Оптимизированная метод выделения и расширение Инвариантные естественных киллеров Т-клеток из селезенки мыши

Резюме

Here we present an adapted protocol that can be used to generate a large number of murine invariant natural killer T cells from mouse spleen. The protocol outlines an approach by which splenic iNKT cells can be enriched for, isolated and expanded in vitro using a limited number of animals and reagents.

Аннотация

Способность быстро выделять цитокины при стимуляции является функциональная характеристика инвариантной естественных киллеров Т (iNKT) клеточной линии. iNKT клетки, следовательно, характеризуется как врожденной Т клеточной популяции, способным активировать и рулевое приобретенного иммунного ответа. Развитие усовершенствованных методов культуры и расширения мышиных клеток iNKT облегчает изучение биологии iNKT клеток в в пробирке и в естественных условиях модельных систем. Здесь мы описываем оптимизированный процедуру для выделения и расширения мышиных клеток селезенки iNKT.

Селезенки из мышей C57BL / 6, удаляются, рассекали и напряженными, и полученную суспензию сотовой наслаивали на градиента плотности сред. После центрифугирования, селезенки одноядерные клетки (МНК) собирали и CD5-позитивных (CD5 ⁺⁾ лимфоциты обогащены с использованием магнитных шариков. iNKT клетки в фракции CD5 ⁺ впоследствии окрашивали ^5; GalCer загружены CD1d тетрамер и очищают сортировки клеток с возбуждением флуоресценции (FACS). FACS-отсортированы iNKT клетки затем культивируют в первоначально пробирке с использованием комбинации рекомбинантный мышиный цитокинов и пластинчатые связан Т-клеточный рецептор (TCR) раздражители перед расширением в присутствии мышиного рекомбинантного IL-7. Используя эту технику, около 10 ⁸ клеток iNKT могут быть получены в течение 18-20 дней культивирования, после чего они могут быть использованы для функциональных анализов в пробирке, или для экспериментов ин виво у мышей передачи.

Введение

Мышиные инвариант естественные киллеры T (iNKT) клетки особым население врожденных Т-лимфоцитов, отобранных в тимусе по CD1d-выражения корковых тимоцитов ^1,2. iNKT клетки экспрессируют Т-клеточный рецептор (TCR), состоящий из инвариантной Vα14-Jα18 TCR цепи паре либо Vβ8, Vβ7 или Vβ2 ТКР ^{3, который} способен распознавать эндогенные, а также чужеродные антигены липидов в контексте CD1d. Например, мышиные клетки распознают iNKT и активируются эндогенного антигена липидов называемого isoglobotrihexosylceramide ^(iGb3) 4, а также альфа-galactosylceramide (αGalCer) ^5,6, гликолипид изолированы от морских губок. TCR-зависимой активации iNKT клеток способствует грунтованию приобретенного иммунного ответа, и в результате, iNKT клетки, как было показано, функционально вовлечен в улучшение или развитие диапазоне патологий, включая ревматические болезни и рак ^{7 8. В настоящее время синтетические лиганды iNKT клеток представляют перспективные новые вакцинные адъюванты, которые могут быть способны регулировать количество иммунопатологических условиях.}

Ранее было показано, что клетки iNKT могут быть получены в лабораторных следующие отрыве от мыши ткани однако; многие из этих исследований используют использование первичных антиген-представляющих клеток (АРС) и / или клеточных линий ^9, Vα14 TCR трансгенной (Tg) мышей ^10, или тимомы для генерации клеток, полученных гибридом iNKT ^11,12. Кроме того, большое количество мышей, высокие объемы реагентов, таких как αGalCer загруженных CD1d димеров, и длительное время культивирования сделать некоторые опубликованные протоколы менее этически и экономически привлекательным ^9,13.

В этом докладе мы описываем адаптированный метод для изоляции и в пробирке расширения iNKT клеток из селезенки мыши. Более конкретно, протокол описан способдля обогащения iNKT клетки от селезенки мыши, что снижает мышей, реагенты и время, необходимые для FACS сортировки клеток, а также предлагается оптимизированный подход для расширения отсортированные селезенки iNKT клетки в пробирке.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

В этом исследовании были использованы взрослых (6-8 недель) женщина мышей C57BL / 6. Мышей содержали и разводили в соответствии с руководящими принципами виварии Гентского университета. Все процедуры на животных были одобрены Комитетом по уходу и этика Институциональная животного.

1. Подготовка мононуклеарных клеток (МНК) из селезенки мышей

1. Жертвоприношение мыши путем смещения шейных позвонков.
2. Наведите обратно на вскрытии борту и исправить лань и передние ноги с булавками.
3. Стерилизация поверхности кожи с 70% (об / об) этанол / _H 2 O.
4. Разрежьте кожу вдоль средней линии живота к грудной клетке и выставить селезенки с использованием стерильных хирургических инструментов.
5. После обрезки окружающие жировой ткани, положите селезенки в 24-луночного планшета, содержащего 1 мл 1x фосфатным буферным солевым раствором (PBS) при комнатной температуре.
6. Проанализируйте селезенки с использованием стерильного скальпеля и передачи части в нейлоновый фильтр 70 мкм размещается в 50 мл ваннее.
7. Использование 2 мл шприца, аккуратно пюре кусочки селезенки через сито и клеток промыть 5 мл PBS 1x.
8. Добавить 3 мл Ficoll-Пак в 15 мл трубки и наложить градиент плотности среды с 5 мл клеточной суспензии.
9. Центрифуга при 400 х г в течение 20 мин при комнатной температуре без тормоза.
10. Передача межфазной в свежую пробирку 15 мл, добавляют 10 мл холодного PBS и 1x центрифуге при 300 х г в течение 10 мин при 4 ° С.
11. Ресуспендируют клеток в 2 мл PBS, содержащим 1x 0,5% бычьего сывороточного альбумина (BSA) и 1 мМ этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА) (FACS буфера). Передача 10 мкл клеточной суспензии на небольшую трубку, смешать с 10 мкл 0,4%

2. Обогащение, обнаружение и очистка мыши iNKT клеток

1. Обогащение мыши селезенки CD5positive (CD5 ⁺⁾ лимфоцитов.
   1. (Необязательно) Пятно 10 ^{5 клеток} с FITC-сопряженных анти-CD5 (4 мкл 1:30 разбавления / 10 ^{6 клеток)}в течение 30 мин при 4 ° С в темноте, промыть 200 мкл FACS буфера и ресуспендирования в 500 мкл FACS буфера. Подготовка 20 мкм рабочий раствор 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) в 1x PBS, добавить 1 мкл его до 10 ⁵ клеток в буфере FACS и инкубировать при комнатной температуре в течение 5 мин. Приобретение 10 ⁴ предварительно обогащенный клеток на проточном цитометре.
      1. Использование FCS-H и FCS-W, в электронном ворота на FSC-W ^ло клеток, чтобы исключить сотовые дублеты и агрегаты (рис 1а). Тогда в электронном ворота из DAPI ^{+ (мертвые)} клетки в ^FSC-W-Ло населения (рис 1B), и использовать SSC-A и FCS-A в электронном выберите популяции лимфоцитов по размеру (Рисунок 1С).
      2. Использование клеток в ворота лимфоцитов, сюжет SSC-A по сравнению с CD5 и электронном ворота CD5 ⁺ лимфоцитов, как показано на рисунке 1D. Приобретение остаток предварительно обогащенного образца на проточном цитометре.
   2. Отрегулируйте количество клеток до 10 ⁷ клеток на 90 мкл в FACS буфере и добавить 10 мкл анти-CD5 микрогранулы.
   3. Инкубируйте при 4 ° С в течение 15 мин, промыть один раз 4 мл FACS буфера и ресуспендируют в 500 мкл буфера FACS холодной. Пополните для CD5 ^{+ лимфоцитов} с использованием разделения магнитная ячейка (MACS) колонки в соответствии с рекомендациями завода-изготовителя.
   4. Необязательно) Пятно 10 ^{5 клеток} с FITC-сопряженных анти-CD5 (4 мкл 1:30 разбавления / 10 ⁶ клеток) и DAPI как в 2.1.1. Приобретать 10 ⁴ обогащенных лимфоцитов на проточном цитометре и убедитесь, что электронные ворота создан в 2.1.1. выберите CD5 ⁺ лимфоцитов в обогащенной фракции сотовой. Приобретение ¹⁰ 5 клеток на проточном цитометре и анализировать процент CD5 ^{+ лимфоцитов,} присутствующих в обогащенном фракции, как показано на рисунке 1E - H.
2. Обнаружение и изоляция мыши iNKT CEзаполняет по FACS.
   1. Ресуспендируют обогащенные CD5 ⁺ лимфоцитов в концентрации примерно 10 ^{6 клеток} в 20 мкл FACS в буфере, содержащем анти-CD16 / CD32 (4 мкл 1:50 разбавления / 10 ⁶ клеток) и ПЭ-конъюгированного αGalCer / CD1d тетрамер (1 мкг / 10 ^{6 клеток).}
   2. Инкубировать в течение 30 мин при комнатной температуре в темноте.
   3. Развести мышиные антитела (моноклональные антитела) против CD3ε V500 (4 мкл 1:20 разбавления / 10 ^{6 клеток),} анти-CD19 E450 (4 мкл 1:50 разбавления / 10 ^{6 клеток)} и анти-CD8α E450 (4 мкл 1:50 разбавление / ¹⁰ 6 клеток) в FACS буфере, добавить к CD5 ^{+ лимфоцитов} и инкубируют в течение 30 мин при 4 ° С в темноте.
   4. Промыть клетки с 1 мл FACS буфера центрифугированием при 300 х г в течение 10 мин при 4 ° С и ресуспендируют в 4 мл FACS буфера в конечной концентрации 10 ⁷ клеток / мл.
   5. Фильтр клетки через сетчатый фильтр 30 мкм клетки и поместить клетки на льду.
   6. Калибровка потока цитометр для сортировки клеток в соответствии с рекомендациями завода-изготовителя ^14,15.
      Примечание: Калибровка цитометра потока для сортировки клеток требует подготовки и может быть выполнена с помощью опытного оператора, или квалифицированный специалист.
   7. Добавить 10 мкл 20 мкМ рабочего раствора DAPI в ¹⁰ 6 клеток и инкубируют при комнатной температуре в течение 5 мин. Приобретать примерно ¹⁰ 4, обогащенные CD5 ⁺ лимфоцитов на цитометра. Электронно ворота на FSC-W ^ло клеток, чтобы исключить сотовые дублеты и агрегаты (рис 2а). Затем в электронном виде ворот из DAPI ^{+ CD8} + CD19 ^{+ клеток} (самосвал канал) в ^FSC-W-Ло населения (рис 2B), и использовать SSC-A и FCS-A в электронном выберите лимфоцитов (рис 2С), как описано в 2.1.1.1 ,
      1. Участок αGalCer / CD1d Тетрамер по CD3ε и электронном ворота αGalCer / CD1dтетрамер ⁺ CD3ε ⁺ iNKT клетки, как показано на рисунке. 2D Приобретать не более 2 х 10 ⁵ CD5 ⁺ лимфоцитов, обогащенных определить процент αGalCer / CD1d тетрамерные ⁺ CD3ε ⁺ iNKT клетки, присутствующие в обогащенном сотовой фракции.
   8. Использование электронных ворота, созданные в 2.2.7., FACS рода αGalCer / CD1d тетрамер ⁺ CD3ε ⁺ iNKT клетки на проточном цитометре при 70 фунтов на квадратный дюйм с использованием сопла 70 мкм при скорости потока 1,5 ''. Сбор отсортированных iNKT клеток в пробирку, содержащую FACS 1 мл 100% FCS. Впоследствии промойте отсортированные iNKT клетки от боковой поверхности трубы с помощью FACS 10 мл RMPI 1640 и центрифуги клетки при 300 мкг в течение 10 мин при 4 ° С.
   9. Ресуспендируют сортируются iNKT клеток в 1 мл среды RPMI 1640 и 40 мкл приобретают их на проточном цитометре для оценки чистоты отсортированных iNKT клеток. Выберите FSC-W ^ло DAPI ^- лимфоцитовс, как описано в 2.2.7. (Рис 2E - G) и в электронном виде ворот αGalCer / CD1d тетрамер ⁺ CD3ε ⁺ iNKT клетки, как показано на рисунке 2Н.

3. Культура и расширение Мышь iNKT клеток

День 0

1. Шерсть с плоским дном 96-луночный планшет с очищенной анти-CD3ε (3 мкг / мл) на лунку в течение 1 часа при комнатной температуре. Дважды промывали 200 мкл PBS и 1x раз с 200 мкл среды RPMI полной среды (1640 10% объем / объем FCS, 100 ед / мл пенициллина-стрептомицина, 5,5 мкМ β-меркаптоэтанол).
2. Подсчитайте число жизнеспособных клеток, отсортированных iNKT (этап 2.2.8) с использованием 0,4% гемоцитометра, как в 1.11., Центрифуги при 300 мкг в течение 10 мин при 4 ° С и ресуспендируют в 5 ^× 10 5 клеток / мл в среде RPMI полной 1640 содержащей рекомбинантный мышиный IL-2 (10 нг / мл), рекомбинантный мышиный IL-12 (1 нг / мл) и растворимый анти-CD28-мыши (5 мкг / мл). Тарелкиorted iNKT клеток при 10 ⁵ клеток / лунку в анти-CD3ε покрытием и инкубируют при 37 ° С в _СО 2 инкубаторе в течение 2 дней.

День 2

3. Передача клеток в свежей без покрытия с плоским дном 96-луночный планшет и культуры клеток в состоянии покоя в полной среде RPMI 1640 при 37 ° С в _СО 2 инкубаторе в течение 2 дней.

День 4

4. Сместить клетки от пластины, осторожно пипеткой и переноса клеток в свежую пробирку 15 мл. Центрифуга при 300 х г в течение 10 мин при 4 ° С, ресуспендируют в 5 х 10 ⁵ клеток / мл в RPMI полной среде, содержащей 1640 рекомбинантный мышиный IL-7 (5 нг / мл), и пластины 10 ⁵ клеток / лунку в плоско дном 96-луночный планшет в течение 4 дней при 37 ° С в _СО 2 инкубатор.

День 8

5. Собирают клетки в чистую пробирку, центрифуге при 300 хг в течение 10 мин при 4 ° С и ресуспендируют в 5 ^× 10 5 клеток / мл в полной среде RPMI 1640, содержащей растворимый анти-CD28 (5 мкг / мл).
6. Пальто с плоским дном 96-луночный планшет с очищенной анти-CD3ε (3 мкг / мл) на лунку и мыть, как в 3.1. Пластина 10 ⁵ клеток / лунку в анти-CD3ε пластины с покрытием и не инкубировать при 37 ° С в _СО 2 инкубатор до 11-й день.

День 11 - 18

7. Повторите шаги 3.4 до 3.6.

19-20 день

8. Передача клеток в свежей 15 мл пробирку центрифуги, при 300 х г и ресуспендируют в 5 ^× 10 5 клеток / мл в полной среде RPMI 1640.
9. Пластина клеток в 10 ^{5 клеток} / лунку в плоскодонных 96-луночный планшет и позволяют клеткам, чтобы отдохнуть в течение 2 дней при 37 ° С в СО _{2 инкубаторе} до использования в качестве эксперимента.

4. продукция цитокинов с помощью мыши iNKT клеток с использованием CD1d Platадрес электронной связаны Анализ

1. Шерсть с плоским дном 96-луночный планшет с 100 мкл мышиного рекомбинантного CD1d (10 мкг / мл в PBS) 1x на лунку и инкубируют в течение 1 ч при 37 ° С.
2. Промыть четыре раза 200 мкл PBS 1x, добавить 200 мкл 2% FCS в PBS 1x (блокирующий раствор) на лунку и инкубируют в течение 2 ч при 37 ° С.
3. Удалить блокирующий раствор добавьте 200 мкл αGalCer (5 нг / мкл) в каждую лунку, и планшет инкубируют при 37 ° С в течение 16 ч. [Для приготовления раствора αGalCer, добавить 1,085 М 1X PBS до 55 мкг αGalCer растворенного в транспортное средство, содержащее 96 мг / мл сахарозы, 10 мг / мл дезоксихолат натрия и 5 мг / мл Tween 20].
4. После инкубации, отменить решение αGalCer и мыть хорошо дважды 200 мкл PBS 1x с последующим 200 мкл среды RPMI полная 1640.
5. Сбор в пробирке расширенные iNKT клетки на 21 день, центрифуги клетки при 300 мкг в течение 10 мин при 4 ° С и ресуспендируют в полной RPMI 1640 в концентрации 0,5 ^× 10 6 клеток / мл.
6. Добавить 200 мкл клеток iNKT ресуспендирования на лунку и инкубируют в течение 72 ч при 37 ° С в _СО 2 инкубатор.
7. Соберите супернатант и измерить цитокины интересующие иммуноферментный анализ (ИФА) в соответствии с протоколом производителя.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Выделение мононуклеарных клеток селезенки с использованием градиента плотности занимает примерно 1 ч и исключает использование реагентов, необходимых для лизиса эритроцитов (эритроцитов). Высокий выход жизнеспособных клеток получают с использованием этого метода и мусора в период н...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Критические шаги в текущем протоколе включают изоляцию и последующее обогащение CD5 ^{+ лимфоцитов} (раздел 1 и 2), FACS сортировки (раздел 3) и начальное обшивки iNKT клеток (раздел 4). Из шагов, выполняемых в разделе 1, не забудьте тщательно слой селезенки суспензии клеток за плотности градие...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material
recombinant murine IL-2	eBiosciences	14-8021
recombinant murine IL-12	eBiosciences	39-8122-65
recombinant murine IL-7	eBiosciences	14-8071
purified anti-mouse CD3e (145-2C11)	eBiosciences	16-0032-86
purified anti-mouse CD28 (37.51)	eBiosciences	16-0281-85
e450-conjugated anti-mouse CD19 (eBio1D3)	eBiosciences	48-0193-82
e450-conjugated anti-mouse CD8α (53-6.7)	eBiosciences	48-0081-82
FITC-conjugated anti-mouse CD5 (53-7.3)	eBiosciences	11-0051-81
V500-conjugated anti-mouse CD3ε (500A2)	BD biosciences	560771
anti-mouse CD5 (Ly-1) microbeads	Macs Miltenyi Biotec	130-049-301
purified anti-mouse CD16/32 (2.4G2)	Macs Miltenyi Biotec	130-092-575
MACS MS Columns	Macs Miltenyi Biotec	130-042-201
Trypan Blue, 0.4% (wt/vol)	Gibco	15250-061
RPMI 1640 medium	Gibco	12633-020
1x PBS	Gibco	10010-056	[Ca2+/Mg2+ - free]
Fetal calf serum	Gibco	10270
L-Glutamine	Gibco	25030-123
Penicillin-streptomycin	Sigma-Aldrich	P4458-100ML
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A7906-100MG
β-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma-Aldrich	EDS-1KG
Ficoll-Paque plus	GE Healthcare	71-7167-00 AF
Equipment
96-well plate F-bottom	Greiner-bio one	657-160
24-well plate	Greiner-bio one	665-180
6-well plate	Greiner-bio one	655-180
15 ml falcon tube	Greiner-bio one	188-271
50 ml falcon tube	Greiner-bio one	227-261
70 µm filter	Greiner-bio one	542-070
30 µm filter	Millipore	SVGP01050
MiniMACS separator	Macs Miltenyi Biotec	130-042-102
MS Columns	Macs Miltenyi Biotec	130-042-201
Water-jacketed CO2 incubator	VWR
Hemocytometer	VWR
Dissection Kit	VWR
BD FACSAria III	BD Biosciences