Un procédé optimisé pour isoler et expansion Invariant Cellules T Tueuses Naturelles de Spleen souris

Résumé

Here we present an adapted protocol that can be used to generate a large number of murine invariant natural killer T cells from mouse spleen. The protocol outlines an approach by which splenic iNKT cells can be enriched for, isolated and expanded in vitro using a limited number of animals and reagents.

Résumé

La capacité à sécréter des cytokines rapidement lors d'une stimulation est une caractéristique fonctionnelle de l'invariant T tueuses naturelles (iNKT) lignée cellulaire. iNKT cellules sont donc caractérisées par une population de cellules T capables d'activer innée et adaptative direction réponses immunitaires. Le développement des techniques améliorées pour la culture et l'expansion des cellules iNKT murins facilite l'étude de la biologie des cellules iNKT in vitro et dans des modèles in vivo. Nous décrivons ici un procédé optimisé pour l'isolement et l'expansion de cellules spléniques murines iNKT.

Les rates de souris C57BL / 6 sont supprimés, disséqués et tendues et la suspension cellulaire obtenue est en couches sur les médias de gradient de densité. Après centrifugation, les cellules mononucléaires spléniques (EMN) sont recueillies et (CD5 ⁺⁾ des lymphocytes CD5-positifs sont enrichies en utilisant des billes magnétiques. iNKT cellules au sein de la fraction CD5 ⁺ sont ensuite colorées avec du ^5; GalCer tétramère CD1d-chargé et purifié par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS). Triées par FACS des cellules iNKT sont initialement puis cultivées in vitro en utilisant une combinaison de cytokines murines recombinantes et des récepteurs des cellules T de plaque lié (TCR) des stimuli avant d'être détendu dans la présence de murine IL-7 recombinante. En utilisant cette technique, environ 10 ⁸ cellules iNKT peuvent être générés à l'intérieur de 18-20 jours de culture, après quoi ils peuvent être utilisés pour des tests fonctionnels in vitro, ou in vivo pour les expériences de transfert chez la souris.

Introduction

Murine T (iNKT) les cellules tueuses naturelles invariant constituent une population distincte de lymphocytes T innées choisis dans le thymus thymocytes corticaux par CD1d exprimant ^1,2. cellules iNKT expriment un récepteur de lymphocyte T (TCR) comprenant une chaîne Vα14-Jα18 TCR invariant associé à chaque Vß8, Vβ7 ou Vβ2 TCR ^3, qui est capable de reconnaître endogène ainsi que des antigènes lipidiques étrangers dans le cadre de CD1d. Par exemple, des cellules murines reconnaissent iNKT et sont activées par un antigène lipide endogène appelé isoglobotrihexosylceramide (iGb3) ^4, ainsi que les α-galactosylcéramide (aGalCer) ^5,6, un glycolipide isolé à partir d'éponges marines. TCR-dépendante de l'activation des cellules iNKT favorise l'amorçage de réponses immunitaires adaptatives, et, par conséquent, les cellules iNKT se sont révélés être fonctionnellement impliquée dans le développement ou l'amélioration d'une gamme de pathologies, y compris les maladies rhumatismales ⁷ et le cancer ^{8. Actuellement, les ligands de cellules iNKT synthétiques constituent de nouveaux prometteurs adjuvants de vaccins qui peuvent être capables de réguler un nombre de conditions immunopathologiques.}

Il a précédemment été démontré que les cellules iNKT peuvent être générés in vitro après isolement à partir de tissus de souris toutefois; bon nombre de ces études emploient l'utilisation de cellules primaires présentatrices d'antigène (CPA) et / ou des lignées cellulaires ^9, Vα14 TCR transgénique (Tg) ^{de 10} souris, les thymomes ou pour la génération d'hybridomes dérivés de cellules ^iNKT-11,12. En outre, un grand nombre de souris, des volumes élevés de réactifs tels que les dimères de CD1d aGalCer-chargés, et de longs temps de culture font certains protocoles publiés moins éthiquement et économiquement attrayante ^9,13.

Dans ce rapport, nous décrivons une méthode adaptée pour l'isolement et dans l'expansion in vitro de cellules iNKT de rate de souris. Plus précisément, le protocole décrit un procédépour enrichir les cellules iNKT de rate de souris qui réduit les souris, les réactifs et le temps requis pour FACS tri cellulaire, et propose une approche optimisé pour l'expansion des cellules iNKT spléniques triées in vitro.

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Protocole

Dans cette étude, des adultes (6-8 semaines) femelles C57BL / 6 ont été utilisées. Les souris ont été logées et élevés selon les directives du vivarium Université de Gand. Toutes les procédures animales ont été approuvés par le Comité de protection des animaux et de l'éthique institutionnelle.

1. Préparation des cellules mononucléaires (MNC) de Spleen souris

1. Sacrifiez la souris par dislocation cervicale.
2. Placez la souris vers le bas sur le plateau de dissection et fixer la biche et les pattes avec des épingles.
3. Stériliser la surface de la peau avec 70% (vol / vol) d'éthanol / H ₂ O.
4. Couper la peau le long de la ligne médiane abdominale au thorax et d'exposer la rate en utilisant des instruments chirurgicaux stériles.
5. Après la coupe des tissus adipeux autour, placer la rate dans une plaque 24 puits contenant 1 ml 1x tampon phosphate salin (PBS) à température ambiante.
6. On dissèque la rate à l'aide d'un scalpel stérile et transférer les morceaux dans un filtre en nylon de 70 pm placée dans un bain de 50 ml,e.
7. En utilisant une seringue de 2 ml plongeur, écraser délicatement les morceaux de la rate à travers le tamis de la cellule et laver avec 5 ml de PBS 1X.
8. Ajouter 3 ml de Ficoll-Paque dans un tube de 15 ml et recouvrir le milieu à gradient de densité avec le 5 ml de suspension cellulaire.
9. Centrifuger à 400 g pendant 20 min à température ambiante sans frein.
10. Transférer l'interphase dans un nouveau tube de 15 ml, ajouter 10 ml froid 1x PBS et centrifuger à 300 g pendant 10 min à 4 ° C.
11. Remettre en suspension les cellules dans 2 ml de PBS 1X contenant 0,5% d'albumine de sérum bovin (BSA) et 1 mM d'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) (tampon FACS). Transfert 10 ul de la suspension cellulaire à un petit tube, mélanger avec 10 ul de 0,4%

2. Enrichissement, la détection et la purification des cellules de souris iNKT

1. L'enrichissement de la rate de la souris CD5positive (CD5 ⁺⁾ lymphocytes.
   1. (Facultatif) Stain 10 ⁵ cellules avec FITC conjugué anti-CD5 (4 pi de la dilution 1:30 / 10 ⁶ cellules)pendant 30 min à 4 ° C dans l'obscurité, on lave avec 200 pi de tampon FACS et remettre en suspension dans 500 pi de tampon FACS. Préparer une solution de travail de 20 uM de 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) dans 1 x PBS, ajouter 1 pl de celui-ci pour 10 ⁵ cellules dans du tampon FACS et incuber à température ambiante pendant 5 min. Acquérir 10 ⁴ cellules pré-enrichis sur le cytomètre de flux.
      1. Utilisation FCS-H et W-FCS, portail électronique ^sur les cellules ^lo FSC-W à exclure doublets de cellules et d'agrégats (figure 1A). Puis électronique porte sur DAPI ⁺ (morts), les cellules au sein de la FSC-W ^lo population (figure 1B), et utilisent SSC-A et FCS-A pour sélectionner électroniquement la population de lymphocytes par la taille (figure 1C).
      2. Utilisation de cellules à l'intérieur de la porte de lymphocytes, tracer SSC-A par rapport CD5 et électroniquement porte CD5 ⁺ lymphocytes comme le montre la figure 1D. Acquisition du reste de l'échantillon de pré-enrichissement sur le cytomètre de flux.
   2. Ajuster le nombre de cellules à 10 ⁷ cellules par 90 ul dans du tampon FACS et 10 pl ajouter des microbilles anti-CD5.
   3. Incuber à 4 ° C pendant 15 min, laver une fois avec 4 ml tampon FACS et remettre en suspension dans 500 pi de tampon FACS froid. Enrichissez pour CD5 ⁺ lymphocytes en utilisant séparation magnétique de cellules (MACS) colonnes selon les recommandations du fabricant.
   4. Facultatif) Stain 10 ⁵ cellules avec FITC conjugué anti-CD5 (4 pi de dilution 1h30 / 10 ⁶ cellules) et DAPI comme en 2.1.1. Acquérir 10 ⁴ lymphocytes enrichis sur le cytomètre de flux et de vérifier que les portes électroniques créés en 2.1.1. sélectionnez CD5 ⁺ lymphocytes dans la fraction cellulaire enrichie. Acquérir 10 ⁵ cellules sur le cytomètre de flux et d'analyser le pourcentage CD5 ⁺ lymphocytes présents dans la fraction enrichie comme représenté sur la figure 1E - H.
2. La détection et l'isolement des souris iNKT thisLLS par FACS.
   1. Remettre en suspension les lymphocytes CD5 ⁺ enrichis à une concentration d'environ 10 ⁶ cellules par 20 ul de tampon pour FACS contenant anti-CD16 / CD32 (4 pi d'une dilution 1:50 / 10 ⁶ cellules) et aGalCer PE-conjugué / tétramère CD1d (1 pg / 10 ⁶ cellules).
   2. Incuber pendant 30 min à température ambiante dans l'obscurité.
   3. Diluer anticorps de souris (mAb) anti-CD3e V500 (4 pi d'une dilution 1:20 / 10 ⁶ cellules), anti-CD19 E450 (4 ul de dilution 01:50 / 10 ⁶ cellules) et anti-CD8a E450 (4 ul de dilution 1:50 / 10 ⁶ cellules) dans un tampon FACS, ajouter à CD5 ⁺ lymphocytes et incuber pendant 30 min à 4 ° C dans l'obscurité.
   4. Laver les cellules avec 1 ml de tampon FACS par centrifugation à 300 xg pendant 10 min à 4 ° C et remettre en suspension dans 4 ml de tampon FACS à une concentration finale de 10 ⁷ cellules / ml.
   5. Filtrer les cellules à travers un tamis cellulaire de 30 um et de placer les cellules sur de la glace.
   6. Calibrer le cytomètre en flux pour le tri selon les recommandations du fabricant ^14,15 cellule.
      Remarque: L'étalonnage d'un cytomètre de flux pour le tri de cellules nécessite une formation et peut être effectuée par un opérateur expérimenté, ou un technicien qualifié.
   7. Ajouter 10 ul d'une solution de travail de 20 pM de DAPI par ¹⁰ 6 cellules et incuber à température ambiante pendant 5 min. L'acquisition d'environ 10 ⁴ enrichis CD5 ⁺ lymphocytes sur le cytomètre en flux. Électronique porte ^sur les cellules ^lo FSC-W à exclure doublets de cellules et d'agrégats (figure 2A). Puis électronique porte sur DAPI ⁺ CD8 ⁺ CD19 ⁺ cellules (canal de décharge) dans le FSC-W ^lo population (figure 2B), et utiliser SSC-A et FCS-A pour sélectionner électroniquement lymphocytes (figure 2C) comme décrit dans 2.1.1.1 .
      1. Terrain aGalCer / CD1d tétramère par CD3e et électroniquement porte aGalCer / CD1dcellules tétramère ⁺ CD3e ⁺ iNKT comme indiqué sur la Figure 2D. Cellules présentes dans la fraction cellulaire enrichie acquérir plus de 2 x 10 ⁵ CD5 ⁺ lymphocytes enrichis pour déterminer le pourcentage aGalCer / CD1d tétramères ⁺ CD3e ⁺ iNKT.
   8. Utilisation des portes électroniques créés en 2.2.7., Les cellules FACS sorte aGalCer / tétramère CD1d CD3e ^{+ +} iNKT sur le cytomètre de flux à 70 psi en utilisant une buse de 70 um à une vitesse de '1,5' d'écoulement. Recueillir des cellules iNKT triés dans un tube FACS contenant 1 ml de 100% de FCS. Ensuite rincer cellules iNKT trié du côté du tube FACS utilisant 10 ml IPMB 1640 et centrifuger les cellules à 300 g pendant 10 min à 4 ° C.
   9. Remettre en suspension triée cellules iNKT dans 1 ml de milieu RPMI 1640 et d'acquérir 40 pi de celui-ci sur un cytomètre de flux pour évaluer la pureté des cellules iNKT triés. Sélectionnez FSC-W ^lo DAPI ^{- lymphocyte}s comme décrit dans 2.2.7. (Figure 2E - G) et électroniquement porte aGalCer / CD1d cellules tétramère ⁺ CD3e ⁺ iNKT comme indiqué dans la figure 2H.

3. Culture et l'expansion des cellules de souris iNKT

Jour 0

1. Enduire une plaque à 96 puits à fond plat avec les anticorps anti-CD3e (3 pg / ml) par puits pendant 1 heure à température ambiante. Laver deux fois avec 200 pi de PBS 1x et une fois avec 200 pi milieu RPMI 1640 complet (10% vol / vol de FCS, 100 U / ml de pénicilline-streptomycine, 5,5 uM β-mercaptoéthanol).
2. Comptez le nombre de cellules viables triées iNKT (étape 2.2.8) en utilisant 0,4% d'un hémocytomètre comme dans 1.11., Centrifuger à 300 g pendant 10 min à 4 ° C et remettre en suspension à 5 x 10 ⁵ cellules / ml dans du milieu complet RPMI 1640 contenant l'IL-2 murine (10 ng / ml) recombinant, recombinant murine IL-12 (1 ng / ml) et soluble CD28 anti-souris (5 ug / ml). Plate ssignalés auparavant cellules iNKT à 10 ⁵ cellules / puits dans des plaques revêtues anti-CD3e et incuber à 37 ° C dans un incubateur à CO ₂ pendant 2 jours.

Jour 2

3. Transférer les cellules à une plaque de 96 à fond plat non couché frais bien et la culture des cellules dans des conditions de repos en milieu RPMI 1640 complet à 37 ° C dans un incubateur à CO ₂ pendant 2 jours.

Jour 4

4. Déloger les cellules de la plaque par pipetage doux et transférer les cellules dans un nouveau tube de 15 ml. Centrifuger à 300 g pendant 10 min à 4 ° C, remise en suspension à 5 x 10 ⁵ cellules / ml dans du milieu RPMI 1640 complet contenant recombinant IL-7 murine (5 ng / ml), et la plaque 10 ⁵ cellules / puits dans un forfaitaire fond plaque à 96 puits pendant 4 jours à 37 ° C dans un incubateur à CO _2.

Jour 8

5. Recueillir les cellules dans un tube frais, centrifugeuse à 300 xg pendant 10 min à 4 ° C et remettre en suspension à 5 x 10 ⁵ cellules / ml dans du milieu RPMI 1640 complet contenant anti-CD28 soluble (5 ug / ml).
6. Enduire une plaque à 96 puits à fond plat avec les anticorps anti-CD3e (3 pg / ml) par puits et laver comme en 3.1. La plaque 10 ⁵ cellules / puits dans des plaques anti-CD3e revêtues et incuber à 37 ° C dans un incubateur à CO ₂ jusqu'à 11 jours.

Jour 11-18

7. Répétez les étapes 3.4 à 3.6.

Jour 19-20

8. Transférer les cellules à un tube de 15 ml frais, centrifugeuse à 300 g et remettre en suspension à 5 x 10 ⁵ cellules / ml dans milieu RPMI 1640 complet.
9. Cellules de la plaque à 10 ⁵ cellules / puits dans une plaque de 96 puits à fond plat et permettre aux cellules de se reposer pendant 2 jours à 37 ° C dans _un incubateur à CO2 avant de l'utiliser dans une expérience.

4. Production de cytokines par les souris des cellules iNKT l'aide d'un CD1d Plate-lié Assay

1. Enduire une plaque à 96 puits à fond plat avec 100 pi de murin recombinant CD1d (10 pg / ml dans du PBS 1X) par puits et incuber pendant 1 heure à 37 ° C.
2. Laver quatre fois avec 200 pi de PBS 1x, ajouter 200 pi de 2% de FCS en 1x PBS (solution de blocage) par puits et incuber pendant 2 heures à 37 ° C.
3. Retirer la solution de blocage, ajouter 200 pi de aGalCer (5 ng / ul) par puits et incuber la plaque à 37 ° C pendant 16 heures. [Pour la préparation de la solution aGalCer, ajouter 1,085 μ 1 x PBS à 55 pg d'aGalCer dissous dans un véhicule contenant 96 mg / ml de saccharose, 10 mg / ml de désoxycholate de sodium et 5 mg / ml entre 20].
4. Après incubation, jeter la solution aGalCer et laver le puits deux fois avec 200 pi de PBS 1x suivie par 200 pi complète moyennes RPMI 1640.
5. Recueillir les cellules iNKT élargi in vitro au jour 21, centrifuger les cellules à 300 g pendant 10 min à 4 ° C et remettre en suspension dans complète RPMI 1640 à une concentration de 0,5 x 10 ⁶ cellules / ml.
6. Ajouter 200 ul de la remise en suspension de cellules iNKT par puits et incuber pendant 72 heures à 37 ° C dans un incubateur à CO _2.
7. Récupérer le surnageant et mesurer les cytokines d'intérêt par immuno-essai enzymatique (ELISA) selon le protocole du fabricant.

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Résultats

Isolement des cellules mononucléaires spléniques en utilisant d'un gradient de densité prend environ une heure et élimine l'utilisation de réactifs nécessaires pour lyser les globules rouges (RBC). Un rendement élevé de cellules viables est obtenue en utilisant cette méthode et les débris générés pendant l'organe de déformation est supprimée. Typiquement, la fréquence des cellules iNKT au sein du pool de lymphocytes de la rate est comprise entre 1 et 5% des lymphocytes T totaux Cependant, cel...

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Discussion

Les étapes critiques dans le protocole actuel comprennent l'isolement et l'enrichissement ultérieur de CD5 ⁺ lymphocytes (Section 1 & 2), tri FACS (section 3) et l'étalement initial de cellules iNKT (section 4). Parmi les étapes effectuées dans la section 1, rappelez-vous à la couche attentivement la suspension cellulaire splénique sur le milieu de gradient de densité telle que une interphase cellulaire distincte est générée après la centrifugation. L'enrichissement ultérieur ...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material
recombinant murine IL-2	eBiosciences	14-8021
recombinant murine IL-12	eBiosciences	39-8122-65
recombinant murine IL-7	eBiosciences	14-8071
purified anti-mouse CD3e (145-2C11)	eBiosciences	16-0032-86
purified anti-mouse CD28 (37.51)	eBiosciences	16-0281-85
e450-conjugated anti-mouse CD19 (eBio1D3)	eBiosciences	48-0193-82
e450-conjugated anti-mouse CD8α (53-6.7)	eBiosciences	48-0081-82
FITC-conjugated anti-mouse CD5 (53-7.3)	eBiosciences	11-0051-81
V500-conjugated anti-mouse CD3ε (500A2)	BD biosciences	560771
anti-mouse CD5 (Ly-1) microbeads	Macs Miltenyi Biotec	130-049-301
purified anti-mouse CD16/32 (2.4G2)	Macs Miltenyi Biotec	130-092-575
MACS MS Columns	Macs Miltenyi Biotec	130-042-201
Trypan Blue, 0.4% (wt/vol)	Gibco	15250-061
RPMI 1640 medium	Gibco	12633-020
1x PBS	Gibco	10010-056	[Ca2+/Mg2+ - free]
Fetal calf serum	Gibco	10270
L-Glutamine	Gibco	25030-123
Penicillin-streptomycin	Sigma-Aldrich	P4458-100ML
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A7906-100MG
β-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma-Aldrich	EDS-1KG
Ficoll-Paque plus	GE Healthcare	71-7167-00 AF
Equipment
96-well plate F-bottom	Greiner-bio one	657-160
24-well plate	Greiner-bio one	665-180
6-well plate	Greiner-bio one	655-180
15 ml falcon tube	Greiner-bio one	188-271
50 ml falcon tube	Greiner-bio one	227-261
70 µm filter	Greiner-bio one	542-070
30 µm filter	Millipore	SVGP01050
MiniMACS separator	Macs Miltenyi Biotec	130-042-102
MS Columns	Macs Miltenyi Biotec	130-042-201
Water-jacketed CO2 incubator	VWR
Hemocytometer	VWR
Dissection Kit	VWR
BD FACSAria III	BD Biosciences