Настройка простого Light Лист микроскоп для<em&gt; В Тото</em&gt; Визуализация<em&gt; С. Элеганс</em&gt; Разработка

Резюме

Этот протокол описывает установку светового листа микроскопом и его реализацию для в естественных изображений C. Элеганс эмбрионов.

Аннотация

Быстрые и низкие фототоксические методы визуализации являются предпосылкой для изучения развития организмов в целом. Свет лист на основе микроскопии снижает фото-отбеливание и фототоксические эффекты по сравнению с конфокальной микроскопии, обеспечивая при этом 3D изображения с субклеточной резолюции. Здесь мы представляем установку светового листа на основе микроскопа, который состоит из прямой микроскоп и небольшим набором оптико-механических элементов для генерации светового листа. Протокол описывает, как построить, совместите микроскоп и характеризуют света лист. Кроме того, подробно описывается, как реализовать метод для в целом визуализации С. Элеганс эмбрионов с использованием простого наблюдения камеры. Метод позволяет захват 3D две цветов покадровой фильмов по несколько часов развития. Это должно облегчить отслеживание формы клеток, клеточных делений и меченных белков в течение длительных периодов времени.

Введение

Формирование и формирование организма включает в себя клеточные движения, изменения формы клеток, деление клеток и дифференцировку клеток. Понимание прогрессирование и координации этих процессов требуют быстрых инструментов образа с трех измерениях возможностей и субклеточном резолюции. Среди методов с этими в естественных условиях возможности визуализации, свет лист освещение микроскопия также называют одного / селективный самолет освещение микроскопия имеет уникальное преимущество получения низких-фототоксичной эффекты и низким фотообесцвечивания ^1,2.

В листового освещения микроскопии, образец освещается со стороны световым листа, который выполняет оптического секционирования. Путь освещение и путь обнаружения перпендикулярны друг друга, и свет лист выровнен совпадает с объектной фокальной плоскости объектива обнаружения. Образец помещают на пересечении двух путей,й можно перемещать вдоль оси обнаружения, чтобы 3D визуализации. Только плоскость интерес горит и все точки этой плоскости обнаруживаются в то же время. Это значительно увеличивает скорость сбора и снижает фотообесцвечивания а также фототоксичность по сравнению с конфокальной микроскопии ^3.

Практически, лист освещение микроскопии проста в настройке и выравнивания: для двумерной визуализации, сканирования не нужно ни для части обнаружения, ни для освещения части; как метод широким полем с возможностью секционирования, трехмерных изображений может быть получено одним движением оси стадии держа образец.

Здесь мы представляем создание простого света листового микроскопа и его реализации для в целом визуализации С. Элеганс эмбрионов. С. Элеганс эмбрионов хорошо подходят, чтобы жить в естественных условиях ИмаПеренять из-за их прозрачности, инвариант происхождение и стереотипные ячейку позиционирует ^4,5. Разработанный свет установка лист на основе стандартного вертикального микроскопа для обнаружения. Протокол, представленные ниже подробно описывается, как построить и выровнять модуль / путь, испытание возбуждения и характеризуют света лист и установите образец для 3D визуализации. Он также приводит примеры покадровой фильмов, приобретенных с установкой на различных штаммов, выражающих флуоресцентных маркеров.

протокол

1. Настройка Light Лист и Путь обнаружения

Рисунок 1 дает общую схему оптического установки.

1. Поместите и исправить микроскоп и лазеры на оптическом столе.
2. Комбинат лазеры 488 нм, 561 нм и 405 нм с соответствующими дихроичных зеркал. После дихроичных зеркал, лазеры должны быть точно совмещены. Заметим, что выбор лазерных длин волн, дихроичных зеркал и оптических фильтров определяется из спектров поглощения конкретных флуоресцентных меток, используемых в экспериментах.
3. Поместите фильтр перестраиваемый акустическую-оптических (AOTF). Используйте тестовый лист, предоставленную поставщиком для регулировки частоты и мощь AOTF. Когда хорошо выровнены, около 90% мощности лазерного излучения передается при максимальной настройке как измерено PowerMeter. Обратите внимание, что некоторые лазеры могут быть полностью контролируется программным обеспечением, которые могли бы сделать AOTF ненужным.
4. Место и закрепитетелескоп. Следует отметить, что телескоп, состоящий из двух линз, которые расширяют луч шириной, равной или большей, чем диаметр задней апертуры освещения объектива. Объектив с наименьшим фокусным расстоянием должно стоять на первом.
5. Место, выровнять и зафиксировать перископ принося вверх оптический путь ближе к задней апертуре цилиндрической линзы. Обратите внимание, что два зеркала из перископ установлены таким образом, что их длинная ось лежит на наклона зеркала для того, чтобы отразить полностью расширенную луч.
6. Поместите цилиндрическую линзу рядом с перископа выхода. Следует отметить, что цилиндрическая линза фокусирует пучок в одном направлении и выходит она коллимированный в другом направлении, тем самым образуя легкую лист.
7. Перефокусируйте образованную светло-лист с помощью подсветки линзы объектива. Заметим, что образ фокусом освещения цели должны совпадать с объекта координационного центра объектива обнаружения. Направляйте лучна экране (например, стены) на большом расстоянии. Перемещение подсветки цели вдоль оси пучка света, чтобы получить на экране четкие контуры светового листа.
8. Поместите четырехъядерный линия (405/488/561/638) фильтров выбросов в соответствующие места в микроскоп (куб).
9. Поместите EMCCD камеру на выходной порт микроскопа.
10. Fix первый ручной этап перевода на столик микроскопа с помощью винтов в отверстия, просверленные в столик микроскопа. Следует отметить, что край этапе перевода должен быть расположен приблизительно в 2 см от центра столике микроскопа, так что кювета сосредоточена ниже обнаружения объектива.
11. Закрепите второй ручной этап перевода на первой. Направления два этапа должны быть перпендикулярны (X и Y) переводы.
12. Закрепите этап Z пьезоэлектрический в верхней части двух предыдущих этапов. Следует отметить, что моторизованный этап может быть использован вместо пьезоэлектрической стадии.
13. Закрепите кюветы HoldeR (рис. 2) в верхней части этапов. Кювета, таким образом, быть размещены на пересечении пути освещения и пути обнаружения, которые перпендикулярны друг другу.

2. Проверка Light Лист

1. Заполните стеклянную кювету с флуоресцентным решения, и разместить его на держатель образца на пересечении двух оптических путей. Свет лист, таким образом, видно. Он должен быть горизонтальным, и симметричный / по центру по отношению к обнаружения объектива.
2. Извлеките цилиндрическую линзу и получить изображение, чтобы измерить толщину листа света. Следует отметить, что толщина листа света зависит от числовой апертуры (NA) осветительного объектива (примерно 3-4 мкм для NA = 0,3). Обратите внимание, что для данного объектива, толщина светового листа может быть увеличена за счет уменьшения размера пучка, поступающего в заднюю апертуру с разрезом. Обратите внимание, что флуоресцентные микросферы могут быть использованы для измерения топорриала и боковой Разрешение микроскопа.
3. Установите на цилиндрическую линзу перед началом эксперимента.

3. Монтаж С. Элеганс Эмбрионы

Следующие шаги изображены на рисунке 3.

1. Используйте ручку бриллиантами маркировки отрезать кусок предметного стекла 10 х 20 х 1 мм.
2. Подготовьте 5% бактоагар в воде, варить его и поддерживать его в нагревательном блоке при 60 ° С
3. Добавить 50 мкл поли-L-лизина на одной стороне разреза части слайда, дают ей высохнуть.
4. Поставьте микроскопа на скамейке и исправить ее.
5. Juxtapose отрезанный кусок слайда с фиксированной слайда и добавить каплю расплавленного агара на самом верху. Сожмите агар с использованием другой чистый микроскопа, чтобы получить тонкий агар площадку.
6. Разрешить агар площадку высохнуть, прежде чем снимать верхнюю слайд.
7. Разрежьте агар площадку на стороне фиксированной горкой для того, чтобы оставить избыток примерно 3 мм Øе агар и удалить мягко фиксированную слайд.
8. Добавить 50 мкл поли-L-лизина на агар и дайте ему полностью высохнуть.
9. Положите беременных червей в среде М9 в часовое стекло.
10. Обрежьте червей на уровне вульвы скальпелем, чтобы освободить эмбрионов.
11. Под бинокль определить эмбрионов на стадии интерес и собирать их с помощью микрокапиллярных пипетки.
12. Поместите эмбрионов со стороны агара, покрытые поли-L-лизина, который выступает из разрезанной части слайда. Наведите эмбрионов в непосредственной близости от границы слайда. Не устанавливайте эмбрионов на границе агара, потому что они не будут достаточно стабильными. Удалить жидкость осторожно так, что эмбрионы будет прилипать на поли-L-лизина слоя.
13. Быстро выровнять эмбрионов, чтобы избежать высыхания.
14. Поместите сократить слайд в пластиковой чашке Петри и осторожно добавить среде М9, чтобы покрыть слайд.
15. Проверьте под бинокль, что яйца все еще застряли на агар.

4. Запись C. Разработка Элеганс

1. Fix предыдущую подготовку (выемка горка, агар плюс эмбрионов) в держатель образца и поместить его в кювете. Рисунок 4 описывает самодельный держатель и 5 показан вид на кювету в контексте наблюдения.
2. Fix кювету на пьезоэлектрического этапе.
3. Определить положение эмбрионов с ярким поля освещения.
4. Запустите самодельное программное обеспечение, управляющий AOTF, камеру и пьезоэлектрический этап. Обратите внимание, что бесплатное программное обеспечение, например, микроменеджер, также может быть использован.
5. Выберите лазерной линии и мощности (AOTF).
6. Отрегулируйте положение светового листа с помощью этап 3 направления поддержки цилиндрическую линзу и освещения объектив. Переместить сцену вдоль поперечного направления (X), чтобы получить самый яркий сигнал. Регулировка затем Z положение светового листа, и продольное положение (Y), чтобы получить тыс.э лучшее отношение сигнала к шуму. Следует отметить, что положение светового листа фокусе возможно, должны быть скорректированы с одного эмбриона к другому, чтобы исправить различия в легких длин путей.
7. Для приобретения покадровой изображений выберите время экспозиции, получить, время между двумя изображениями, а также о количестве изображений, которые будут приобретены, и мощности лазера. Для 2 приобретении цвета, выбрать второй лазерный луч. Две цветные изображения приобретаются последовательно.
8. Для приобретения аз стек, также выбрать расстояние между двумя ломтиками и начало и конец позиции пьезоэлектрических.

Результаты

Три 3D эксперименты покадровой записи с трех разных C. Элеганс штаммы иллюстрируют тип данных, которые можно получить при помощи светового микроскопа лист установку, описанную выше. Мы проверили, что в этих условиях эмбрионы развиваются в нормальном темпе и пережить изображений, в соответствии с более ранними сообщениями о том, что изображения SPIM вызывает только низкие уровни фототоксичности в С. Элеганс эмбрионов ^6,7.

Первый штамм выражает гистонов, слитый с GFP (zuIs178; stIs10024). Запись проводили в течение 2 часов со стеком 20 ломтиков (расстояние между кусочками 1 мкм) каждые 37 сек. 6 иллюстрирует одну плоскость стека в различные моменты времени. Оба интерфазовыми ядер (стрелка) и сгущенное митотический хроматин (стрелы) четко видны.

Второй штамм выражает тубулина, слитый с GFP (ruIs57) и гистоновслит с mCherry (itIs37; stIs10226). Запись проводилась в течение 16 мин со стеком 20 ломтиков (расстояние между слоями 1 мкм), принятым каждый 105 сек. Рисунок 7 иллюстрирует различные самолеты стека и различные моменты времени. Соответствующий фильм 1 отображает 3D реконструкции на 3 последовательных временных точках. Во время деления, митотическое веретено (зеленый) и сокращенная хромосомы (красный) отчетливо видны позволяя отслеживать деление клетки ориентаций в процессе разработки.

Третий штамм выражает аполипопротеина ВИТ-2, слитый с GFP (pwIs23) и связанный с мембраной mCherry (ltIs44). Запись проводилась в течение 25 мин со стеком 10 ломтиков (расстояние между слоями 1 мкм), принятым каждые 30 сек. Рисунок 8 иллюстрирует различные самолеты стека и различные моменты времени. Быстрые движения частиц желток липопротеинов (зеленый) в клетках может быть легкопоследовало.

Рисунок 1: SPIM оптический установки состоит из освещения и обнаружения единиц, перед и донных видов. В осветительного блока, лазеры, объединенные дихроичных зеркал введите AOTF, которая контролирует власть каждого лазера самостоятельно. Затем телескоп увеличивает размер пучка по 4 раза и перископ доводит ее до высоты микроскопом. Цилиндрическая линза образует световой лист, который переориентирована на подсветки цели. Блок детектирования встроен в вертикального микроскопа и в основном состоит из линзы обнаружения, фильтра, трубки линзы и EMCCD. Образец расположены на пересечении между освещенности и обнаружения путей. Пьезоэлектрический этап позволяет вертикальные (Z) смещения образцадля 3D приобретения.

Рисунок 2:. Держатель кюветы держатель состоит из 3 алюминиевых пластин и ввинчивается в пьезоэлектрического стадии. Стеклянная кювета проводится с помощью пружины (в красном).

Рисунок 3: Монтаж протокол С. эмбрионы Элеганс для SPIM экспериментов. Вырезать кусок стекла покрывают поли-L-лизина. Колодки агара расположена на поверхности с покрытием. Поли-L-лизин Затем добавляют на агаровой панели. Наконец, С. Elegans эмбрионы были выровнены по поли-L-лизин покрытием агар площадку.

Рисунок 4: Держатель образца. Держатель подходит к внутренним размерам стекла кюветы. Два пружины (в красном) провести предметное стекло (описанный на рисунке 3). Этот держатель Затем положить внутрь стеклянной кювете.

Рисунок 5:... Держатель образца в контексте наблюдения Эмбрионы иммобилизуют на предметное стекло в соответствии с протоколом подведены на рисунке 3 слайд удерживается держателем образца, описанного на рисунке 4 Держатель образца вставляется в стеклянную кювету, удерживается держателем, описанным на фиг.2. свет лист горизонтально и яlluminates эмбрионов со стороны. Обнаружение объектив расположен вертикально, над образцом.

Рисунок 6: Запись из С. Элеганс эмбрионов выражения гистонов :: GFP слияние одной плоскости изображения трансгенного эмбриона выражения гистонов :: GFP фьюжн (zuIs178; stIs10024) в различные моменты времени изображения, извлеченные из 3D-покадровой записи:.. стеки из 20 кусочков ( Расстояние между кусочками 1 мкм); время экспозиции за часть: 30 мс; интервал времени между стеками: 37 сек; Общее время приема: 2 часа. Стрелка: интерфазовыми ядро, стрелы: сгущенное митотический хроматин. При Т = 0 мин эмбрион на стадии 2-клеток и при Т = 120 мин эмбрион содержит около 70 клеток, как ожидалось при нормальных с развитиеммочился (обратите внимание, что только клетки, содержащиеся в одной плоскости могут видеть на фотографиях, и не все клетки эмбриона). Власть освещения было 30 мкВт при 488 нм (измеряется на выходе из освещения цели). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео.

Рисунок 7: Запись из С. Элеганс эмбрионов выражения ТУБУЛИН :: GFP слияния и гистонов :: mCherry фьюжн. изображения, извлеченные из 3D-покадровой записи о С. Элеганс эмбрионов выражения ТУБУЛИН :: GFP слияние (ruIs57) и гистона :: mCherry фьюжн (itIs37; stIs10226). Условия съемки: приобретение стопку 20 ломтиков (расстояние между ломтиками 1мкм) каждый 105 сек; общее время приобретения: 16 мин; Время экспозиции: 200 мс для каждого канала. Панель показывает 10 ломтиков одном стеке. Панель б показывает тот же слайс каждый 210 сек. Власть освещения было 30 мкВт и 300 мкВт, для 488 и 561 нм лазеров, соответственно (измеренных на выходе из освещения цели). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео.

Рисунок 8: Запись из С. Элеганс эмбрионов выражения ВИТ-2 :: GFP слияния и мембрану, ориентированные mCherry. изображения, извлеченные из 3D-покадровой записи о С. Элеганс эмбрионов выражения ВИТ-2 :: GFP слияние (ИЭСs23) и мембрану, ориентированные mCherry (ltIs44). Запись условия: приобретение стопку 10 ломтиков (расстояние между слоями 1 мкм) каждые 30 сек; общее время приобретения: 25 мин; время экспозиции на канал: 200 мс. Панель показывает первые 5 ломтиков одном стеке. Панель б показывает тот же слайс каждый 30сек. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео.

Обсуждение

Этот протокол описывает простую настройку света листового микроскопии для в естественных изображений C. Элеганс эмбрионов. Оптические элементы, необходимые для создания и выравнивания светового лист, в том числе лазеров, расширителя пучка, коллимации и фокусирующих линз, может быть легко установлен на оптической скамье. В сочетании с прямой микроскоп для пути обнаружения и камерой, это обеспечивает простое решение для установки света лист микроскопа.

Эта геометрия делает среду образец просто. Живой образец помещают в стеклянную кювету, которая проводится, расположенным и переехал небольшим набором механических частей. Как лист освещение микроскопия широкий методика поле с возможностью секционирования, только один ось моторизованный движение, необходимое для 3D изображений. Это ограничивает требование синхронизации к одному сканирующего элемента и способствует разработке программного обеспечения. По сравнению с ISPIM ⁶ прямохождение геометрическимры позволяет использовать высокое NA объектива для обнаружения. По сравнению с SPIM установок с объективов в горизонтальной плоскости монтаж образца и изображений из серии эмбрионов легче. В целом, реализация этой техники прост и может быть достигнуто с небольшим опытом работы в оптике. Это более дешевая альтернатива конфокальной микроскопов с преимуществами более высокой скорости и уменьшения фототоксичности но недостатком более низким разрешением осевой.

Мы также разработали простой и воспроизводимый способ монтирования C. эмбрионы Элеганс для естественных изображений с использованием этой системы. Процедура монтажа быстро (15 мин) и подходит для повседневной экспериментов. Для С. томография Элеганс, преимущества этой простой установки как минимум два-складки: (я) в области обработки изображений Тото можно без вращения и, следовательно, 3D-реконструкция проста; (II) образец монтаж легко и множественные эмбрионы могут быть последовательно отображенына том же слайде. Мы показали примеры покадровой фильмов с достаточной временным разрешением для наблюдения деления клеток и изменения формы клеток. Власть света листового микроскопии для изучения C. разработка Элеганс также был недавно показано другими ^{6, 7, 8.} Таким образом, этот метод будет очень полезно для изучения морфогенеза и паттерна С. Элеганс эмбрионов.

Может эта система также может быть использован для анализа развития других модельных организмов? Важно признать, что реализация листового освещения микроскопии для малого и прозрачной организма, таких как C. Элеганс является менее строгим, чем для более крупных организмов, таких как эмбрионов дрозофилы. в целом визуализации дрозофилы обычно требуется вращение и с несколькими представлениями реконструкции ^{9, 10.} Возбуждение с двух сторон с коллинеарных объективных возбуждения линз также может снижение теневые эффекты, вызванные ослабляетсяион света ^11. Тем не менее, установка, представленные здесь, все еще ​​приспособлены к одной стороне изображение эмбрионов Drosophila, с низкой отбеливания и низкой photoxicity. Эта установка также может быть полезно изображения малого и прозрачных эмбрионах, таких как асцидий или рыбок данио.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
SPIM
Detection
upright microscope	ZEISS	Axiophot 1
100x W objective (NA 1.1, W.D. 2.5mm)	NIKON
EMCCD back illuminated	ANDOR	DU-885K-CS0-#VP
Illumination
LASER 488 nm / 60 mW	TOPTICA	iBeam smart
LASER 405 nm / 120 mW	TOPTICA	iBeam smart
LASER 561 nm / 500 mW	COBOLT	JIVE 500	for time lapse imaging, 50 or 100mW is enough
filter Quad line laser rejectionband ZET 405/488/561/638	AHF	F57-405
Dichroic 405	AHF	F38-405
Dichroic 488	SEMROCK	Di01-R488
AOTF	AA	AOTFnC-400.650-TN
mirror
lens 50 mm	THORLABS		telescope 5X
lens 200 mm	THORLABS		telescope 5X
periscope	THORLABS	RS99/M
cylindrical lens f=100mm	THORLABS	ACY254-100-A
10X NA 0,3	NIKON
xyz stage	NEWPORT
Sample
Bacto Agar	Bectkton Dickinson	214010	5% in water
Poly-L-Lysine solution	Sigma	P8920
Capillaries GC100F-10, 1.0mm oD, 0,58mm ID, 100 mm L	Havard Appartus	30-0019
Aspiration tube (mouth pipette)	Dutsher	55005
M9 medium:
KH2PO4 (3g/L)	Any supplier
Na2HPO4 (6g/L)	Any supplier
NaCL (5g/L)	Any supplier
MgSO4 (1 mM final)	Any supplier
cuvette holder	HOME MADE		made by Brice Detailleur
sample holder	HOME MADE		made by Claude Moretti
x stage	NEWPORT
coverslip 50x20x1 mm	MARIENFELD		cut then in 10x20x1mm
piezo electric stage with amplifier/controller	PI	P-622.ZCD / E-625.CR
cuvette 40mmx40mmx10mm	HELLMA	704.002-OG.40 mm- 10mm high
Diamond Point Glass Marking Pencil	VWR
Software
C++ (Qt) home made software			developed by Olivier Blanc and Claire Chardès, available on request. Alternative solutions: micromanager or labview