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要約

ここでは、pH感受性緑色蛍光タンパク質変異体pHluorinを用いて、細胞表面における軸索誘導受容体の密売の時空間的ダイナミクスを研究する。pHluorinタグ付き受容体は、細胞培養と 生体内の両方で発現し、ひよこ胚のエレクトロポレーションを用いる。

要約

開発中、軸索誘導受容体は、魅力的で反発的な手がかりの両方に対する軸索感度を調節する上で重要な役割を果たす。実際に、ガイダンス受容体の活性化は、軸索先端、成長コーン、リガンドに応答することを可能にするシグナル伝達機構の第一段階である。したがって、細胞表面でのそれらの可用性の変調は、成長コーン感度の設定に関与するメカニズムの一つである。ここでは、発達中のひよこ脊髄におけるインビトロおよびインビボの両方の軸索誘導受容体の時空間的細胞表面ダイナミクスを正確に可視化する方法について述べている。緑色蛍光タンパク質(GFP)変異体のpH依存性蛍光性を利用して、細胞膜に取り組む軸索誘導受容体の割合を特異的に検出しました。我々は、まず、このようなpH依存性構造のインビトロ検証を記述し、さらに、関心のある軸索誘導受容体の時空間的ダイナミクスを評価するために、ひよこ脊髄における生体内でのそれらの使用をさらに詳述する。

概要

彼らのナビゲーション中に、軸索は彼らの目標に向かってそれらを導く複数の環境の手がかりを統合する。これらの手がかりは、軸索末端の表面で誘導受容体を活性化し、成長コーンは、今度は適切なシグナル伝達経路を開始する。したがって、受容体の細胞表面分布の時間的および空間的調節は、成長コーン1の感度を設定するために重要である。この文脈では、コミシャル軸索による正中線交差は、受容体細胞表面レベルの調節を調査するための優れたモデルである。発達中の脊髄では、コミシャル軸索は当初、正中線を横切る腹側床板に向かって引き付けられる。交差した後、床板の誘引物質への応答性を失い、床板を出て神経系2,3の反対側の最終目的地に向かってナビゲートできるように、床板忌避剤に対する応答を得る。成長コーン表面における受容体の利用可能性の調節は、正中のキューへの応答性の切り替えの基礎となるメカニズムの1つである 4,5.したがって、成長コーンの原形質膜に存在する受容体の選択的モニタリングが最も重要である。ここでは、現像するひよこ脊髄において、 生体外 および 生体内で血漿膜に対処される軸索誘導受容体を特異的に可視化する緑色蛍光タンパク質(GFP)変異体のpH依存性蛍光性に基づく方法について説明する。

Rothmanたちの研究グループは、ecliptic pHluorin6を含むGFPのpH感受性変異をポイント変異によって設計した。エクリプティックpHluorinは、中性pHで蛍光されながら酸性pH(<6)に曝露されると非蛍光であるという性質を有する。これにより、細胞内酸性コンパートメントに局在する非蛍光受容体(すなわち、内生小胞)を、細胞膜に取り込まれ、細胞外中性pH7に曝露される蛍光受容体から区別することができる。これを利用して、プレキシンA1の細胞膜局在を監視し、正中忌避セマフォリン3B5 に対する成長コーン応答を媒介する軸索誘導受容体である(図1A)。ここでは、pHluorin-plexinA1コンストラクトの インビトロ 特徴付けについて、発達中のひよこ脊髄におけるこの構造の ovo エレクトロポレーション8-10 と共に、空間および時間的解像度 の両方で生体内 の軸索誘導受容体ダイナミクスに従うことを可能にする極低温分析を行う。

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プロトコル

1. プキシンA1受容体をpHluorinでタグ付けするクローニング戦略

  1. 適切な発現ベクターを骨格として選択する(例えばマウス受容体プレキシンA1発現ベクター、アンドレアス・プッシェル博士11の贈り物)。
    注:このplexinA1ベクターは、効率的なHAタグ付き受容体挿入を実現するように設計されました。
  2. 適切なプラスミドをテンプレートとして用いたエクリプティックpHluorinコード配列をPCRにより増幅する(例えば、pHluorinタグ付きGABA A受容体、ヤコブ2博士の贈り物)。必要に応じて、バックボーンのクローニングステップを容易にするために、プライマーの5'末端に制限部位を追加します。
  3. 制限部位を用いてシグナルペプチドと受容体コード配列の間のフレーム内にpHluorin配列を挿入する(例えば図1Bに記載されているNruI/Kpn2I制限部位)。
    注:受容体の正しい標的を保証するシグナルペプチドが切断されるため、pHluorinはその後に配置する必要があります。これはシグナルペプチドの認識を保証し、関心のある受容体からのpHluorinの切断を防ぐ。
  4. PCRによって突然変異が導入されないように得られた構成体を配列する。

2. COS7細胞におけるpHluorinタグ付き受容体 インビトロ の特徴

融合タンパク質がpHが低下するほどの蛍光の血漿膜に到達する能力および蛍光の可逆的損失が低下する能力は、以下の手順を用いて確認できる。

  1. 1日目。完全なダルベッコの修正されたイーグルミディアムの2mlのガラス底35mm皿の皿1.5 x 105 COS7細胞(DMEM - 10%胎児の牛血清 - 1 mMナトリウムピルビン酸 - 25 U /mlペニシリン/ストレトマイシン - 2.5 μg/mlアンホテリシンB - pH 7.4)。
  2. 2日目。トランスフェクト細胞:
    注: セルは 70-80% コンフルエントである必要があります。
    1. 200 μl NaCl 150 mMを準備し、3 μgのDNA すなわちpHluorinタグ付き受容体をコードするベクターを加えます。穏やかに渦を回転させ、短時間回転します。
      注: これらの実験で使用した pHluorin-plexinA1 ベクターのマップを 図 1Bに示します。
    2. 10 μlのトランスフェクション試薬(または使用する試薬の適切な量)を加えます。すぐに渦。
    3. RTで10分インキュベート。
    4. 細胞に200μlのトランスフェクション試薬/DNAミックスを加えます。
    5. プレートを穏やかに移動して、ミックスの再パーティションを作成し、細胞を37°Cインキュベーターに戻します。
  3. 3日目。トランスフェクション培地を取り除き、2mlの新鮮な完全なDMEMで交換してください。
  4. 4日目。COS7 pHluorin-plexinA1 トランスフェクト細胞の生細胞イメージングを行う:
    1. DMEM完全培地の2つのアリコートを準備し、それぞれ3.5と9.5にpHを調整します。
      注:1つの35 mmプレートでは、実験を行うために各溶液の1.5mlが必要です。
    2. 細胞培地を取り出し、1mlのDMEM完全培地pH 7.4で交換してください。
    3. 顕微鏡室を開かなくても細胞培養培地に直接様々な成分を注入するために、適切なタイプのチューブで5mlシリンジを調製します。
    4. 37°C、5%CO2湿気の多い作業雰囲気のメンテナンスが可能なモジュールを使用してください。
      注:CO2 チャンバの使用に対する別のアプローチは、HEPES緩衝媒体(通常、細胞タイプに応じて10〜25 mMの範囲)を使用することです。
    5. チャンバーにセルを置き、チューブと注射器を調整します。
      注:記録中の機械的なドリフトを避けるために、顕微鏡は開始する前に平衡化する必要があります。
    6. イメージングソフトウェアを開き、多次元取得プログラムを選択します。
    7. 40Xの目的を持つトランスフェクトされたCOS7細胞を見つけ、それぞれのソフトウェアで位置をマークします。
    8. Z スタックを設定して、15 μm の深度取得を行います(プレートにメディアを追加するとフォーカスが変わる可能性があります)。
    9. GFP フィルタとフェーズの露出を設定します。
    10. 取得タイミングを設定します。
      注: 5 つの対象分野を含む実験全体では、10 分間 20 秒ごとに取得すれば十分です。
    11. 取得を開始し、DMEM pH 7.4培地で5つの制御画像を取ります。
    12. 一時停止取得、pH 3.5の1.25 mlを注入し、培地中で5.5のpHを達成し、ソフトウェアでイベントをマークし、さらに5つの時間ポイントの取得を再開する。
      注:緑色蛍光は徐々に消えるはずです。
    13. 一時停止取得、pH 9.5完全DMEMの1.2 mlを注入して、培養培地中でpH 7.4を達成し、ソフトウェアでイベントをマークし、さらに5つの時間ポイントの取得を再開する。
      注:緑色蛍光は、形質膜に再び現れるはずです。
    14. 画像を分析します。
      図2 は、pHluorin-plexinA1コンストラクトを用いてこのようなプロトコルで得られた代表的な画像を示す。

3. ovoでpHluorin-プレキジナ1コンストラクトのエレクトロポレーション

  1. エレクトロポレーション前の卵の取り扱い:
    1. 受精卵は、インキュベーションの1週間前まで14°Cの冷蔵庫に保管してください。
    2. 卵を38.5°C(101.3°F)で、胚がステージHH1412に達するまで50〜52時間飽和湿度のインキュベーターでインキュベートする。
      注:卵は卵の上部に浮かぶエレクトロポレーションのために胚が適切に配置されるように、インキュベーション中に水平に配置する必要があります。HH14段階は、適切な生存率を有する脊髄および後根神経節における分化ニューロンにおけるプラスミドの発現を得るのに適している。
  2. エレクトロポレート胚8-10:
    1. エレクトロポレーションを準備する:
      1. 2 μg/μlより優れた濃度の内毒素を含まないDNAプラスミドを調製し、所望の濃度として希釈できるようにします。
      2. 異なるDNA溶液を注入するのに十分なガラス毛細血管を引っ張ります。
      3. 滅菌PBS(-Ca2+;-Mg2+)-100 U/mlペニシリン/ストレプトマイシンを準備し、38.5°Cで平衡化する。
      4. フード、湾曲したはさみ、細かい鉗子を殺菌する。
      5. 電極間隔を制御します。
        注:電極間の4mmのスペースは、一般的に使用されます。
    2. 卵13(図3A)を窓ます):
      1. 卵の鈍い側にシェルを突き刺すために湾曲したはさみを使用してください。
      2. 0.9 mm x 25 mm の針と 5 ml のシリンジを使用して 2 ml のアルブミンを取り除きます。卵黄嚢を傷つけないように、針を縦方向に向けます。
      3. 殻の完全性を維持するために、卵の上部をテープで覆います。
      4. 湾曲したはさみを使用して、卵から2mlの卵子を取り除くときの圧力を均等にするためにテープの中央にシェルを突き刺す。その後、胚を視覚化するのに十分な大きさの窓を切り、それに取り組むことができる。
      5. 胚の脱水を避け、マニピュレータにアクセスしやすくするために、〜2 mlの無菌温かいPBS(-Ca2+;-Mg2+)-100 U/mlペニシリン/ストレプトマイシンを加えます。
    3. DNAを注入し、胚を電気ポレートする
      1. PBSでプラスミドを希釈し(-Ca2+;-Mg2+)0.5~2 μg/μlの濃度にし、速い緑色の色素を加えて最終的な0.025%濃度に達します。DNAミックスを毛細血管にロードします。インジェクターの使用をお勧めします。
        注: 毛細血管抵抗が大きすぎ(つまり、胚を注入するときに困難が発生する可能性があります)、または小さすぎる(毛細血管が大きすぎて胚に損傷を与える可能性があることを意味します)ことを確認してください。また、2μg/μlより高い核酸の濃度は、非特異的な効果を引き起こす可能性があり、制御する必要があります。
      2. 卵黄嚢と神経管を尾頭側に穿刺し、毛細管を積んだ状態で穿刺する。神経管を浅い角度で入れ、尾から頭部までの内腔をDNAミックスで満たす(図3B)。
        注: [高速緑色]では、射出精度を制御できます。
      3. 4mmの白金電極を、電気ポレートしたいレベルで神経管の両側に素早く配置し、500ミリ秒間隔で31Vの3パルスを50msecに3パルスで3回塗布します(図3C)。
        注:現像胚を損傷しないように、電極を心臓や大きな余分な胚容器に置かないようにしてください。電極に泡が形成されるはずです。
      4. 針で、シェル内のレベルを減少させるためにアルブミンの2 mlを除去します。
      5. 窓と鈍い側をテープで密閉して密封します。
      6. 卵が所望の段階になるまで、インキュベーターで38.5°Cに戻します。

4. 胚埋め込みと凍結切断

  1. エレクトロポレーション後48時間、エレクトロポレート胚を慎重に収穫する(HH24ステージ)。絨毛管内膜のテープと半分を切ります。胚が黄身に沈むのを防ぐために、胚の下にザルを置き、絨毛球膜の後半を切断する。
  2. 胚を氷冷PBSで満たされた解剖皿に移す。
  3. 蛍光ステレオ顕微鏡で神経管内の蛍光を探すことでエレクトロポレーション効率を確認します。
    注: RFPをコードするコントロールプラスミドの共エレクトロポレーションは、電気ポポレート領域を可視化するのに役立つ場合があります。
  4. マイクロスカルプテルを使用して胚を解剖し、脊髄の電気泳動領域を選択する。
  5. 解剖した胚を24ウェルプレートに移し、pH 7.4 4%パラホルムアルデヒド(PFA)-リン酸緩衝液生理塩基(PBS)、O/Nを4°Cで固定する。
    注: 固定ステップは、その「生きている」立体構造におけるpHluorinの安定化を可能にし、したがって、固定/透過組織でpHluorinを使用できるようにするために重要です。固定はpH依存的な蛍光変化を劇的に遅くするが、固定後も立体構造/プロトネーションの変化が起こり得ることを考慮する必要がある。したがって、以下のプロトコル(埋め込み、凍結切片および観察)は、固定ステップの3日以内に、すべてのバッファをpH7で行う必要がある。固定が必要ない場合は、生きた組織切片に対する観察を行うことを推奨する。
  6. 4%PFAを取り除き、pH 7.4 PBSで胚を洗浄します。
  7. PBS-15%スクロースで胚をインキュベートし、胚が沈むまで4°Cに保ちます。
  8. 固定胚をpH 7.4 7.5%ゼラチン-15%スクロースを37°Cで45分間インキュベートし、胚が完全に埋め込まれるようにする。
  9. 氷の上に埋め込み金型を配置し、固体2ミリメートルベースを達成するためにpH 7.4 7.5%ゼラチン- 15%スクロースの400 μlを追加します。
  10. 埋め込まれた胚を切り取り先端で吸引し、固体ゼラチンベースに胚を置く。
  11. pH 7.4 7.5%ゼラチン- 15%スクロースで覆い、ゼラチンが固まる前に鉗子で胚を配置する。
  12. ゼラチンが固まったら、-40°Cのイソプロパノール浴(ドライアイスまたは液体窒素を使用)を準備し、ゼラチンブロックを5分間凍結します。
  13. 冷凍ブロックは-80°Cに保ちます。
  14. 冷凍ブロックを-20°Cに1時間置きます。
  15. モールドを取り外し、ブロックをポリエチレングリコール媒体でチャックに固定します。
  16. ブロックがしっかりと固定されたら、チャックをクライオスタットシステムに入れます。
    注:染色中の組織の損失を避けるためにコーティングされたスライドを使用してください。
  17. シリアルクライオセクションを実行します(通常は20μmのクライオセクションが行われます)。
  18. 泣き切りはRTで15分間乾燥させます。
    注: GFP 蛍光の漂白を避けるために、クライオセクションは不必要な光暴露から保護する必要があります。

5. クライオセクションの顕微鏡解析

  1. 10分間RTでpH 7.4 PBSで凍結切片を水分補給する。
    注: 必要に応じて、核はHoechstで染色することができます。
  2. PBSで0.5 μg/mlのHoechst溶液を使用し、15分間凍結液をインキュベートします。
  3. スライド3xをpH 7.4 PBSで5分間リンスします。
  4. スライド取付けに進みます。O/Nを硬化させるpH 7.4(またはより基本的な)ポリビニルアルコール取り付け溶液を使用することができます:慎重にスライドとカバースリップの間の気泡の形成を避けるためにカバースリップを配置します。
  5. 取り付け媒体は、暗闇の中で4°CでO /Nを硬化させます。
  6. 反転共焦点顕微鏡を使用して、pHluorin-plexinA1融合タンパク質を正確に視覚化:最適なピンホールと光学分解能でZスタックを実行し、20X(NA 0.75)または40X(NA 1.3)レンズを使用します。
    注: pHluorin は、GFP の検出に使用される同じパラメータ (つまり、509 nm の放出ピーク) で検出可能です 。波長励起および検出フィルタの設定は、イメージングソフトウェアによって最適に定義されます。Hoechstは425-460 nm(励起は405 nm)の間で検出され、GFPまたはpHluorinは485-545 nm(励起は473nm)の間で検出され、RFPは575-675 nm(励起は559nm)の間で検出される。

チクチの脊髄のpHluorin-plexinA1およびeGFP発現の代表的な画像を 図4に示す。

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結果

figure-results-63
図 1.A. 細胞内におけるpHluorin-plexinA1蛍光特性のスキーム。PHluorinは、pHが酸性(<6)である細胞内区画では、小胞や内生体の中などで酸性であり、pHが中性である細胞外媒体に曝露されると蛍光性を有する。これにより、pHluorin-plexinA1受?...

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ディスカッション

このプロトコルは、細胞培養およびひよこ胚脊髄の発達コンテキストの両方において軸索誘導受容体のダイナミクスに従うステップバイステップの手順を提供する。

デノボpHluorin タグ付きタンパク質を設計するには、クローニング戦略に関して2つの点を考慮する必要があります。まず、pHluorinタグは、酸性のエンドーソームの内腔に曝され、その結果、細胞膜受?...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

ホマイラ・ナワビ、フレデリック・モレット、イザベル・サニャスの助けに感謝します。この研究はCNRS、アソシエーション・フランセーズ・コントル・レ・ミオパシー(AFM)、ANRヤドル、ラベックス・デヴェーカン、ラベック・コルテックス、ERC YODAからV.C.;C.D-BとA.Jは、それぞれラ・リーグ・コントル・ル・ガンとラベックス・DevWeCanフェローシップによってサポートされています。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
COS7 cellsATCCCRL-1651
DMEM GlutaMAXGIBCO61965-026
Sodium pyruvateGIBCO11360-039
Amphotericin BSigmaA2942
Fetal bovine serumGIBCO10270-106
Penicillin/StreptomycinGIBCO15140-122
Exgen500 reagentEuromedex FermentasET0250
PBS -Ca2+ -Mg2+GIBCO14190-094
Fast green dyeSigmaF7252
32% Paraformaldehyde aqueous solutionElectron Microscopy15714-SDilute extemporaneously in PBS to achieve a 4% solution
Gelatin from cold water fish skinSigmaG7041
SucroseSigmaS0389
CryomountHistolab00890
Hoechst 34580InvitrogenH21486
Mowiol 4-88Fluka81381
Consumables
Bottom-glass 35 mm dishMatTekP35G-1.5-14-C
5 ml SyringeTerumoSS-05S
Needles 0.9 mm x 25 mmTerumoNN-2025R
CapillariesCMLPP230POcapillaries are stretched manually in the flame
Superfrost Plus SlidesThermo Scientific4951PLUS
Material
Curved scissorsFST129-10
MicroscalpelFST10316-14
ForcepsFSTDumont #5 REF#11254
Equipment/software
Time lapse microscopeZeissObserver 1
Temp module SPECON for Zeiss
CO2 module SPECON for Zeiss
Metamorph softwareMetamorph
Eggs incubatorSanyoMIR154
Electroporator apparatusNepa Gene CO., LTDCUY21
ElectrodesNepa Gene CO., LTDCUY611P7-44 mm platinum electrodes
Fluorescence stereomicroscopeLEICAMZ10F
CryostatMICROMHM550
Confocal microscopeOlympusFV1000, X81
Fluoview softwareOlympus
CLC Main Workbench softwareCLC Bio

参考文献

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