Fare Dalak Değişmeyen Doğal Öldürücü T Hücreleri İzolasyon ve Yaygınlaştırılması için optimize Yöntemi

Özet

Here we present an adapted protocol that can be used to generate a large number of murine invariant natural killer T cells from mouse spleen. The protocol outlines an approach by which splenic iNKT cells can be enriched for, isolated and expanded in vitro using a limited number of animals and reagents.

Özet

Hızla stimülasyon üzerine sitokinleri yeteneği değişmeyen doğal öldürücü T (iNKT) hücre soyunun işlevsel bir özelliğidir. iNKT hücreler bu bağışıklık yanıtlarını aktive ve direksiyon adaptif yeteneğine sahip doğuştan gelen bir T hücresi popülasyonu olarak karakterize edilir. Murin iNKT hücrelerin kültürü ve genişleme için geliştirilmiş tekniklerin geliştirilmesi, in vitro ve in vivo model sistemlerinde de iNKT hücre biyolojisi üzerinde çalışmayı kolaylaştırmaktadır. Burada, izolasyon ve murin splenik iNKT hücrelerinin genişlemesi için optimize edilmiş bir prosedürü açıklar.

C57BL / 6 farelerinden alınan dalak çıkarılır, parçalara ayrılır ve süzülmüş ve elde edilen hücresel süspansiyon yoğunluk gradyan ortam üzerine yayıldı edilir. Santrifüj sonrasında, dalak mononükleer hücreler (MNC) toplanır ve CD5-pozitif (CD5 ⁺⁾ lenfositler manyetik boncuklar kullanılarak zenginleştirilmiştir. CD5 ⁺ fraksiyonu içinde iNKT hücreler daha sonra ^ ile boyanır5; CD1d tetramer GalCer yüklenmiş ve flöresanla aktive edilen hücre tasnif (FACS) ile saflaştırılmıştır. FACS murin yeniden birleştirici IL-7 varlığında genişletilmiş önce rekombinan sıçangil sitokin ve plaka bağlı T hücresi reseptörü (TCR) uyaran bir kombinasyonu kullanılarak iNKT hücreleri başlangıçta daha sonra in vitro olarak kültürlenir kriteri. Yaklaşık 10 ⁸ iNKT hücreleri in vitro fonksiyonel deneyleri için ya da farelerde in vivo transfer deneyleri için de kullanılabilir ve bundan sonra kültür 18-20 gün içinde elde edilebilir Bu tekniği kullanarak.

Giriş

Mürin değişmeyen doğal öldürücü T (iNKT) hücreleri CD1d-ifade kortikal timositleri ^1,2 ile timus seçilen doğuştan T lenfositlerinin farklı bir nüfus vardır. iNKT hücreleri Vβ8, Vβ7 ya CD1d bağlamında endojen yanı sıra dış lipid antijenlerini tanıma yeteneğine sahip olan Vβ2 TCRler ³ ya ile eşleştirilmiş değişmeyen bir Vα14-Jα18 TCR zinciri içeren bir T hücre reseptörü (TCR) ifade etmektedir. Örneğin, kemirgen iNKT hücreleri tanıyan ve endojen yağ antijen olarak adlandırılan isoglobotrihexosylceramide ^(iGb3) 4, hem de α-galaktozilseramid ^(αGalCer) 5,6, deniz süngerlerinden izole edilen bir glikolipid ile aktive edilir. TCR bağımlı 7 ve kanser dahil patolojilerin bir dizi iyileştirilmesi ya da geliştirme işlevsel olarak ilgili olduğu gösterilmiştirsup> 8. Şu anda, sentetik iNKT hücre ligandlar immünopatolojik koşulları bir dizi düzenleme yeteneğine sahip olabilir umut vadeden yeni bir aşı yardımcı maddeleri oluşturmaktadır.

Bu, daha önce iNKT hücreleri, ancak fare dokusundan izole aşağıdaki in vitro üretilebilir olduğu ortaya konmuştur; Bu çalışmaların bir çoğunda primer antijen sunan hücreler (APC'ler) ve / veya hücre çizgileri ⁹ kullanımından yararlanmakta, Vα14 TCR transjenik (Tg) iNKT-hücresinden alınan hibridomadan ^11,12 üretimi için farenin ¹⁰ veya timomalar. Bundan başka, farelerin çok sayıda, örneğin αGalCer yüklü CD1d dimerler ve uzun kültür zamanlarında gibi reaktiflerin yüksek hacimli bir yayınlanmış protokoller az etik ve ekonomik ^9,13 çekici hale.

Bu yazıda izolasyon ve fare dalak iNKT hücrelerin in vitro genişlemesi uyarlanmış bir yöntem tarif eder. Daha özel olarak ise, Protokol bir yöntem tarifFACS hücre sıralama için gerekli fareler, reaktifler ve süresini azaltır, ve in vitro sıralanan dalak iNKT hücrelerini genişletilmesi için optimize edilmiş bir yaklaşım önermektedir fare dalak iNKT hücrelerini zenginleştirmek için.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Bu çalışmada, yetişkin (6-8 haftalık) dişi C57BL / 6 fareleri kullanılmıştır. Fareler Gent Üniversitesi vivaryum kurallarına göre muhafaza ve yetiştirilen. Tüm hayvan prosedürleri Kurumsal Hayvan Bakım ve Etik Komitesi tarafından kabul edildi.

Fare Dalak Mononükleer Hücreleri (MNC) hazırlanması 1.

1. Servikal dislokasyon ile fare Kurban.
2. Geri aşağı diseksiyon gemide fare yerleştirin ve pimleri, arka ve ön ayaklarını düzeltmek.
3. % 70 ile deri yüzeyi sterilize (hacim / hacim) etanol / _H2O
4. Toraks karın orta hat boyunca cildi kesin ve steril cerrahi aletler kullanılarak dalak maruz.
5. Çevresindeki yağ dokuları kırpma sonra, oda sıcaklığında 1 mi 1 x fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ihtiva eden bir 24 yuvalı plaka içine dalak yerleştirin.
6. Steril bir neşter kullanılarak dalak incelemek ve 50 ml'lik küvet içine yerleştirilen 70 mikron naylon filtre içine parçaları aktarmake.
7. 2 ml şırınga pistonu kullanarak, yavaşça hücre süzgecinden dalak parçaları püre ve PBS 1x 5 ml ile yıkayın.
8. 15 ml'lik bir tüpe Ficoll-Paque 3 ml ilave edilir ve 5 ml hücre süspansiyonu ile yoğunluk gradyan orta kaplar.
9. Fren RT'de 20 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleyin.
10. Taze bir 15 ml'lik bir tüpe transfer interfaz 4 ° C 'de 10 dakika boyunca 300 x g'de 10 ml soğuk 1 x PBS ve santrifüj ekleyin.
11. % 0.5 sığır serum albümini (BSA) ve 1 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) (FACS tamponu) içeren PBS 1x 2 ml tekrar süspansiyon hücreleri. Aktarım, küçük hücre süspansiyonunun tüpe 10 ul,% 0.4 10 ul ile karıştırın

2. Zenginleştirme, Algılama ve Fare iNKT Hücreleri saflaştırılması

1. Fare dalak CD5positive (CD5 ⁺⁾ lenfositlerin zenginleştirilmesi.
   1. (İsteğe bağlı) Leke 10 ^{5 hücreleri} FITC ile konjuge anti-CD5 (4 ul 1:30 seyreltme / 10 ⁶ hücre)Karanlıkta 4 ° C'da 30 dakika için, 200 ul FACS tamponu ve 500 tekrar süspansiyon FACS tamponu ul ile yıkayın. 1x PBS içinde 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) içindeki bir 20 uM çalışma çözeltisi hazırlayın, FACS tampon maddesi içinde ul bunun için 10 ⁵ hücre 1 ekleyin ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. Akış sitometresinde 10 ⁴ önceden zenginleştirilmiş hücreleri edinin.
      1. FCS-H ve FCS-W, hücre çiftleri ve agrega (Şekil 1A) dışlamak için FSC-W ^lo hücreleri üzerinde elektronik kapıyı kullanma. Ardından elektronik kapı dışarı DAPI ⁺ (ölü) FSC-W ^lo nüfus (Şekil 1B) içinde hücreleri ve elektronik boyut (Şekil 1C) tarafından lenfosit nüfus seçmek için SSC-A ve FCS-A kullanın.
      2. Lenfosit kapısı içinde hücreleri kullanarak, CD5 karşı SSC-A arsa ve Şekil 1D gösterildiği gibi elektronik kapı CD5 ^{+ lenfositlerin.} Akış sitometresinde öncesi zenginleştirilmiş numunenin kalanını edinin.
   2. FACS tampon 90 ul başına 10 ⁷ hücreleri hücre sayımı ayarlayın ve 10 ul anti-CD5 mikroboncukları ekleyin.
   3. 4 ml FACS soğuk FACS tampon tampon ve tekrar süspansiyon 500 ul ile bir kez yıkanır, 15 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin. Manyetik hücre ayrıştırma (MACS) kullanarak CD5 ⁺ lenfositlerin üreticinin önerilerine göre sütunlar için zenginleştirin.
   4. FITC ile konjuge anti-CD5 opsiyonel) Leke 10 ⁵ hücreleri (2.1.1 olarak 1:30 seyreltme / 10 ⁶ hücre) ve DAPI 4 ul. Akış 10 ⁴ zenginleştirilmiş lenfositlerin sitometresinde Edinme ve elektronik kapıları 2.1.1 oluşturulan doğrulayın. zenginleştirilmiş hücresel fraksiyonu CD5 ⁺ lenfositleri seçin. Akış sitometresinde 10 ⁵ hücreleri Edinme ve Şekil 1E gösterildiği gibi zenginleştirilmiş fraksiyonu CD5 ⁺ lenfositlerin mevcut yüzdesini analiz - H.
2. Algılama ve fare iNKT ce izolasyonuFACS ile lls.
   1. Anti-CD16 / CD32 içeren FACS tamponda yaklaşık 10 ^{6 hücre} başına 20 ul ve PE-konjuge αGalCer (1:50 seyreltme / 10 ^{6 hücre} 4 ul) içindeki bir konsantrasyonda zenginleştirilmiş CD5 ⁺ lenfositleri yeniden süspanse / CD1d tetramer (1 ug / 10 ⁶ hücre).
   2. Karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika süreyle inkübe edilir.
   3. Fare antikorları (mAb 'ler), anti-CD3ε V500 (1:20 seyreltme 4 ul / 10 ⁶ hücreleri), anti-CD 19 e450 (1:50 seyreltme 4 ul / 10 ⁶ hücre) ve anti-CD8α e450 (4 ul seyreltik FACS tamponu içinde 1:50 seyreltme / 10 ⁶ hücre), CD5 ^{+ lenfosit} ekle ve karanlıkta 4 ° C'de 30 dakika inkübe edilir.
   4. 10 ⁷ hücre / ml 'lik bir son konsantrasyonda 4 ml FACS tampon, 4 ° C'de 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile tekrar süspansiyon 1 ml'lik FACS tamponu ile hücrelerin yıkayın.
   5. 30 mikron hücre süzgecinden hücreleri Filtre ve buz üzerinde hücreleri koyun.
   6. Üretici tavsiyelerine göre ^14,15 sıralama hücre sitometresinin akış kalibre.
      Not: hücre sıralama için bir akış sitometresinin Kalibrasyon eğitim gerektirir ve deneyimli bir operatör veya eğitimli bir teknisyen tarafından yapılabilir.
   7. 10 ⁶ hücre başına DAPI 20 uM çalışma çözeltisinin 10 ul ilave edin ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. Akış sitometresinde yaklaşık 10 ⁴ zenginleştirilmiş CD5 ⁺ lenfositleri edinin. FSC-W ^lo hücreleri üzerinde elektronik kapı hücre çiftleri ve agrega (Şekil 2A) dışlamak için. Ardından elektronik kapı dışarı DAPI ^{+ CD8} + FSC-W ^lo nüfus (Şekil 2B) içinde ^CD19 + hücreler (döküm kanalı) ve 2.1.1.1 de anlatıldığı gibi elektronik lenfositler (Şekil 2C) seçmek için SSC-A ve FCS-A kullanın .
      1. CD3ε ve elektronik kapı αGalCer / CD1d tarafından arsa αGalCer / CD1d tetrameriŞekil 2D'de gösterildiği gibi, tetramer ⁺ CD3ε ⁺ iNKT hücreleri. Zenginleştirilmiş hücresel fraksiyonunda mevcut yüzde αGalCer belirlemek için ^en fazla 5 10 x 2 den CD5 ⁺ zenginleştirilmiş lenfositleri Edinme / CD1d tetrameri ⁺ CD3ε ⁺ iNKT hücreleri.
   8. 2.2.7 oluşturulan elektronik kapıları kullanma. '1.5' bir akış hızında 70 mikron meme kullanılarak sitometresinde 70 psi akışı üzerinde, FACS sıralama αGalCer / CD1d tetrameri ⁺ CD3ε ⁺ iNKT hücreleri. 1 ml% 100 FCS ihtiva eden bir FACS tüpü içinde sıralanmış iNKT hücreler toplanır. Daha sonra 10 mi RMPI 1640 ortamında ve santrifüj 4 ° C 'de 10 dakika boyunca 300 x g'de hücreler, FACS tüpü yanından kriteri iNKT hücreleri yıkayın.
   9. Yeniden süspanse 1640 ortamı RPMI 1 ml iNKT hücreleri kriteri ve sıralanmış iNKT hücrelerinin saflığı analiz etmek üzere bir akış sitometresi üzerinde ul bunların 40 kazanır. Lenfosit ^- FSC-W ^lo DAPI seçins 2.2.7 tarif edildiği gibi. Elektronik ve kapı αGalCer / Şekil 2H gösterildiği gibi CD1d tetrameri ⁺ CD3ε ⁺ iNKT hücreleri - (G Şekil 2E).

3. Kültür ve Fare iNKT Hücrelerinin Genişleme

Gün 0

1. Kaplama oda sıcaklığında 1 saat boyunca hazne başına saflaştırılmış anti-CD3ε (3 ug / ml) ile, dibi düz 96 oyuklu plaka. 200 ul PBS ve bir kez 1 x 200 ul tam RPMI 1640 ortamında (% 10 hacim / hacim FCS, 100 U / ml penisilin-streptomisin, 5.5 uM β-merkaptoetanol) ile iki kez yıkanır.
2. 1.11 olarak% 0.4, bir hemositometre kullanılarak uygulanabilir kriteri iNKT hücreleri (aşama 2.2.8) sayısı., Tam RPMI 1640 ortamında 5 x 10 ⁵ hücre / ml'de, 4 ° C'de 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüje tabi tutulur ve tekrar süspansiyon Rekombinant fare IL-2 (10 ng / ml), rekombinant fare IL-12 (1 ng / ml) ve çözünür anti-fare CD28 (5 ug / ml) ihtiva eden. Plaka sAnti-CD3ε kaplı plakalar iyi 10 ⁵ hücre / iNKT hücreleri orted ve 2 gün _bir CO2 inkübatöründe 37 ° C'de inkübe edin.

Gün 2

3. 2 gün _bir CO2 inkübatöründe 37 ° C'de komple RPMI 1640 ortamı taze bir kaplanmamış düz dipli 96 oyuklu bir plaka ve kültür dinlenme koşulları altında, hücreler aktarın.

4. Gün

4. Nazik pipetleme plaka hücreleri çıkarmak ve taze bir 15 ml tüp hücreleri aktarmak. Bir düz-10 ⁵ hücre / göz, 4 ° C, rekombine IL-7 (5 ng / ml) ihtiva eden komple RPMI 1640 ortamında 5 x 10 ⁵ hücre / ml'de tekrar süspansiyon ve plaka 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin Bir _CO2 kuluçka makinesi içinde 37 ° C 'de 4 gün boyunca 96 plaka altlı.

8. Gün

5. 300 x taze tüp hücreleri toplayın, santrifüjçözünür anti-CD28 (5 ug / ml) içeren tam RPMI 1640 ortamı içinde 5 x 10 ⁵ hücre / ml'de 10 4 ° C'de dakika ve tekrar süspansiyon g.
6. Kaplama oyuk başına saflaştırılmış anti-CD3ε (3 ug / ml) ile, dibi düz 96 kuyucuklu bir plaka ve 3.1 gibi yıkayın. Levha 10 ⁵ hücre / göz Anti-CD3ε kaplı plakalar ve gün 11 kadar _bir CO2 inkübatör içinde 37 ° C'de inkübe edin.

Gün 11-18

7. Tekrarlayın 3.6 3.4 adımları tekrarlayın.

Gün 19-20

8. Tam RPMI 1640 ortamında 5 x 10 ⁵ hücre / ml'de 300 x g'de tekrar süspansiyon taze bir 15 ml tüp, santrifüj hücreleri aktarın.
9. Levha 10 ⁵ hücre hücre / kuyuda bir düz tabanlı 96 oyuklu bir plaka ve izin hücreler bir deney içinde kullanılmadan önce _bir CO2 inkübatör içinde 37 ° C'de 2 gün süreyle dinlenmeye.

4. Sitokin üretimi CD1d Plat Kullanarak Fare iNKT Hücreleri tarafındane bağlı Deneyi

1. Coat düz dipli 96 gözlü oyuk başına rekombinan sıçangil CD1d 100 ul (1 x PBS içinde 10 ug / ml) ile plaka ve 37 ° C'de 1 saat boyunca inkübe edilir.
2. PBS 1x 200 ul ile dört kez yıkayın oyuk başına 1 x PBS (bloke çözeltisi) içinde% 2 FCS, 200 ul ekleyin ve 37 ° C'de 2 saat inkübe edilir.
3. Blokaj çözeltisi kaldır, göz başına αGalCer 200 ul (5 ng / ml) ekleyin ve 16 st için 37 ° C 'de plaka inkübe edin. [ΑGalCer çözeltinin hazırlanması için, bir araç 96 mg / ml sakroz, 10 mg / ml sodyum deoksikolat ve 5 mg / ml Tween 20 ihtiva eden içinde çözülmüş αGalCer 55 ug 1085 μ 1x PBS ekleyin].
4. Kuluçkadan sonra, αGalCer çözeltisi atılır ve 200 ul tam RPMI 1640 ortamı, ardından PBS 1x 200 ul de iki kez yıkayın.
5. Tam R santrifüj hücreler 300 x g'de 10 dakika boyunca 4 ° C 'de ve tekrar süspansiyon, 21. günde, in vitro genişletilmiş iNKT hücreleri toplamak0.5 x 10 ⁶ hücre / ml'lik bir konsantrasyonda PMI 1640 ortamı.
6. Oyuk başına iNKT hücre yeniden süspansiyon 200 ul ilave edin ve _bir CO2 inkübatör içinde 37 ° C'de 72 saat boyunca inkübe edilir.
7. Üreticinin protokolüne göre, enzim bağlantılı immüno emici bir testle (ELISA) ile, ilgilenilen süpernatan ve ölçü sitokinler toplayın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Yoğunluk gradyanı kullanılarak dalak mononükleer hücrelerinin izolasyonu, yaklaşık 1 saat sürer ve kırmızı kan hücrelerinin (RBC) lize için gerekli reaktiflerin kullanımını ortadan kaldırır. Canlı hücreler yüksek verim alınır organın süzme sırasında üretilen bu yöntem ve tortuyu kullanılarak elde edilir. Tipik olarak, dalak lenfosit havuzu içinde iNKT hücrelerin frekansı, bu kullanılan hayvanların yaş, cinsiyet, sağlık durumuna bağlı olarak değişebilir, ancak toplam T lenfositle...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Geçerli protokol kritik adımlar izolasyon ve CD5 ⁺ lenfositlerin (Bölüm 1 ve 2) sonraki zenginleştirme, FACS sıralama (Bölüm 3) ve iNKT hücrelerinin ilk kaplama (Bölüm 4) yer alıyor. Bölüm 1'de gerçekleştirilen adımların dikkatle ayrı bir hücresel interfaz santrifüj takip üretildiği şekilde yoğunluk gradyan ortamı üzerinden dalak hücresel süspansiyon katman unutmayın. Manyetik hücre ayırma (Bölüm 2) tarafından CD5 ⁺ lenfositlerin müteakip zenginleştirme leke...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material
recombinant murine IL-2	eBiosciences	14-8021
recombinant murine IL-12	eBiosciences	39-8122-65
recombinant murine IL-7	eBiosciences	14-8071
purified anti-mouse CD3e (145-2C11)	eBiosciences	16-0032-86
purified anti-mouse CD28 (37.51)	eBiosciences	16-0281-85
e450-conjugated anti-mouse CD19 (eBio1D3)	eBiosciences	48-0193-82
e450-conjugated anti-mouse CD8α (53-6.7)	eBiosciences	48-0081-82
FITC-conjugated anti-mouse CD5 (53-7.3)	eBiosciences	11-0051-81
V500-conjugated anti-mouse CD3ε (500A2)	BD biosciences	560771
anti-mouse CD5 (Ly-1) microbeads	Macs Miltenyi Biotec	130-049-301
purified anti-mouse CD16/32 (2.4G2)	Macs Miltenyi Biotec	130-092-575
MACS MS Columns	Macs Miltenyi Biotec	130-042-201
Trypan Blue, 0.4% (wt/vol)	Gibco	15250-061
RPMI 1640 medium	Gibco	12633-020
1x PBS	Gibco	10010-056	[Ca2+/Mg2+ - free]
Fetal calf serum	Gibco	10270
L-Glutamine	Gibco	25030-123
Penicillin-streptomycin	Sigma-Aldrich	P4458-100ML
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A7906-100MG
β-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma-Aldrich	EDS-1KG
Ficoll-Paque plus	GE Healthcare	71-7167-00 AF
Equipment
96-well plate F-bottom	Greiner-bio one	657-160
24-well plate	Greiner-bio one	665-180
6-well plate	Greiner-bio one	655-180
15 ml falcon tube	Greiner-bio one	188-271
50 ml falcon tube	Greiner-bio one	227-261
70 µm filter	Greiner-bio one	542-070
30 µm filter	Millipore	SVGP01050
MiniMACS separator	Macs Miltenyi Biotec	130-042-102
MS Columns	Macs Miltenyi Biotec	130-042-201
Water-jacketed CO2 incubator	VWR
Hemocytometer	VWR
Dissection Kit	VWR
BD FACSAria III	BD Biosciences