のための簡単​​なシート光顕微鏡を設定する<em&gt;トトで</em&gt;イメージングの<em&gt; C.虫</em&gt;開発

要約

このプロトコルは、シート光顕微鏡のセットアップとCのin vivoイメージングのために、その実装について説明します虫の胚。

要約

高速かつ低毒性のイメージング技術は、 全体として生物の発生を研究するための前提条件である。細胞下解像度の3D映像を提供しながら、シート光ベースの顕微鏡は、共焦点顕微鏡に比べて、光退色と光毒性の影響を低減します。ここでは、正立顕微鏡と光シートを生成するための光学機械要素の小さなセットで構成されている光シートベースの顕微鏡のセットアップを提示する。プロトコルは、構築顕微鏡を整列させ、シート光を特徴付ける方法について説明します。また、C.のトトイメージングで方法を実装する方法の詳細単純な観察 ​​室を使用して、胚エレガンス 。この方法は、開発の数時間にわたる3D二色タイムラプスムービーのキャプチャを可能にする。これは、細胞形状の追跡を容易にする細胞分裂及び長期間にわたってタンパク質をタグ化すべきである。

概要

生物の形成および整形は、細胞運動、細胞形状の変化、細胞分裂および細胞分化を含む。これらのプロセスの進行と調整を理解することは、3次元機能と細胞内分解能で高速な画像処理ツールが必要です。これらのインビボイメージング機能を備えた技法の中でも、光学シート照明顕微鏡法は、単一/選択的平面照明顕微鏡法と呼ばれる低毒性効果および^1,2低い光退色を製造する独特の利点を有する。

シート照明顕微鏡法では、試料は光学切片を行う光シートにより側面から照明される。照明経路及び検出経路は、互いに直交する光シートは、検出対物レンズの物体焦点面と一致するように整列される。サンプルは、2つのパスの交点に配置されているndは3Dイメージングを可能にするように検出軸に沿って移動させることができる。関心のある面が照明されると、この面の全ての点が同時に検出されるのみ。これは、有意に取得速度を増加させ、共焦点顕微鏡³と比較して、光退色、並びに光毒性を低減する。

具体的には、シート照明顕微鏡は、セットアップと整列するには簡単です。2次元画像化のために、何のスキャンは、検出部のため、また照明部のためでもない必要ありません。能力をセクショニングを有する広視野技術として、三次元イメージングは​​、試料を保持するステージ、単一の軸移動することによって得ることができる。

ここでは、CのTOTOイメージングでのために簡単なシート光顕微鏡とその実装の ​​設定までを提示虫胚℃で虫の胚は、生体内のIMA に住むのに適しているそれらの透明性、不変系統とステレオタイプセル位置^4,5にエージング。開発した光シートのセットアップは、検出のための標準的な正立顕微鏡に基づいています。以下に示すプロトコルが構築し、位置合わせ励起モジュール/パスをテストし、シート光を特徴づけると3Dイメージングのためのサンプルをマウントする方法について説明します。また、蛍光マーカーを発現する種々の菌株のセットアップで取得タイムラプスムービーの例を示します。

プロトコル

1。シート光と検出経路の設定

図1は、光学セットアップの一般的なスキームを提供します。

1. 光学テーブル上の顕微鏡とレーザーを配置し、固定します。
2. レーザーの488 nmの、561 nmおよび対応するダイクロイックミラーを持つ405 nmのを兼ね備えています。ダイクロイックミラーの後、レーザーが正確に共同揃えなければならない。レーザ波長は、ダイクロイックミラー、及び光学フィルタの選択は、実験で使用される特定の蛍光標識の吸収スペクトルから決定されることに留意されたい。
3. 音響光学チューナブルフィルタ（AOTF）を配置します。 AOTFの周波数とパワーを調整するためにサプライヤが提供するテストシートを使用してください。よく揃うと、レーザパワーの約90％はパワーメータにより測定される最大同調で送信される。 AOTFを不要にする可能性が、いくつかのレーザは、完全にソフトウェアによって制御することができることに留意されたい。
4. プレイスと修正望遠鏡。望遠鏡は、照明対物レンズの後開口部の直径よりも等しいか大きい幅にビームを拡大つのレンズから構成されていることに留意されたい。最小焦点距離を持つレンズは最初に来るべきです。
5. 場所、近いシリンドリカルレンズの背面開口部に上方向の光路をもたらす潜望鏡を整列させ、固定します。潜望鏡の2ミラーは、その長軸が完全に展開されたビームを反射するために、ミラーの傾きに敷設されているような方法で実装されていることに注意してください。
6. 次の潜望鏡出口にシリンドリカルレンズを配置します。シリンドリカルレンズが一方向にビームを集束し、それによって光シートを形成し、他の方向にコリメート残すことに留意されたい。
7. 照明対物レンズを用いて得られる光シートに再び焦点を合わせる。照明対物レンズの像焦点が検出目的のオブジェクト焦点と一致する必要があることに注意してください。ビームを投影長距離の画面（例えば壁）に。光シートの画面シャープな輪郭に取得するために、照射ビーム軸に沿って照明の目的を移動します。
8. 顕微鏡（キューブ）内に貯留場所にクワッドライン（405/488/561/638）発光フィルタを配置します。
9. 顕微鏡出力ポートでEMCCDカメラを配置します。
10. 顕微鏡ステージに掘削穴にネジで顕微鏡のステージ上の最初の手動の平行移動ステージを固定します。キュベットは、検出対物レンズの下にセンタリングされるように、並進ステージのエッジが、離れて顕微鏡ステージの中心から約2cmに配置しなければならないことに留意されたい。
11. 最初の1に第2の手動移動ステージを固定します。 2ステージの方向は（XとYの変換）に対して垂直でなければならない。
12. 前の2つのステージの上部にZピエゾステージを固定します。電動ステージではなく、圧電ステージの使用できることに注意してください。
13. キュベットholdeを修正しました。rはステージの上部にある（ 図2参照）。キュベットは、このように互いに垂直である、照明経路及び検出経路の交点に配置される。

2。シート光を確認する

1. 蛍光性溶液でガラスキュベットに充填し、二つの光路の交差点に試料ホルダー上に置きます。シート光は、このように表示されている。これは、水平にあり、対称/検出対物レンズに対して中心。
2. シリンドリカルレンズを取り外し、光シートの厚さを測定するための画像を取得する。光シートの厚さは照明対物レンズ（NA = 0.3で約3〜4程度）の開口数（NA）に依存していることに注意してください。与えられたレンズには、光シートの厚みがスリットで逆アパーチャに入射するビームのサイズを減少させることによって増加させることができることに留意されたい。蛍光ミクロスフェアが斧を測定するために使用できることに注意してください顕微鏡のIALと横の解像度。
3. 実験を開始する前に、シリンドリカルレンズを戻す。

3℃の取り付け虫胚

以下のステップを図3に描かれている。

1. 10×20×1mmのガラススライドの一部をカットするダイヤモンドマーキングペンを使用してください。
2. 水中の5％のバクト寒天を準備し、それを沸騰し、60℃でヒーターブロックでそれを維持する
3. スライドの切断片の片面にポリ-L-リジンの50μl加え、それを乾燥させます。
4. ベンチで顕微鏡スライドを配置し、それを修正する。
5. 固定スライドとスライドの切断片を並置し、上部の溶融寒天の一滴を追加します。薄い寒天パッドを得るために、別のきれいな顕微鏡スライドを使用した寒天を絞る。
6. 寒天パッドが一番上のスライドを削除する前に乾燥することができます。
7. 約3ミリメートルOの過剰を残すために、固定スライドの側面にある寒天パッドをカットF寒天、ゆっくりと一定のスライドを削除します。
8. 寒天上のポリ-L-リジンの50μLを追加し、完全に乾燥させます。
9. 時計皿にM9培地で妊娠ワームを置く。
10. 胚を解放するために、メスと外陰部のレベルでワームをカット。
11. 両眼の下で、目的の段階で胚を識別し、マイクロキャピラリーピペットを使用してそれらを集める。
12. スライドの切断片から突出したポリ-L-リジンでコーティングされた寒天の一部に胚を置きます。ただ、次のスライドの国境に胚を置きます。彼らは十分に安定していませんので、寒天の境界に胚を配置しないでください。胚は、ポリ-L-リジン層の上に固執するように優しく、液体を除去します。
13. 素早く乾燥を避けるために、胚を合わせます。
14. プラスチックシャーレ中のカットのスライドを置き、ゆっくりとスライドをカバーするM9培地を追加します。
15. 卵がまだ寒天上に立ち往生している両眼の下に確認してください。

Cの 4。録音虫の開発

1. 試料ホルダーの前の準備（カットスライド、寒天プラス胚）を固定し、キュベット内に配置します。 図4に、自家製のホルダーを説明し、 図5は、観測コンテキストでキュベットの図を示している。
2. 圧電ステージにキュベットを修正します。
3. 明視野照明と胚の位置を特定します。
4. AOTF、カメラと圧電ステージを制御するホームメイドのソフトウェアを起動します。例えば细としてそのフリーソフトウェア、なお、使用することもできる。
5. レーザ線と電源（AOTF）を選択します。
6. シリンドリカルレンズと照明レンズを支持3方向ステージを用いて光シートの位置を調整します。最も明るい信号を得るために、横方向（X）に沿ってステージを移動します。目を取得するために、光シートのZ位置、縦位置（Y）を調整対雑音比E最良の信号。光学シート焦点の位置は、光路長差を補正するために、1つの胚から別に調整する必要があり得ることに留意されたい。
7. タイムラプス画像を取得するために、2つの画像、並びに、取得する画像の数、レーザパワーとの間の時間を得るため、露光時間を選択する。 2色取得のために、第二のレーザ線を選択します。二つのカラー画像を連続して取得される。
8. AZスタックを取得するために、また、2つのスライス間の距離、および開始と圧電の位置と終了位置を選択します。

結果

3別のCから三次元タイムラプス撮影実験エレガンス株は、上述の光シート顕微鏡セットアップを用いて得ることができるデータの種類を示す。私たちは、これらの条件下で胚はSPIMイメージングがCで唯一の低光毒性レベルを引き起こすことを示す以前の報告と一致して、通常の速度で開発し、イメージングを生き残ることを確認虫胚 ^6,7。

第1の株は、GFP（; stIs10024 zuIs178）に融合されたヒストンを表現しています。記録は37秒毎に撮影し20スライス（スライス1ミクロンとの間の距離）のスタックで2時間実施した。 図6は、異なる時点でのスタックの1つの面を示している。 interphasic核（矢印）と凝縮された有糸分裂クロマチン（矢じり）の両方がはっきりと見える。

第2の株は、GFP（ruIs57）に融合されたチューブリンおよびヒストンを表現mCherry（; stIs10226 itIs37）に融合。記録は105秒毎に採取20スライス（スライス1ミクロンとの間の距離）のスタックで16分間で実施した。7はスタックと異なる時点の異なる面を示す図 。 3つの連続する時点での関連する映画1を表示し、3D再構成。分裂の間に、紡錘体（緑色）と凝縮した染色体（赤）が開発中の細胞分裂の方向を追跡できるようにはっきりと見える。

三株は、GFPに融合したアポリポタンパク質VIT-2（pwIs23）とmCherry（ltIs44）膜結合を表現しています。記録は30秒毎に撮影し10スライス（スライス1ミクロンとの間の距離）のスタックで25分間で実施した。8はスタックと異なる時点の異なる面を示す図 。細胞内の卵黄リポタンパク質粒子（緑）の迅速な動きを簡単にすることができます続く。

図1：照明および検出ユニットは、前面および底面図で構成SPIM光学装置 。照明ユニットにおいては、ダイクロイックミラーにより合わせたレーザーはそれぞれ独立して、レーザのパワーを制御するAOTFを入力する。次いで、望遠鏡は4倍ビームの大きさを増大させ、ペリスコープは、顕微鏡の高さに持ってくる。シリンドリカルレンズは、照明対物レンズによって再集束された光のシートを形成する。検出部は、正立顕微鏡に一体化され、主に検出レンズ、フィルター、チューブレンズとEMCCDによって構成されている。試料は、照明および検出経路間の交差部に配置されている。ピエゾステージは、試料の垂直（Z）の変位を可能にする3D取得のため。

図2：このキュベットホルダーは、ホルダー3のアルミニウム板からなり、圧電ステージ上にねじ込まれている。ガラスキュベット（赤）ばねによって保持される。

図3：Cの実装プロトコルSPIM実験のための胚エレガンス 。ガラスの切断片を、ポリ-L-リジンで被覆されている。寒天のパッドがコーティングされた表面上に配置される。ポリ-L-リジン、次いで寒天パッドに添加される。最後に、C.エレガンス胚は、ポリ-L-リジンコーティングされた寒天パッド上に整列される。

図4：試料ホルダー 。ホルダーは、ガラスキュベットの内部寸法に適合します。 （赤）二つのスプリング（ 図3を参照）、スライドガラスを保持します。このホルダーをガラスキュベットの中に置かれる。

図5：観察コンテキストにおける試料ホルダ胚を図3にまとめたプロトコルに従ってスライドガラス上に固定したスライドは、図4で説明した試料ホルダに保持されている試料ホルダをガラスキュベットに挿入される、。 図2で説明したホルダに保持された。光シートは、私は水平であり、側からの胚をlluminates。検出対物レンズは試料の上に、垂直である。

図6：Cの記録ヒストンを表現する線虫胚 :: GFP融合ヒストンを発現するトランスジェニック胚の単一平面画像:: GFP融合（zuIs178; stIs10024）異なる時点での3Dタイムラプス記録から抽出した画像：20スライスで作られたスタック（。スライス1μm）との間の距離;スライス当たりの露光時間：30秒;スタック間の時間間隔：37秒;総取得時間：2時間。矢印：interphasic核、矢頭：凝縮有糸分裂クロマチン。 T = 0分で胚は2細胞期にあり、正常な発達の下に予想されるようにtの= 120分、胚は約70細胞が含まれています（胚のすべての細胞単一の平面に含まれる細胞のみが絵で表示されていることに注意していない）オシッコ。照明の電力は、（照明目的の出口で測定）488nmで30μWた。 動画をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図7：Cの記録チューブリン:: GFP融合とヒストンを表現する線虫胚:: mCherry融合℃の3Dタイムラプス記録から抽出した画像チューブリン:: GFP融合（ruIs57）とヒストン:: mCherry融合（; stIs10226 itIs37）を発現する線虫胚 。記録条件：スライス1間の20スライス（距離のスタックの取得程度）ごとに105秒;総取得時間：16分;露出時間：各チャネルごとに200ミリ秒。パネルAは 、同じスタックの10スライスを示しています。パネルBは、同じスライスごとに210秒を示しています。照明の電力はそれぞれ488と561 nmのレーザー、（照明目的の出口で測定）のために、30μW300μWた動画をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図8：Cの記録VIT-2 :: GFP融合し、膜を標的とmCherryを表現する線虫胚℃の3Dタイムラプス記録から抽出した画像虫胚 VIT-2 :: GFP融合を表現（PWIS23）、膜を標的とmCherry（ltIs44）。記録条件：10スライス（スライス1ミクロンの間の距離）ごとに30秒のスタックの取得;総取得時間：25分;チャネル当たりの露光時間：200ミリ秒。パネルAは 、同じスタックの5最初のスライスを示しています。パネルBは、同一スライスごとに30秒を示しています。 動画をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

ディスカッション

このプロトコルは、Cのin vivoイメージングのための光シート顕微鏡の簡単なセットアップについて説明します虫の胚。レーザは、ビームエキスパンダ、コリメーション及び集束レンズを含む光学シートを作成し、揃えるために必要な光学素子は、容易に光学ベンチ上に取り付けることができる。検出経路とカメラ用正立顕微鏡との組み合わせでは、これは、セットアップの簡単な解決策光シート顕微鏡を提供します。

このジオメトリは、サンプル環境が簡単になります。生体試料は、保持された位置決め及び機械部品の小さなセットによって移動されるガラスキュベット内に配置される。シート照明顕微鏡が機能を区画した広視野手法であるように、単一の軸電動移動が3D画像に必要です。これは、単一の走査要素への同期の要求を制限し、ソフトウェア開発を容易にする。 iSPIM ⁶私たちの直立幾何と比較したリューは、検出用の高NAの対物レンズを使用することができる。水平面内の対物レンズとのSPIMのセットアップに比べて、サンプルの取り付けや胚の一連の撮影が容易になります。要するに、この技術の実装が簡単であり、光学系にはほとんど専門知識を用いて達成することができる。これは、より高い速度と減少し、光毒性は低く、軸方向の分解能の欠点の利点と共焦点顕微鏡への安価な代替である。

また、Cをマウントするための簡単で再現性のある方法を開発しましたこのシステムを用いたin vivoイメージングのための線虫胚 。取付手順は高速で（15分）、日常の実験のために適している。 Cの虫イメージング 、この単純な設定の利点は、少なくとも2倍量である：TOTOイメージングにおいて （i）は回転せずに可能であるため、3D再構成が簡単です。 （ii）のサンプル実装が容易であり、複数の胚を順次撮像することができる同じスライド上。我々は細胞分裂や細胞形状の変化を観察するのに十分な時間分解能でタイムラプス映画の例を示した。 Cを勉強するシート光顕微鏡の力エレガンスの発達はまた、最近、他^6,7,8によって示されている。したがって、この技術は、C.の形態形成およびパターニングを研究するために非常に有用であろう虫胚 。

このシステムはまた、他のモデル生物の発達を分析するために使用することができますか？これは、認識することが重要であるような小さなC.及び透明生物用シート照明顕微鏡法の実装虫は、ショウジョウバエの胚のようなより大きな生物ほど厳しくなる。 ショウジョウバエのTOTO撮影では 、通常、回転、マルチビュー再構成^9、10が必要です。共線励起の対物レンズとの2側面から励起はまたattenuatによって生じる影の影響を軽減することができます光¹¹のイオン。しかし、ここで紹介する設定はまだ低い漂白および低光毒性で、 ショウジョウバエの胚の画像1の側に適合されている。このセットアップはまた、ホヤやゼブラフィッシュなどの画像小さな透明の胚にとって有用である可能性があります。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
SPIM
Detection
upright microscope	ZEISS	Axiophot 1
100x W objective (NA 1.1, W.D. 2.5mm)	NIKON
EMCCD back illuminated	ANDOR	DU-885K-CS0-#VP
Illumination
LASER 488 nm / 60 mW	TOPTICA	iBeam smart
LASER 405 nm / 120 mW	TOPTICA	iBeam smart
LASER 561 nm / 500 mW	COBOLT	JIVE 500	for time lapse imaging, 50 or 100mW is enough
filter Quad line laser rejectionband ZET 405/488/561/638	AHF	F57-405
Dichroic 405	AHF	F38-405
Dichroic 488	SEMROCK	Di01-R488
AOTF	AA	AOTFnC-400.650-TN
mirror
lens 50 mm	THORLABS		telescope 5X
lens 200 mm	THORLABS		telescope 5X
periscope	THORLABS	RS99/M
cylindrical lens f=100mm	THORLABS	ACY254-100-A
10X NA 0,3	NIKON
xyz stage	NEWPORT
Sample
Bacto Agar	Bectkton Dickinson	214010	5% in water
Poly-L-Lysine solution	Sigma	P8920
Capillaries GC100F-10, 1.0mm oD, 0,58mm ID, 100 mm L	Havard Appartus	30-0019
Aspiration tube (mouth pipette)	Dutsher	55005
M9 medium:
KH2PO4 (3g/L)	Any supplier
Na2HPO4 (6g/L)	Any supplier
NaCL (5g/L)	Any supplier
MgSO4 (1 mM final)	Any supplier
cuvette holder	HOME MADE		made by Brice Detailleur
sample holder	HOME MADE		made by Claude Moretti
x stage	NEWPORT
coverslip 50x20x1 mm	MARIENFELD		cut then in 10x20x1mm
piezo electric stage with amplifier/controller	PI	P-622.ZCD / E-625.CR
cuvette 40mmx40mmx10mm	HELLMA	704.002-OG.40 mm- 10mm high
Diamond Point Glass Marking Pencil	VWR
Software
C++ (Qt) home made software			developed by Olivier Blanc and Claire Chardès, available on request. Alternative solutions: micromanager or labview