Высокая пропускная Титрование люциферазы экспрессирующих рекомбинантные вирусы

Резюме

This article presents a high-throughput luciferase expression-based method of titrating various RNA and DNA viruses using automated and manual liquid handlers.

Аннотация

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with viruses that do not form plaques. As an alternative to plaque assays, we have developed a high-throughput titration method that allows for the simultaneous titration of a high volume of samples in a single day. This approach involves infection of the samples with a Firefly luciferase tagged virus, transfer of the infected samples onto an appropriate permissive cell line, subsequent addition of luciferin, reading of plates in order to obtain luminescence readings, and finally the conversion from luminescence to viral titers. The assessment of cytotoxicity using a metabolic viability dye can be easily incorporated in the workflow in parallel and provide valuable information in the context of a drug screen. This technique provides a reliable, high-throughput method to determine viral titers as an alternative to a standard plaque assay.

Введение

Classical viral plaque assays continue to be a mainstay in virus research even though they can be notoriously time-consuming and constitute a significant bottleneck to obtaining results from experiments. More rapid indirect virus quantification methods have emerged including quantitative polymerase chain reaction (qPCR), ELISA, and flow cytometry^1-4. Recent innovations such as the Virocyt virus counter can directly count viruses using advanced flow sorting technology and through a combination of protein and DNA/RNA dyes⁵. While all of these methods have undoubtedly quickened the pace of virus research, each method has its advantages and drawbacks. For example, qPCR can allow for quantification of specific viral genome sequence but cannot effectively discriminate infectious from defective virions⁶. ELISAs can be very specific however require a suitable antibody against the desired target viral protein and can be very expensive. While flow cytometry technology offers many advantages and has improved significantly, throughput and accessibility to highly specialized equipment nonetheless remains a hurdle. Importantly, all of these techniques are not ideally suited for high-throughput screening, for which the ease and time requirement of the virus quantification step is of critical importance.

Here we describe a high-throughput and easily automatable technique to titer viruses that express a Firefly luciferase (Fluc) transgene. This method generates approximate viral titers in a test sample based on luminescence signal reads through the parallel use of a standard curve of known amounts of virus. Samples containing unknown quantities of luciferase-expressing virus are transferred on to a permissive “plaquing” cell line in parallel with the standard virus dilution curve and virus-associated luminescence is read after a few hours incubation time. This allows for rapid, quantitative, often same-day generation of results, unlike classic plaque assay protocols which typically require several days of incubation in order to manually count visible plaques^7-9.

The protocol outlines the steps of our titration method using oncolytic Vesicular Stomatitis Virus encoding a Fluc transgene (VSV∆51-Fluc) as an example and provides an overview of 1. Sample preparation 2. The plating of a permissive cell line for virus titration using an automated dispenser 3. The preparation of the viral standard curve 4. The transfer of the sample supernatants onto the permissive cell line using a 96-well manual pipettor 5. The assessment of sample cytotoxicity using a cell viability reagent 6. The preparation of the luciferin substrate 7. Reading of bioluminescence and 8. Data analysis.

протокол

1 Подготовка образцов

1. Получение образцов, содержащих люциферазы, экспрессирующих вирус (в данном VSVΔ51-Fluc в качестве примера) для титрования и передачи в 96-луночных планшетах. С другой стороны, выполнение инфекции в 96-луночных планшетах для культуры ткани и использования супернатантов непосредственно.
2. Оставьте два столбца необработанные для включения стандартных кривых. Для экспериментов сделано непосредственно на 96-луночных планшетах, титр в конце эксперимента (40 ч после инфицирования) или хранить при температуре -80 ° С и титр на более позднем этапе.

2 Получение разрешительных клеток для титрования вируса

1. 24 ч перед титрованием, приготовить суспензию Vero клеток при концентрации 2,5 × 10 ⁵ клеток / мл в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 30 мМ HEPES и 1% пенициллина / стрептомицин. ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, этот протокол использует клетки Веро, любой подходящий разрешительный клеточной линией для VSV инфекции могла бе используется.
2. Семенной 2,5 × 10 ⁴ клеток (100 мкл) в 96-луночных белого твердого вещества плоскодонных планшетах с использованием микропланшет-дозатор.
   1. Подготовьте 12 мл клеточной суспензии на чашку плюс 5 мл для грунтования.
   2. Чистый Диспенсер для микропланшет кассеты с помощью промывки трубки 50 мл стерильной воды.
   3. Заполните Диспенсер для микропланшет линии с клеточной суспензии и пусть 5 мл клеточной суспензии течь через.
   4. Выбор программы, которые будут Распределить 100 мкл в каждую лунку 96-луночного планшета белого стенками. Разливают, и в случае необходимости повторить для дополнительных пластин. Кроме семян несколько скважин в 96-луночный прозрачной плоской нижней плите, если непрозрачные белые-нижней стенками плиты используются для проверки здоровья клеток и плотности.
   5. По завершении операции промойте клетки обратно в оригинальной упаковке. Очистить кассету, выполнив 50 мл 70% этанола с последующим добавлением 50 мл теплой стерильной воды через трубопровод.
   6. Убедитесь кассеты и труб апpropriately чистить между использованием.
3. Инкубируйте клетки в течение 24 ч при 37 ° С в увлажненной 5% СО ₂ инкубатора.

3 Получение вирусных калибровочной кривой

1. Приготовьте стандартную кривую VSVΔ51-Fluc в бессывороточной DMEM таким образом, что конечная концентрация бляшкообразующих единиц (БОЕ) на мл, после передачи на Vero клетках следующим образом: 10 ⁸ БОЕ / мл, 10 ⁷ PFU / мл, 10 ⁶ БОЕ / мл, 10 ⁵ БОЕ / мл, 10 ⁴ БОЕ / мл, 10 ³ БОЕ / мл, 10 ² БОЕ / мл, и 10 ¹ БОЕ / мл. Подготовка 50 мкл каждой концентрации на тарелку клетках Веро плюс дополнительные 10%.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Титр вируса складе люциферазы нужно будет оцениваться в классическом пути ¹⁰ в целях получения стандартной кривой, которая позволит для абсолютного количественного. В противном случае относительное количественное может быть достигнуто без точной информации титра произвольно установки титра вируса на основена стадиях растворения. Например, первый разбавление стандартной кривой может быть установлено равным 10 ⁸ вирусных частей и следующей 1/10 разбавления до 10 ⁷ и так далее. В этом контексте следует выразить значения, сгиба-изменения по сравнению с заранее определенной выборке абсолютного количественного будет не очень точной.

4 Передача образцов супернатантах на разрешительных клеток

1. Проверка Vero клетки высевали в четко нижней 96-луночного планшета под световым микроскопом, чтобы подтвердить, что монослои, по крайней мере, 95% сливной.
2. Трансфер 25 мкл образца супернатанта на клетках Веро, посеянных в белых стенками пластин. Не передать супернатантами в 2 колонки, предназначенные для стандартных кривых. Примечание: Это может быть сделано одновременно для всех скважин на одной пластине с помощью обработчика жидкости 96-канала.
3. Использование 8 или 12-канального пипеттора многоканальный, добавить 25 мкл из каждого разведения стандартной кривой, полученной на стадии 3 в клетках Vero вв 2 назначенные столбцы.
4. Центрифуга пластины в течение 5 мин при 430 х г при комнатной температуре.
5. Выдержите в течение 5 часов при 37 ° С в увлажненной 5% CO ₂ инкубаторе.

5 Оценка Жизнеспособность клеток

1. Примечание: При запуске из супернатантов, полученных от инфекции экспериментов, проведенных в прозрачных 96-луночных планшетах, жизнеспособность образец может быть оценена до количественной с индикаторным красителем жизнеспособности клеток, таких как резазурин.
2. Добавить резазурина в количестве, равном 10% от объема в каждую лунку 96-луночного планшета образцов, содержащих вирус и клетки. Включите клеток только контролирует, а также средств массовой информации только контроля, чтобы определить значения для 100% и 0% жизнеспособность соответственно.
3. После 2-4 ч (время инкубации будет варьироваться в зависимости от типа клеток и от концентрации коммерчески доступны, либо восстановленного порошка красителя), считывать и записывать сигнал с использованием флуоресцентного планшет-ридера (530-560 возбуждения, 590) излучения. Viabili Сообщить клетокти для образца по формуле Относительная метаболической активности = ((Опытный образец сигнала - отрицательный контроль сигнала) / (сотовый только сигнал управления - отрицательный сигнал управления)) х 100%

6 Подготовка субстрата люциферин

1. За 30 мин до конца 5 ч инкубации подготовить люциферин, чтобы получить раствор 2 мг / мл в стерильном фосфатно-буферном солевом растворе (PBS). Подготовьте 2,5 мл на чашку плюс дополнительные 2 мл. Защитите решение от света. Примечание: люциферин могут быть также получены ранее в день и хранили при 4 ° С до использования.

7 Чтение Биолюминесценция

1. После 5 ч инкубации, добавление 25 мкл люциферин в каждую лунку в клетках Веро белых твердых пластин. Добавить люциферин вручную или с помощью автоматизированной дозатора, встроенного в фотометр. ПРИМЕЧАНИЕ: Использование инструмента только одной и конечной точки читает может потребовать включения люциферазы совместимый лизиса BUFFER перед добавлением субстрата люциферин, чтобы улучшить консистенцию.
2. Читайте тарелки со следующими параметрами:
   1. Встряхнуть в течение 5 сек.
   2. Подождите 30 сек.
   3. Читайте свечение на соответствующем стоимости основных чувствительность / экспозиции. Если опция доступна на инструменте, используйте многоточечный читает (например, 3 х 3 матрицы) для повышения точности.
3. Запись и сохранить количественно интенсивности биолюминесценции.
4. Если автоматизированная дозатор был использован для добавления люциферина очистить люциферин и залейте линий с теплой стерильной водой.

Анализ 8. данных

1. Для получения точных результатов, решить нелинейной регрессии для генерации уравнение Hill от стандартных кривых. Применить это уравнение к оттитрованы образцов для расчета вирусные экспрессионные единицы. Некоторые вирусы или ситуации может привести к стандартной кривой с линейной зависимостью; В этом случае решение для линейного уравнения.

Результаты

Краткая информация о рабочем процессе, описывающей метод высокой пропускной показано на рисунке 1. Рисунок 2 показывает результаты типичного стандартной кривой ofVSVΔ51-Fluc. Четыре-параметр нелинейный регрессионный анализ генерируется сюжет Hill, из которого неизвестно вход бое (оценка титра вируса) может быть интерполированную. Такие ожидаемые титры называют вирусные экспрессионные единицы (ВЭУ). Фиг.3А показывает VEUs и титры получены путем выполнения стандартного бляшек с одних и тех же образцов ^10. Образцы возник из эксперимента, где различные химические вещества, используемого для повышения репликации и распространения VSVΔ51-Fluc в 786-0 клеток. VEUs интерполяцией по калибровочной кривой необходимо умножить на коэффициент, который основан на разведении образца супернатантами передаются на клетках Веро (в данном случае, фактор разбавления 5). Линейная корреляция между титрами и ВЭУ показана на рисунке 3B С R ² из 0,8083 и р балле Пирсона 0,899 (р <0,0001). На рисунке 4, типичные данные цитотоксичности клеток, полученных из метаболического теста показан на 786-0 клетках, обработанных химикатами до заражения VSVΔ51-Fluc. Наконец, 5 показаны типичные стандартные кривые, полученные с различных вирусов (простого герпеса (HSV), вирус коровьей оспы, и аденоассоциированные Вирус (AAV), все выражения люциферазы светляков) и описывает время инкубации и циклов замораживания-оттаивания, по мере необходимости.

Рис.1 Технологическая схема высокой пропускной вируса титрованием и цитотоксичности с использованием VSV Δ 51-Fluc. (A) Seed 2,5 × 10 ⁴ Vero клеток на лунку (100 мкл) и инкубировали при 37 ° С. (В) 24час спустя передача 25 мкл стандартной кривой на клетках Веро (2 колонки на чашку). (C) Передача 25 мкл образцов для оттитрованы на оставшихся клетках Веро. Центрифуга пластины и инкубировать при температуре 37 ° С. (D) в количестве, равном 10% от объема в скважине, добавить резазурин реагента к пластине, содержащей оригинальные образцы. Планшеты инкубируют при 37 ° С. (E) После 3 ч, чтения и записи флуоресценции и оценки цитотоксичности. (F) После 5 часов, добавляют 25 мкл 2 мг / мл раствора люциферин в каждую лунку клетках Веро. Читайте свечение и рассчитать Вирусные Единицы экспрессии.

Рисунок 2 Ожидаемый стандартную кривую VSV Δ 51-Fluc. Люциферазы выражение было меняasured 5 часов передачу сообщение супернатантную в пяти различных точках в скважине с помощью фотометра и была выражена биолюминесценции в средних относительных световых единиц (RLU). Средний RLU был заговор против известного вход бое / мл решить нелинейной регрессии и генерировать уравнения Хилла. Средняя из двух кривых повторных и стандартных баров ошибках показаны (R ² = 0,9993).

Рисунок 3 Сравнение стандартных бляшек титров с результатами, полученными методом высокой пропускной способностью. (А) Вирусные титры в БОЕ / мл получен стандартным методом бляшек на клетках Веро сравнивали с рассчитанными вирусных титров (ВЭУ / мл) из одних и тех же образцов титровали с использованием высокой пропускной люциферазы. (B) линейная зависимость между VEU / мл и титр получены через стандартный рЛак для анализа. Линейный кривая регрессии и коэффициент детерминации (R ²⁾ показаны.

Рисунок 4 Пример жизнеспособности. Пример жизнеспособность до передачи супернатант на Vero клетках была определена путем оценки клеточную метаболическую активность с использованием коммерчески доступного резазурин решение. Сырье значения флуоресценции были нормализованы к тому, что из необработанных, неинфицированных скважин.

Рисунок 5 Ожидаемое стандартные кривые с ВПГ, коровью и AAV вирусов. Люциферазы выражение измеряли при пяти различных точках в скважине с помощью фотометра и была выражена биолюминесценции в средних отнотивные световые единицы (RLU). (А) стандартная кривая ВПГ был добавлен на клетках Веро покрытием 24 ч раньше, при плотности 2,5 × 10 ⁴ клеток на лунку (100 мкл) и измерения люциферазы был сделан 17 ч после supernantant передачи ^(R2 = 0,9489, п = 1). Уравнение Хилла был создан на основе решения нелинейной регрессии. Стандартная кривая (B) Vaccinia был добавлен на клетках Веро покрытием 24 часа раньше плотность 2,5 х 10 ⁴ клеток на лунку (100 мкл) и выдерживают в течение 2,5 ч при 37 ° С, после чего измерения были сделаны люциферазы (R ² = 0,9892). Линейное уравнение было сгенерировано с помощью решения для линейной регрессии. (С) AAV стандартную кривую был добавлен на клетках карциномы человека легких (A549) покрытием 24 ч раньше, при плотности 2,5 × 10 ⁴ клеток на лунку (100 мкл) и измерения люциферазы было сделано 24 ч после инфицирования. Уравнение Хилла был создан на основе решения нелинейной регрессии. Средняяиз пяти кривые повторных и стандартные планки погрешностей приведены (R ² = 0,9926).

Обсуждение

Подход люциферазы основе описано здесь предоставляет ряд преимуществ по сравнению с другими существующими методами в том числе ее простота, быстрота, минимальной потребности оборудования и относительно низкой стоимости. Ключевой вклад в это избегание последовательный стадии разбавления. Тем не менее, последовательные разбавления основе производные этого протокола, безусловно, возможно и недавно были использованы для оценки люциферазы экспрессирующих Эбола титры на экране противовирусной высокой пропускной ^11. В то время как по своей природе более трудоемким и более дорогим, такие адаптации может обеспечить более широкий динамический диапазон для количественного определения вирусной когда это необходимо. В дополнение к тому, особенно хорошо подходит для оценки вирусные титры в контексте экранов высокой пропускной, наш один шаг люциферазы на основе вирусной способе количественного генерирует точные оценки инфекционных вирионов в случае репликации вирусов. Кроме того, показания люминесценции наряду с цитотоксичности данных из того же эксперимента дают болееполное представление о влиянии экспериментальных условиях на клетках-мишенях, что особенно полезно в контексте онколитических вирусов и экранов наркотиков.

В приведенном примере проиллюстрировано использует тиражирование негативное РНК вируса одножильному; Тем не менее, этот протокол может быть адаптирован к ряду репликации и не репликации вирусов с несколькими небольшими изменениями протокола. Это включает в себя ДНК вирусов, таких как Vaccinia, HSV, и AAV (рисунок 5). Образцы инфицированных внутриклеточных вирусов, таких как вирус коровьей оспы, например, требует стадии вирус высвобождением перед количественной (например, по меньшей мере, один замораживания-оттаивания). При применении этого метода с другими вирусами, необходимо, чтобы оптимизировать время инкубации от передачи вирусного лизата или надосадочной жидкости к чтению пластин с помощью фотометра. Этот параметр будет зависеть главным образом от цикла репликации вируса в разрешительной клеточной линии и прочности рromoter вождения люциферазы выражение. Лучше всего это делать с помощью полного стандартную кривую на этапе оптимизации. Чтобы сделать это, нужно заразить соответствующий разрешительный клеточной линии с различными повторах подготовленного стандартной кривой и читать друг повторить в другое время указывает После передачи. В идеале, время инкубации точка выбирается, что приводит к линейной зависимости между LOG (RLU) и LOG (титр), охватывающих ожидаемый диапазон образец титра. Для VSVΔ51-Fluc, это, как правило, от 10 ⁴ БОЕ / мл -10 ⁷ КОЕ / мл в течение 5 ч времени инкубации. Если низкие или более высокие титры, как ожидается, из образцов, можно просто увеличить или уменьшить время инкубации соответственно. С другой стороны, образцы могут быть разбавлены, чтобы находиться в пределах, насколько это сделано, как правило, для ELISA.

Как упоминалось выше, этот способ хорошо подходит для выполнения высокой пропускной экраны наркотиков с использованием библиотеки наркотиков, как большинство шагов может быть автоматизирована. Клетки могут быть покрыты еfficiently использованием автоматического Диспенсер для микропланшет, библиотека препарат может быть добавлена ​​с помощью обработчика жидкости 96-канальный, вирус может быть добавлена ​​с помощью микропланшет дозатор и пластины читать с помощью автоматизированной люминометра. В теории, это также может быть адаптирован к 384-луночный или меньших форматах; Однако, ограничение в этом направлении является количество клеток, которые могут быть покрыты, приведенные меньше клетки приводит к более узком диапазоне в линейности LOG (РОС) в LOG (титр) отношения. Наконец, оценки жизнеспособности клеток с использованием резазурин или другие метаболические красители могут быть легко включены в рабочий процесс, позволяя дискриминации цитотоксических соединений в противовирусных экранов или идентификации соединений, которые приводят к синергетическому убийства в сочетании с вирусами ^12. Тем не менее, ограничения этого метода включают требование люциферазы трансген, выражающей вируса, что не всегда возможно, и наличие достаточно разрешительной клеточной линии. Тем не менее, вполне вероятно, можно адаптироватьСпособ для использования с другими репортерных генов (например, GFP), при условии, что метод репортер количественное имеет подходящую линейность и отношение сигнал-шум. В общем, описанный способ с высокой пропускной способностью может быть изменен, чтобы удовлетворить различные вирусы и с учетом разнообразных применений.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbeccos' Modified Eagle's Medium (DMEM)	Corning	SH30243.01
Fetal bovine serum	NorthBio Inc.	NBSF-701
Phosphate buffered saline	Corning	21-040-CV
HEPES	Fisher Scientific	BP310-1	Prepare a 1 mM solution, pH 7.3
alamarBlue	AbD Serotec	BUF012B
D-Luciferin potassium salt	Biotium	10101-2
96-well solid white flat bottom polystyrene TC-treated microplates	Corning	3917	384-well plates can also be used for higher throughput
Synergy Mx	BioTek	SMTBL	Monochromator microplate reader
Liquidator96	Mettler Toledo	LIQ-96-200	96 tip manual pipetting system
Liquidator96 LTS Tips sterilized with filters	Mettler Toledo	LQR-200F	Any sterile filtered tips compatible with pipettors of choice are appropriate
Microflo	BioTek	111-206-21	Used to plate cells in a 96-well plate
Fluoroskan Ascent FL	Thermo Scientific	5210450	Microplate fluorometer