マウスの脾臓から不変ナチュラルキラーT細胞を単離および拡張するための最適化方法

要約

Here we present an adapted protocol that can be used to generate a large number of murine invariant natural killer T cells from mouse spleen. The protocol outlines an approach by which splenic iNKT cells can be enriched for, isolated and expanded in vitro using a limited number of animals and reagents.

要約

急速に刺激によりサイトカインを分泌する能力は、インバリアントナチュラルキラーT（iNKT細胞）細胞系統の機能的な特徴です。 iNKT細胞は、したがって、免疫応答を活性化し、ステアリング適応可能な生来のT細胞集団として特徴づけられます。マウスiNKT細胞の培養および増殖のための改良された技術の開発は 、in vitro および in vivo モデル系でのiNKT細胞生物学の研究を容易にします。ここでは、マウスの脾臓iNKT細胞の単離および拡張のための最適化された手順を説明します。

C57BL / 6マウスから脾臓を取り出し、解剖し、緊張し、得られた細胞懸濁液を、密度勾配媒体を介して積層されています。遠心分離後、脾臓単核細胞（MNC）収集され、CD5陽性（CD5 ^+）リンパ球は、磁気ビーズを使用するために濃縮されます。 CD5 ^+画分内のiNKT細胞は、その後^で染色します5; GalCerを負荷されたCD1d四量体および蛍光活性化細胞選別（FACS）によって精製しました。 FACSは、組換えマウスサイトカインの組み合わせを用いてインビトロで、その後、最初に培養し、プレートに結合したT細胞受容体（TCR）の刺激を、マウス組換えIL-7の存在下で拡張される前に、iNKT細胞を選別しました。この技術を用いて、約10 ⁸ iNKT細胞は、それらが、インビトロでの機能アッセイのために、または、マウスにおけるインビボ移入実験のために使用することができ、その後、培養の18-20日以内に発生することができます。

概要

ネズミ不変ナチュラルキラーT（iNKT細胞）細胞は、CD1dの発現皮質胸腺細胞^1,2-によって胸腺内で選択された生来のTリンパ球の異なる集団です。 iNKT細胞は、Vβ8、Vβ7またはのCD1dの文脈における内因性ならびに外来脂質抗原を認識することができるVβ2TCRは³のいずれかと対に不変Vα14-Jα18TCR鎖からなるT細胞受容体（TCR）を発現します。例えば、マウスのiNKT細胞を認識し、内因性isoglobotrihexosylceramide（の^iGb3）4と呼ばれる脂質抗原と同様に、αガラクトシルセラミド（αGalCerの^）5,6、海綿から単離された糖脂質によって活性化されます。 iNKT細胞のTCR依存性活性化は、適応免疫応答のプライミングを促進し、その結果、iNKT細胞は、リウマチ性疾患⁷及び癌を含む病理の範囲の改善や開発に機能的関与することが示されています ^{8。現在、合成のiNKT細胞リガンドは、免疫病理学的条件の数を調節することが可能である有望な新しいワクチンアジュバントを構成しています。}

これは、以前にiNKT細胞しかしマウス組織から単離した後、in vitroで生成することができることが実証されています。これらの研究の多くは、Vα14TCRトランスジェニック（Tg）は、マウス^10、またはのiNKT細胞由来のハイブリドーマ^11,12を生成するための胸腺腫、主要な抗原提示細胞（APC）、及び/又は細胞株の使用^{9を用います} 。さらに、マウスの多くは、αGalCerのロードされたCD1dダイマー、および長い培養時間などの試薬 ​​の高いボリュームがいくつか公開されたプロトコル少ない倫理的および経済的に^9,13をアピールしてください。

この報告では、単離のために、マウスの脾臓からiNKT細胞の体外拡大して適応する方法を説明します。より具体的には、プロトコルは、方法が記載されていますFACS細胞選別のために必要なマウス、試薬および時間を減少させ、in vitroで 、ソート脾臓iNKT細胞を拡大するために最適化されたアプローチを提案しているマウス脾臓からiNKT細胞を濃縮します。

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プロトコル

本研究では、成体（6-8週）の雌C57BL / 6マウスを使用しました。マウスは、ゲント大学のビバリウムのガイドラインに従って飼育し、飼育しました。すべての動物の手順は、動物実験倫理委員会によって承認されました。

マウスの脾臓から単核細胞（MNCを）の調製

1. 頸椎脱臼によりマウスを生け贄に捧げます。
2. バックダウン解剖ボード上にマウスを置き、ピンと後肢と前足を修正。
3. 70％で皮膚表面を殺菌（体積/体積）エタノール/ _H 2 O
4. 胸部に腹部正中線に沿って皮膚をカットし、無菌手術器具を使用して脾臓を露出させます。
5. 周囲の脂肪組織をトリミングした後、室温で1ミリリットル1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を含む24ウェルプレートに脾臓を配置します。
6. 滅菌メスを用いて脾臓を解剖し、50mlの浴槽内に配置された70ミクロンのナイロンフィルターに作品を転送しますE。
7. 2ミリリットルの注射器のプランジャーを使用して、静かにセルストレーナーを通して脾臓片をマッシュアップし、5mlの1×PBSで洗浄します。
8. 15mlチューブにフィコール - パックの3ミリリットルを追加し、5ミリリットルの細胞懸濁液と密度勾配媒体をオーバーレイ。
9. ブレーキなしの室温で20分間、400×gで遠心分離します。
10. 、新鮮な15mlチューブに相間を移し、4℃で10分間300×gで10ミリリットルの冷1×PBSおよび遠心分離機を追加します。
11. 0.5％ウシ血清アルブミン（BSA）および1mMエチレンジアミン四酢酸（EDTA）（FACS緩衝液）を含むPBS 1×2mlの細胞を再懸濁。小さなチューブに移し、細胞懸濁液10μlを、0.4％の10μLと混合

2.濃縮、検出とマウスのiNKT細胞の精製

1. マウス脾臓CD5positive（CD5 ^+）リンパ球の濃縮。
   1. （オプション）染色で10 ^5細胞のFITC結合抗CD5（4μlの1：30希釈の/ 10 ^6細胞 ）暗所で4℃で30分間、200μlのFACS緩衝液および500で再懸濁し、FACS緩衝液μlの洗浄。 1×PBS中の4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）の20μMの作業溶液を調製し、FACS緩衝液中に10μlのその^{5個の細胞}を1追加し、室温で5分間インキュベートします。フローサイトメーターで10 ⁴前濃縮された細胞を取得します。
      1. （ 図1A）、細胞ダブレットと凝集体を排除するためにFSC-Wの^LO細胞にFCS-HとFCS-Wを使用して、電子的にゲート。そして、電子的にゲートアウトDAPI ⁺ FSC-W ^LO集団内（死）細胞（ 図1B）、および電子的に大きさ（ 図1C）によってリンパ球集団を選択するために、SSC-AとFCS-Aを使用しています。
      2. リンパ球ゲート内の細胞を用いて、CD5対SSC-Aをプロットし、 図1Dに示すように、電子的にゲートCD5 ⁺リンパ球。フローサイトメーターのプレ濃縮されたサンプルの残りを取得します。
   2. FACS緩衝液に90μlのあたり10 ⁷細胞に細胞数を調整し、10μlの抗CD5マイクロビーズを追加します。
   3. 15分間4ºCでインキュベート、FACSは、500μlの冷たいFACS緩衝液中に再懸濁緩衝液および4ミリリットルで1回洗浄。製造業者の推奨に従って磁気細胞分離（MACS）カラムを使用して、CD5 ^{+リンパ球}を濃縮します。
   4. FITC結合抗CD5とオプション）染色は、10 ^5細胞 （2.1.1のように1:30希釈/ 10 ^6細胞 ）およびDAPI4μlの。フローサイトメーター上の10 ⁴濃縮リンパ球を取得し、2.1.1で作成した電子ゲートことを確認します。濃縮された細胞画分に、CD5 ^{+リンパ球}を選択します。フローサイトメーター上の10 ^{5個の細胞}を取得し、 図1（e）に示すように富む画分に存在する割合CD5 ^{+リンパ球}を分析- H。
2. 検出およびマウスのiNKT CEの単離FACSによるLLS。
   1. 抗CD16 / CD32を含むFACS緩衝液中に約10 ^{6個の細胞} 20当たりμLおよびPE結合αGalCerの（1:50希釈/ 10 ^6細胞の4μL）の濃度で濃縮CD5 ^{+リンパ球}を再懸濁/のCD1d四量体（1μgの/ 10 ^6細胞 ）。
   2. 暗所でRTで30分間インキュベートします。
   3. のマウス抗体（mAb）抗CD3εV500（午前1時20希釈の4μL/ 10 ^6細胞 ）、抗CD19 E450（1:50希釈の4μL/ 10 ⁶細胞）および抗CD8αのE450（4μLを希釈FACS緩衝液で1:50希釈/ 10 ^6細胞 ）、CD5 ⁺リンパ球に加え、暗所で4℃で30分間インキュベートします。
   4. 10 ⁷細胞/ mlの最終濃度で4mlにFACS緩衝液を4℃で10分間、300×gで遠心分離し、再懸濁することによって1mLのFACS緩衝液で細胞を洗浄します。
   5. 30μmのセルストレーナーを通して細胞を濾過し、細胞を氷上に置きます。
   6. メーカーの推奨^14,15に従って細胞選別のためのフローサイトメーターを調整します。
      注：細胞選別のためのフローサイトメーターのキャリブレーションは、トレーニングを必要とし、経験豊富なオペレータ、または訓練を受けた技術者により行うことができます。
   7. 10 ⁶個の細胞あたりDAPI20μMのワーキング溶液10μlを加え、室温で5分間インキュベートします。フローサイトメーターで約10 ⁴濃縮CD5 ^{+リンパ球}を取得します。 FSC-Wの^LO細胞の電子的にゲートが、細胞ダブレットと集合体（ 図2A）を除外します。その後、FSC-W ^LO集団内のゲートアウトDAPI ^{+ CD8 +} CD19 ^+細胞 （ダンプチャンネル）（ 図2B）、電子的、および2.1.1.1に記載されているように電子的にリンパ球（ 図2C）を選択し 、SSC-AとFCS-Aを使用します。
      1. CD3εと電子的にゲートαGalCerの/ CD1dのことでプロットαGalCerの/のCD1d四量体図2Dに示すように、四量体^+CD3ε+ iNKT細胞。割合αGalCerの/のCD1d四量体⁺濃縮された細胞画分に存在^CD3ε+ iNKT細胞を決定するために、2×10 ⁵ CD5 ⁺濃縮リンパ球よりも多くを獲得しません。
   8. 「1.5」の流速で70μmのノズルを用いて、70 psiで、フローサイトメーターで2.2.7で作成された電子ゲートを使用して、FACSソートαGalCerの/のCD1d四量体^+CD3ε+ iNKT細胞。 1ミリリットルの100％FCSを含むFACSチューブにソートされたiNKT細胞を収集します。続いて、4℃で10分間、300×gで細胞を10 mlのRMPI 1640培地および遠心分離機を用いてFACSチューブの側面から選別iNKT細胞をすすぎます。
   9. 再懸濁し、1mlのRPMI 1640培地にiNKT細胞を選別し、ソートされたiNKT細胞の純度を評価するために、フローサイトメーター上でμLその40を獲得。リンパ球^- FSC-W ^LO DAPIを選択2.2.7で説明したように、S。 （ 図2E - G）と電子的にゲートαGalCerの/のCD1d四量体^+CD3ε+ iNKT細胞図2Hに示すように。

3.文化とマウスのiNKT細胞の増殖

0日目

1. コー​​ト室温で1時間、ウェルあたり精製した抗CD3ε（3μgの/ ml）で平底の96ウェルプレート。 200μlの1×PBSおよび一度200μlで完全RPMI 1640培地（10％容量/容量のFCS、100U / mlのペニシリン - ストレプトマイシン、5.5μMのβメルカプトエタノール）で2回洗浄します。
2. 1.11のように0.4％血球計数器を使用して実行可能なソートiNKT細胞（ステップ2.2.8）の数をカウントし、完全RPMI 1640培地中で5×10 ⁵細胞/ mlで4℃で10分間、300×gで遠心分離及び再懸濁組換えマウスIL-2（10ng / ml）を、組換えマウスIL-12（1 ngの/ ml）および可溶性抗マウスCD28（5μg/ ml）を含有します。プレートの抗CD3εコートしたプレートにウェル10 ^5細胞 /でiNKT細胞をorted、2日間のCO ₂インキュベーター中、37℃でインキュベートします。

2日目

3. 2日間の新鮮なコーティングされていない平底96ウェルプレートと文化のCO ₂インキュベーター内で37℃での完全RPMI 1640培地中で静止条件下での細胞に細胞を移します。

4日目

4. 穏やかにピペッティングすることによってプレートから細胞を除去し、新鮮な15mlチューブに細胞を移します。 4°C、組換えマウスIL-7（5 ngの/ ml）を含む完全RPMI 1640培地中で5×10 ⁵細胞/ mlで再懸濁し、で10分間、300×gで遠心分離し、フラット10 ⁵細胞/ウェルをプレートCO ₂インキュベーター中、37℃で4日間、96ウェルプレートの底。

8日目

5. 300 xにおける新たなチューブに細胞を回収し、遠心分離可溶性抗CD28（5μg/ ml）を含む完全RPMI 1640培地中で5×10 ⁵細胞/ mlで4℃で10分間再懸濁のために、G。
6. コー​​トウェル当たり精製した抗CD3ε（3μgの/ ml）で平底の96ウェルプレートとは3.1のように洗います。プレート10 ⁵細胞/ウェル中の抗CD3εコーティングされたプレートとは、11日目までのCO ₂インキュベーター中、37℃でインキュベートします。

日11から18

7. 繰り返しは3.6から3.4のステップ。

日19-20

8. 完全RPMI 1640培地中に5×10 ⁵細胞/ mlで300×gで再懸濁で新鮮な15mlチューブ、遠心分離機に細胞を移します。
9. 平底96ウェルプレート中にウェル10 ^5細胞 /プレートで細胞と細胞を実験に使用する前にCO ₂インキュベーター中、37℃で2日間休息することを可能にします。

4.サイトカイン産生のCD1dぷらっとを用いて、マウスのiNKT細胞による電子結合アッセイ

1. コー​​ト平底96ウェルあたり組換えマウスCD1dの100μlの（1×PBS中10μg/ ml）でプレートし、37℃で1時間インキュベートします。
2. 200μlの1×PBSで4回洗浄し、ウェル当たり1×PBS中の2％FCS（ブロッキング溶液）200μlを添加し、37℃で2時間インキュベートします。
3. ブロッキング溶液を除去し、ウェルあたりαGalCerの200μlの（5 ngの/μl）を追加し、16時間、37℃でプレートをインキュベートします。 [αGalCerの溶液の調製のために、車両が96 mg / mlのスクロース、10 mg / mlのデオキシコール酸ナトリウム及び5 mg / mlのTween 20を含むに溶解αGalCerの55μgのに1,085μ1×PBSを追加]。
4. インキュベーション後、αGalCerの液を捨て、200μlの完全RPMI 1640培地に続いて、PBS 1×200μlでも二回洗浄します。
5. 完全なRで遠心細胞300×gで10分間4℃で再懸濁し、21日目にin vitroで拡大iNKT細胞を収集0.5×10 ⁶細胞/ mlの濃度でPMI 1640培地。
6. ウェル当たりのiNKT細胞の再懸濁液の200μlを添加し、CO ₂インキュベーター内で37℃で72時間インキュベートします。
7. 製造業者のプロトコルに従って、酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）によって関心の上澄み液と測定サイトカインを収集します。

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結果

密度勾配を使用して、脾臓単核細胞の単離は、約1時間を要し、赤血球（RBC）を溶解するのに必要な試薬の使用を排除します。生存細胞の高い収率が除去される器官の緊張時に発生するこの方法及び破片を用いて得られます。典型的には、脾臓リンパ球のプール内のiNKT細胞の頻度は、しかし、これは使用される動物の年齢、性別、健康状態に応じて変えることができる総Tリンパ球の1と5％の?...

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ディスカッション

現在のプロトコルにおける重要なステップは、分離およびCD5 ^{+リンパ球} （第1＆2）、（3節）とiNKT細胞の初期めっき（第4節）をFACSソーティングのその後の濃縮を含みます。第1節で実行されるステップの、慎重に異なる細胞間期を遠心分離後に生成されるような密度勾配媒体を介して脾臓細胞懸濁液をレイヤーすることを忘れないでください。磁気細胞分離（第2節）により、CD5 ^+?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material
recombinant murine IL-2	eBiosciences	14-8021
recombinant murine IL-12	eBiosciences	39-8122-65
recombinant murine IL-7	eBiosciences	14-8071
purified anti-mouse CD3e (145-2C11)	eBiosciences	16-0032-86
purified anti-mouse CD28 (37.51)	eBiosciences	16-0281-85
e450-conjugated anti-mouse CD19 (eBio1D3)	eBiosciences	48-0193-82
e450-conjugated anti-mouse CD8α (53-6.7)	eBiosciences	48-0081-82
FITC-conjugated anti-mouse CD5 (53-7.3)	eBiosciences	11-0051-81
V500-conjugated anti-mouse CD3ε (500A2)	BD biosciences	560771
anti-mouse CD5 (Ly-1) microbeads	Macs Miltenyi Biotec	130-049-301
purified anti-mouse CD16/32 (2.4G2)	Macs Miltenyi Biotec	130-092-575
MACS MS Columns	Macs Miltenyi Biotec	130-042-201
Trypan Blue, 0.4% (wt/vol)	Gibco	15250-061
RPMI 1640 medium	Gibco	12633-020
1x PBS	Gibco	10010-056	[Ca2+/Mg2+ - free]
Fetal calf serum	Gibco	10270
L-Glutamine	Gibco	25030-123
Penicillin-streptomycin	Sigma-Aldrich	P4458-100ML
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A7906-100MG
β-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma-Aldrich	EDS-1KG
Ficoll-Paque plus	GE Healthcare	71-7167-00 AF
Equipment
96-well plate F-bottom	Greiner-bio one	657-160
24-well plate	Greiner-bio one	665-180
6-well plate	Greiner-bio one	655-180
15 ml falcon tube	Greiner-bio one	188-271
50 ml falcon tube	Greiner-bio one	227-261
70 µm filter	Greiner-bio one	542-070
30 µm filter	Millipore	SVGP01050
MiniMACS separator	Macs Miltenyi Biotec	130-042-102
MS Columns	Macs Miltenyi Biotec	130-042-201
Water-jacketed CO2 incubator	VWR
Hemocytometer	VWR
Dissection Kit	VWR
BD FACSAria III	BD Biosciences