-426 (2012).
  6. Heard, E., Bickmore, W. The ins and outs of gene regulation and chromosome territory organisation. Current opinion in cell biology. 19, 311-316 (2007).
  7. Misteli, T. Beyond the sequence: cellular organization of genome function. Cell. 128, 787-800 (1016).
  8. Fraser, P., Bickmore, W. Nuclear organization of the genome and the potential for gene regulation. Nature. 447, 413-417 (2007).
  9. Cremer, T., et al. Chromosome territories--a functional nuclear landscape. Current opinion in cell biology. 18, 307-316 (2006).
  10. Mao, Y. S., Zhang, B., Spector, D. L. Biogenesis and function of nuclear bodies. Trends in genetics : TIG. 27, 295-306 (2011).
  11. Dostie, J., Bickmore, W. A. Chromosome organization in the nucleus - charting new territory across the Hi-Cs. Current opinion in genetics & development. 22, 125-131 (2012).
  12. van Steensel, B., Dekker, J. Genomics tools for unraveling chromosome architecture. Nature. 28, 1089-1095 (2010).
  13. Massey, F. J. The Kolmogorov-Smirnov Test for Goodness of Fit. Journal of the American Statistical Association. 253, 1951 (1951).
  14. Collins, A., et al. RUNX transcription factor-mediated association of Cd4 and Cd8 enables coordinate gene regulation. Immunity. 34, 303-314 (2011).
  15. Fisher, R. A. On the interpretation of χ2 from contingency tables, and the calculation of P. Journal of the Royal Statistical Society. 85, 87-94 (1922).
  16. Benjamini, Y. H., Yosef, Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing. Journal of the Royal Statistical Society, Series B (Methodological). 57, 125-133 (1995).
  17. Fitzsimmons, S. P., Bernstein, R. M., Max, E. E., Skok, J. A., Shapiro, M. A. Dynamic changes in accessibility, nuclear positioning, recombination, and transcription at the Igkappa locus. J. Immunol. 179, 5264-5273 (2007).
  18. Fuxa, M., et al. Pax5 induces V-to-DJ rearrangements and locus contraction of the immunoglobulin heavy-chain gene. Genes Dev. 18, 411-422 (2004).
  19. Goldmit, M. Epigenetic ontogeny of the Igk locus during B cell development. Nature. 6, 198-203 (2005).
  20. Hewitt, S. L. Association between the Igk and Igh immunoglobulin loci mediated by the 3' Igk enhancer induces 'decontraction' of the Igh locus in pre-B cells. Nature. 9, 396-404 (2008).
  21. Johnson, K. IL-7 Functionally Segregates the Pro-B Cell Stage by Regulating Transcription of Recombination Mediators across Cell Cycle. Journal of Immunology. , (2012).
  22. Karnowski, A., et al. Silencing and nuclear repositioning of the lambda5 gene locus at the pre-b cell stage requires Aiolos and OBF-1. PLoS ONE. 3, e3568 (2008).
  23. Kosak, S. T. Subnuclear compartmentalization of immunoglobulin loci during lymphocyte development. Science. 296, 158-162 (2002).
  24. Liu, H., et al. Yin Yang 1 is a critical regulator of B-cell development. Genes Dev. 21, 1179-1189 (2007).
  25. Parker, M. J. The pre-B-cell receptor induces silencing of VpreB and lambda5 transcription. Embo J. 24, 3895-3905 (2005).
  26. Roldan, E., et al. Locus 'decontraction' and centromeric recruitment contribute to allelic exclusion of the immunoglobulin heavy-chain gene. Nature immunology. 6, 31-41 (2005).
  27. Skok, J. A. Nonequivalent nuclear location of immunoglobulin alleles in B lymphocytes. Nature. 2, 848-854 (2001).
  28. Skok, J. A. Reversible contraction by looping of the Tcra and Tcrb loci in rearranging thymocytes. Nature immunology. 8, 378-387 (2007).
  29. Xiang, Y., Zhou, X., Hewitt, S. L., Skok, J. A., Garrard, W. T. A multifunctional element in the mouse Igkappa locus that specifies repertoire and Ig loci subnuclear location. Journal of Immunology. 186, 5356-5366 (2011).
  30. Hewitt, S. L. RAG-1 and ATM coordinate monoallelic recombination and nuclear positioning of immunoglobulin loci. Nature immunology. 10, 655-664 (2009).
  31. Deriano, L., et al. The RAG2 C terminus suppresses genomic instability and lymphomagenesis. Nature. 471, 119-123 (2011).
  32. Brown, K. E., Baxter, J., Graf, D., Merkenschlager, M., Fisher, A. G. Dynamic repositioning of genes in the nucleus of lymphocytes preparing for cell division. Molecular cell. 3, 207-217 (1999).
  33. Fernandez-Capetillo, O., Lee, A., Nussenzweig, M., Nussenzweig, A. H2AX: the histone guardian of the genome. DNA repair. 3, 959-967 (2004).
  34. Croft, J. A., et al. Differences in the localization and morphology of chromosomes in the human nucleus. The Journal of cell biology. 145, 1119-1131 (1999).
  35. Chaumeil, J., Le Baccon, P., Wutz, A., Heard, E. A novel role for Xist RNA in the formation of a repressive nuclear compartment into which genes are recruited when silenced. Genes Dev. 20, 2223-2237 (2006).
  36. Walter, J., et al. Towards many colors in FISH on 3D-preserved interphase nuclei. Cytogenetic and genome research. 114, 367-378 (2006).
  37. Toomre, D., Bewersdorf, J. A new wave of cellular imaging. Annual review of cell and developmental biology. 26, 285-314 (2010).
  38. Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. The Journal of cell biology. 190, 165-175 (2010).
  39. Dobbie, I. M. OMX: a new platform for multimodal, multichannel wide-field imaging. Cold Spring Harbor protocols. , 899-909 (2011).
  40. Boyle, S., Rodesch, M. J., Halvensleben, H. A., Jeddeloh, J. A., Bickmore, W. A. Fluorescence in situ hybridization with high-complexity repeat-free oligonucleotide probes generated by massively parallel synthesis. Chromosome research : an international journal on the molecular, supramolecular and evolutionary aspects of chromosome biology. 19, 901-909 (2011).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

72MatrixFISH3D FISHFISH3D

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены