ルシフェラーゼを発現する組換えウイルスの高スループット滴定

要約

This article presents a high-throughput luciferase expression-based method of titrating various RNA and DNA viruses using automated and manual liquid handlers.

要約

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with viruses that do not form plaques. As an alternative to plaque assays, we have developed a high-throughput titration method that allows for the simultaneous titration of a high volume of samples in a single day. This approach involves infection of the samples with a Firefly luciferase tagged virus, transfer of the infected samples onto an appropriate permissive cell line, subsequent addition of luciferin, reading of plates in order to obtain luminescence readings, and finally the conversion from luminescence to viral titers. The assessment of cytotoxicity using a metabolic viability dye can be easily incorporated in the workflow in parallel and provide valuable information in the context of a drug screen. This technique provides a reliable, high-throughput method to determine viral titers as an alternative to a standard plaque assay.

概要

Classical viral plaque assays continue to be a mainstay in virus research even though they can be notoriously time-consuming and constitute a significant bottleneck to obtaining results from experiments. More rapid indirect virus quantification methods have emerged including quantitative polymerase chain reaction (qPCR), ELISA, and flow cytometry^1-4. Recent innovations such as the Virocyt virus counter can directly count viruses using advanced flow sorting technology and through a combination of protein and DNA/RNA dyes⁵. While all of these methods have undoubtedly quickened the pace of virus research, each method has its advantages and drawbacks. For example, qPCR can allow for quantification of specific viral genome sequence but cannot effectively discriminate infectious from defective virions⁶. ELISAs can be very specific however require a suitable antibody against the desired target viral protein and can be very expensive. While flow cytometry technology offers many advantages and has improved significantly, throughput and accessibility to highly specialized equipment nonetheless remains a hurdle. Importantly, all of these techniques are not ideally suited for high-throughput screening, for which the ease and time requirement of the virus quantification step is of critical importance.

Here we describe a high-throughput and easily automatable technique to titer viruses that express a Firefly luciferase (Fluc) transgene. This method generates approximate viral titers in a test sample based on luminescence signal reads through the parallel use of a standard curve of known amounts of virus. Samples containing unknown quantities of luciferase-expressing virus are transferred on to a permissive “plaquing” cell line in parallel with the standard virus dilution curve and virus-associated luminescence is read after a few hours incubation time. This allows for rapid, quantitative, often same-day generation of results, unlike classic plaque assay protocols which typically require several days of incubation in order to manually count visible plaques^7-9.

The protocol outlines the steps of our titration method using oncolytic Vesicular Stomatitis Virus encoding a Fluc transgene (VSV∆51-Fluc) as an example and provides an overview of 1. Sample preparation 2. The plating of a permissive cell line for virus titration using an automated dispenser 3. The preparation of the viral standard curve 4. The transfer of the sample supernatants onto the permissive cell line using a 96-well manual pipettor 5. The assessment of sample cytotoxicity using a cell viability reagent 6. The preparation of the luciferin substrate 7. Reading of bioluminescence and 8. Data analysis.

プロトコル

1試料の調製

1. 96ウェルプレートに滴定し、転送のためのルシフェラーゼを発現するウイルス（例としてここにVSVΔ51-Flucを）を含むサンプルを得る。あるいは、直接に96 - ウェル組織培養プレートおよび使用上清中の感染を行う。
2. 標準曲線を含めるために、未処理の2つの列を残します。 96ウェルプレート中で直接行われた実験のために、後日、-80℃及び力価における実験（40時間後に感染症）またはストアの終わりに力価。

ウイルス力価測定のための許容細胞の調製

1. 滴定前の24時間は、2.5×10 ^5〜10％ウシ胎児血清（FBS）、30mMのHEPESを含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中の細胞/ mlおよび1％ペニシリン/の濃度でVero細胞の懸濁液を調製ストレプトマイシン。注：このプロトコルは、Vero細胞を用いたが、VSV感染のための任意の適切な許容細胞系は、bの可能性eが使用。
2. マイクロプレートディスペンサーを用いて、96ウェル白色固体平底プレートに2.5×10 ^4個の細胞（100μl）をシード。
   1. プライミングのためにプレートあたりの細胞懸濁液12ミリリットルを加えた5ミリリットルを用意します。
   2. 滅菌水50mlでチューブをフラッシュすることでクリーンマイクロプレートディスペンサーカセット。
   3. 細胞懸濁液をマイクロディスペンサ線を記入し、細胞懸濁液5mlを介して流す。
   4. 白壁の96ウェルプレートの各ウェルに100μLを分注するプログラムを選択します。分注、および追加のプレートについて、必要に応じて繰り返します。不透明な底の白壁プレートは細胞の健康と密度の検証に使用されている場合にも96ウェル透明平底プレートにいくつかのウェルをシード。
   5. 元の容器に終了し、フラッシュセル。チューブを通して暖かいの滅菌水50ml、続いて70％エタノール50ミリリットルを実行して、カセットを清掃してください。
   6. カセットとチューブは、pであることを確認してくださいpropriately使用の間に掃除した。
3. 加湿した5％CO ₂インキュベーター中で37℃で24時間細胞をインキュベートします。

ウイルス標準曲線の調製

1. 10 ⁸ pfu / mlで、10 ⁷ pfu / mlでの、：無血清DMEM中でVSVΔ51-Fluc細胞の標準曲線を作成など、次のようにベロ細胞上への転写後に、1ml当たりのプラーク形成単位（pfu）の最終濃度になる10 ⁶ pfu / mlで、10 ⁵ pfu / mlで、10 ⁴ pfu / mlで、10 ³ pfu / mlで、10 ² pfu / mlで、および10 ¹ pfu / mlで。 Vero細胞のプレートあたり各濃度の50μlを加えた余分な10％を準備します。
   注：ルシフェラーゼウイルスストックの力価は、絶対定量を可能にする標準曲線を生成するために、古典的な方法¹⁰で評価する必要があります。さもなければ相対定量は、任意に基づいて、ウイルス力価を設定することにより、正確な力価情報なしで達成することができる希釈工程上。例えば、標準曲線の最初の希釈は、のように、10 ^{7、10 8}ウイルス性単位及び以下の10分の1の希釈に設定してもよい。絶対的定量は正確ではないので、この文脈では、一方が予め定められたサンプルと比較した倍数変化として値を表すべきである。

許容細胞へのサンプルの上清の4譲渡

1. 単層が少なくとも95％コンフルエントであることを確認する光学顕微鏡下で透明底の96ウェルプレートに播いたベロ細胞を確認する。
2. 白壁プレートに播種し、Vero細胞上にサンプル上清25μlを転送します。標準曲線のために指定2列に上清を転送しないでください。注：これは96チャンネルの液体ハンドラーを使用して、単一のプレート上の全てのウェルについて同時に行うことができる。
3. 8または12チャンネルマルチチャンネルピペッターを使用して、中のVero細胞に、ステップ3で作成した標準曲線の各希釈液25μlを追加2指定された列。
4. RTで430×gで5分間遠心プレート。
5. 加湿した5％CO ₂インキュベーター中、37℃で5時間インキュベートする。

細胞生存の5評価

1. 注：透明な96ウェルプレートで行っ感染実験から得られた上清から開始する場合、サンプルの生存率は、レサズリンとして細胞生存率指標色素で定量する前に評価することができる。
2. ウイルスおよび細胞を含有する試料の96ウェルプレートの各ウェル中の体積の10％に等しい量のレザズリン加える。セルは専用それぞれ、100％および0％の生存率の値を決定するために、メディアのみの対照と同様に制御して組み込みます。
3. 2-4時間（細胞の種類および色素の商業的に入手可能であるか、または再構成された粉末の濃度に依存して変化するインキュベーション時間）の後、読み取り、蛍光プレートリーダー（530〜560nm励起、590発光）を用いて信号を記録する。レポートセルviabili×100％式相対代謝活性=（ - - ネガティブコントロール信号）/（細胞のみ信号を制御する負の制御信号）を（試験サンプル信号）による試料のためのティ

ルシフェリン基質の6。準備

1. 30分で5時間のインキュベーションの終了前に、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中で2 mg / mlの溶液を得たルシフェリンを準備。プレート当たり2.5ミリリットルを加え、余分な2ミリリットルを準備します。光からソリューションを保護します。 NOTE：ルシフェリンはまた、以前の日に調製し、使用するまで4℃で保存することができる。

7。読書生物発光

1. 5時間のインキュベーション期間の後、白色固体プレート中のVero細胞の各ウェルに、25μlのルシフェリンを加える。手動で、またはルミノメーターに統合自動化されたディスペンサーでルシフェリンを追加します。注：単一およびエンドポイントを持つ機器の使用は、ルシフェラーゼ互換溶解BUFの添加を必要とすることが読み取るFERの一貫性を改善するためにルシフェリン基質を添加する前に。
2. 次のパラメータを使用してプレートをお読みください。
   1. 5秒間振る。
   2. 30秒待ちます。
   3. 適切な固定感度/露出値での発光をお読みください。オプションは、機器上で利用可能である場合には、マルチポイントの精度を向上させるために（ 例えば、3×3の行列）を読み取る使用しています。
3. 定量化された生物発光強度を記録し、保存します。
4. 自動化されたディスペンサーは、ルシフェリンを追加するために使用された場合は、ルシフェリン、プライム暖かい滅菌水でラインをパージする。

8。データ解析

1. 正確な結果を得るために、標準曲線のヒルの方程式を生成するために、非線形回帰を解く。ウイルスの発現ユニットを算出するために力価測定サンプルにこの式を適用します。一部のウイルスや状況は、直線的な関係を持つ標準曲線を生成することができる。この場合の一次方程式を解く。

結果

ハイスループット方法を説明するワークフローの概要を図1に示されている。 図2は、典型的な標準曲線ofVSVΔ51-Fluc細胞の結果を示す。 4パラメータの非線形回帰分析は、未知の入力pfuの（ウイルス力価の推定値）を補間することが可能なヒルプロットを生成した。これらの推定された力価は、ウイルス発現ユニット（VEU）と呼ばれる。 図3Aは VEUsおよび同一サンプル^10を標準的なプラークアッセイを行うことによって得られた力価を示す。サンプルは、さまざまな化学物質が786-0細胞でVSVΔ51-Flucをの複製および拡散を強化するために使用された実験に由来する。標準曲線から補間VEUsは、Vero細胞（この場合には、希釈係数が5である）に転写されたサンプルの上清の希釈に基づく係数を乗算しなければならない。力価とVEUの間の線形相関関係を図3Bに示されている 0.8083のR ²及び0.899のピアソンのrのスコア（P <0.0001）で。 図4では、代謝アッセイから得られた典型的な細胞傷害性データは、前VSVΔ51-Flucを持つ感染に対する化学物質で処理786-0細胞について示されている。最後に、 図5は、各種のウイルス（単純ヘルペスウイルス（HSV）、ワクシニアウイルス、およびアデノ随伴ウイルス（AAV）、すべてを発現するホタルルシフェラーゼ）で得られた典型的な標準曲線を示し、必要に応じて、インキュベーション時間および凍結融解のサイクルを記述する。

VSVΔ51-Flucをを使用したハイスループットのウイルス力価測定および細胞毒性アッセイの図1のワークフロー。 （A）は、ウェル当たり2.5×10 ⁴ Vero細胞（100μl）をシードし、37℃でインキュベートする。（B）24時間後に転送Vero細胞（プレートあたり2列）に標準曲線を25μl。（C）転送残りVero細胞上に力価を測定するサンプルの25μlの。遠心プレートし、37℃でインキュベートする。（D）ウェル内の体積の10％に相当する量では、元のサンプルを含むプレートにレサズリン試薬を追加します。 3時間後、37℃。（E）で培養する、読み、記録蛍光および細胞毒性を評価。（F）5時間後、Vero細胞の各ウェルにルシフェリンの2 mg / mlの溶液25μlを加える。発光を読み、ウイルス発現単位を計算します。

図2は、VSVΔ51-Flucを標準曲線を期待。ルシフェラーゼ発現は、私だったasuredルミノメーターおよび生物発光を使用してウェル内の五つの異なる点での5時間後に上清転送は、平均相対光単位（RLU）で表した。 RLUは、既知の入力のpfu / mlの非線形回帰を解決し、Hill式を生成するためのに対してプロットした意味する。 2反復曲線と標準エラーバーの平均（R ² = 0.9993）が示されている。

ハイスループット法で得られたものと標準的なプラークアッセイ力価の図3の比較。 （A）VEU / mlの間のpfu / mlの高スループットのルシフェラーゼアッセイを用いて力価測定し、同じサンプルから計算されたウイルス力価（VEU / ml）を比較したVero細胞に、標準的なプラークアッセイによって得られる。（B）の線形関係におけるウイルス力価力価は、標準のpを介して得られるラッカーのアッセイ。線形回帰曲線と判断（R ^2）の係数が示されている。

Vero細胞上の前上清転送に図4のサンプルの生存率。サンプルの生存率は、市販のレサズリン溶液を用いて細胞の代謝活性を評価することにより決定した。生の蛍光値は、未処理の、非感染ウェルのそれに対して標準化した。

図5は、HSV、ワク、およびAAVウイルスの標準曲線を期待。ルシフェラーゼ発現がうまくルミノメーターを用いて内5異なる点で測定し、生物発光は、平均のRelAにおいて発現させた電性光単位（RLU）。（A）HSV標準曲線は、Vero細胞上に添加した17時間後のsupernantant転送（R ²で作成しましたウェル（100μL）およびルシフェラーゼ測定当たり2.5×10 ⁴細胞の密度で24時間以前のメッキ= 0.9489、n = 1である）。ヒルの方程式は、非線形回帰を解くことによって生成された。Vero細胞を24時間早くウェル当たり2.5×10 ⁴細胞（100μlの）の密度をプレーティングし、37℃で2.5時間インキュベート上に（B）ワクシニア標準曲線を添加したルシフェラーゼ測定が行われた後にC（R ² = 0.9892）。線形方程式は、線形回帰を解くことによって生成された。（C）AAV標準曲線は、ヒト肺癌細胞（A549）に添加したウェル（100μl）を、ルシフェラーゼ測定当たり2.5×10 ⁴細胞の密度で24時間以前のメッキ24時間後に感染しました。ヒルの式は、非線形回帰を解くことによって生成した。平均5複製曲線と標準エラーバーの（R ² = 0.9926）を示している。

ディスカッション

ここで説明するルシフェラーゼベースのアプローチは、その使いやすさ、素早さ、最小限の機器の必要性、および比較的低コストなど、他の既存の方法に比べて多くの利点を提供する。これに対する主要な貢献者は、シリアル希釈工程の回避である。それにもかかわらず、このプロトコルの連続希釈系誘導体は確かに実現可能であり、最近では、高スループットの抗ウイルススクリーン¹¹におけるルシフェラーゼ発現エボラウイルス力価を評価した。本質的に時間がかかり、より高価ながら、必要に応じて、このような適応は、ウイルスの定量化のために大きなダイナミックレンジを提供することができる。ハイスループットスクリーニングの文脈においてウイルス力価を評価するために特によく適していることに加えて、私たちのワンステップルシフェラーゼベースのウイルスの定量法は、ウイルスを複製する場合には、感染性ビリオンの正確な推定値を生成する。さらに、同じ実験から、細胞毒性データとともに発光の読み出しは、よりを与える標的細胞に対する実験条件の影響の全体像は、腫瘍溶解性ウイルスおよび薬物スクリーニングの文脈において特に有用である。

ここに示した例では、複製する負の単鎖RNAウイルスを使用しています。しかしながら、このプロトコルは、いくつかのマイナーなプロトコルの調整にウイルスを複製および非複製の数に適合させることができる。これは、ワクシニア、HSV、およびAAV（ 図5参照）のようなDNAウイルスを含む。例えば、そのようなワクシニアウイルスのような細胞内のウイルスに感染したサンプルは、前の定量化へのウイルスの放出工程（ 例えば 、少なくとも1つの凍結-解凍サイクル）を必要とする。他のウイルスにこの手法を適用する場合、それはルミノメーターによりプレートの読み取りにウイルス上清または溶解物から転送インキュベーション時間を最適化する必要がある。このパラメータは、許容細胞系およびpの強度におけるウイルスの複製サイクルに主に依存するromoterルシフェラーゼ発現を駆動する。これは、最良の最適化ステップで完全な標準曲線を使用して行われる。これを行うためには、準備された標準曲線のさまざまな複製物との適切な許容細胞系に感染し、それぞれが異なる時点転写後に複製する読まなければなりません。理想的には、インキュベーション時点は期待サンプル力価範囲にわたるLOG（RLU）とLOG（力価）との間の線形関係をもたらすが選択される。 VSVΔ51-Fluc細胞の場合、これは典型的には10 ⁴ PFU / mlの10 ⁷ PFU / mlの5時間のインキュベーション時間。より低い又はより高い力価は試料から予想される場合、人は単に、それぞれ、インキュベーション時間を増大または減少させることができる。あるいは、サンプルは、ELISAのために典型的に行われる限り範囲内に入るように希釈することができる。

上述したように、この方法は、ステップのほとんどは自動化することができるように、薬物ライブラリーを用いてハイスループット薬物スクリーニングを行うのに適している。細胞は、電子をメッキすることができるfficiently自動マイクロディスペンサーを用いて、薬剤ライブラリは、96チャンネルの液体ハンドラーを使用して追加することができ、ウイルスは、マイクロプレートディスペンサーを使用して追加することができ、プレートを自動化された照度計を用いて読み取る。理論的には、これはまた、384ウェルまたは小さなフォーマットに適合させることができる。しかし、このための制限は、メッキすることができるセルの数、与えられた少数の細胞が（力価）の関係を記録するためにLOG（RLU）の直線で狭い範囲につながるです。最後に、レサズリンまたは他の代謝色素を用いて細胞生存率の評価は容易に抗ウイルススクリーンまたはウイルス¹²との組み合わせで相乗的殺傷をもたらす化合物の同定における細胞毒性化合物の識別を可能にする、ワークフローに組み込むことができる。それにもかかわらず、この方法の限界は常に可能なわけではないルシフェラーゼ導入遺伝子を発現するウイルスの要件、および十分に寛容な細胞株の利用可能性を含む。しかし、適応することが可能性が高い他のレポーター遺伝子と共に使用するための方法（ 例えば 、GFP）をレポーターの定量方法は、信号対雑音比に適した線形性及び信号を有することを条件とする。全体的に、説明した高スループット方法は、多くの異なるウイルスに合わせて変更し、多様な用途に合わせて調整することができる。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbeccos' Modified Eagle's Medium (DMEM)	Corning	SH30243.01
Fetal bovine serum	NorthBio Inc.	NBSF-701
Phosphate buffered saline	Corning	21-040-CV
HEPES	Fisher Scientific	BP310-1	Prepare a 1 mM solution, pH 7.3
alamarBlue	AbD Serotec	BUF012B
D-Luciferin potassium salt	Biotium	10101-2
96-well solid white flat bottom polystyrene TC-treated microplates	Corning	3917	384-well plates can also be used for higher throughput
Synergy Mx	BioTek	SMTBL	Monochromator microplate reader
Liquidator96	Mettler Toledo	LIQ-96-200	96 tip manual pipetting system
Liquidator96 LTS Tips sterilized with filters	Mettler Toledo	LQR-200F	Any sterile filtered tips compatible with pipettors of choice are appropriate
Microflo	BioTek	111-206-21	Used to plate cells in a 96-well plate
Fluoroskan Ascent FL	Thermo Scientific	5210450	Microplate fluorometer