Ein optimiertes Verfahren zur Isolierung und Ausbau unveränderlichen natürlichen Killer T-Zellen aus der Milz der Maus

Zusammenfassung

Here we present an adapted protocol that can be used to generate a large number of murine invariant natural killer T cells from mouse spleen. The protocol outlines an approach by which splenic iNKT cells can be enriched for, isolated and expanded in vitro using a limited number of animals and reagents.

Zusammenfassung

Die Fähigkeit, schnell zu sezernieren Zytokine bei Stimulation ist ein funktionelles Merkmal der invarianten natürlichen Killer-T (iNKT) Zelllinie. iNKT Zellen werden daher als einer angeborenen T-Zellpopulation in der Lage, die Aktivierung und Steuerung der adaptiven Immunantwort aus. Die Entwicklung von verbesserten Techniken zur Kultivierung und Expansion murine iNKT Zellen erleichtert die Untersuchung der Zellbiologie iNKT in in vitro und in vivo-Modellsystemen. Hier beschreiben wir ein optimiertes Verfahren zur Isolierung und Expansion von murinen Milz iNKT Zellen.

Milz von C57BL / 6-Mäusen entfernt, seziert und gespannt, und die resultierende Zellsuspension wird über Dichtegradientenmedien geschichtet. Nach der Zentrifugation werden Milz mononuklearen Zellen (MNC) gesammelt und CD5-positive (CD5 ⁺⁾ Lymphozyten werden für die Verwendung von magnetischen Kügelchen angereichert. iNKT Zellen innerhalb des CD5 ^{+ -Fraktion} anschließend mit gefärbten ^5; GalCer belasteten CD1d Tetramer und durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) gereinigt. FACS sortiert iNKT Zellen werden dann zunächst in vitro unter Verwendung einer Kombination von rekombinanten murinen Zytokine und plattengebundenen T-Zell-Rezeptor (TCR) Stimuli, bevor sie in der Gegenwart von rekombinantem murinem IL-7 erweitert. Unter Verwendung dieser Technik etwa 10 ⁸ iNKT Zellen können innerhalb von 18-20 Tagen Kultur, wonach sie für funktionelle Assays in vitro, oder in vivo Transferexperimente bei Mäusen verwendet werden, erzeugt werden.

Einleitung

Murine invarianten natürlichen Killer-T (iNKT) Zellen sind eine deutliche Bevölkerung von angeborenen T-Lymphozyten im Thymus durch CD1d-exprimierenden kortikalen Thymozyten ^1,2 ausgewählt. iNKT Zellen einen T-Zellrezeptor (TCR) von einer invarianten Vα14-Jα18 TCR-Kette gepaart mit entweder Vβ8, Vβ7 oder Vβ2 TCRs ^{3, die} in der Lage ist Erkennung von endogenem sowie fremde Lipidantigene im Kontext von CD1d ist besteht. B. murine iNKT Zellen erkennen und werden durch eine endogene Lipid Antigen genannt isoglobotrihexosylceramide ^(iGb3) 4, sowie α-Galactosylceramid (αGalCer) ^5,6, einem Glykolipid aus marinen Schwämmen isoliert aktiviert. TCR-abhängige Aktivierung von iNKT Zellen fördert die Grundierung von der adaptiven Immunantwort, und als ein Ergebnis haben iNKT Zellen gezeigt wurde in der Linderung oder Entwicklung einer Reihe von Erkrankungen, einschließlich rheumatischen Erkrankungen und Krebs ⁷ funktionell beteiligt werden ^{8. Derzeit synthetischen iNKT Zellliganden bilden vielversprechende neue Impfstoff-Adjuvantien, die in der Lage, die Regulierung eine Reihe von immunpathologischen Bedingungen sein kann.}

Es ist zuvor gezeigt worden, daß iNKT Zellen können in vitro nach der Isolierung aus Mausgewebe jedoch erzeugt werden; viele dieser Untersuchungen beschäftigen die Verwendung von primären Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) und / oder Zelllinien ^9, Vα14 TCR transgenen (Tg) Mäuse ^{10 oder} thymomas zur Erzeugung iNKT Zellen abgeleiteten Hybridome ^11,12. Darüber hinaus eine große Anzahl von Mäusen, stellen große Mengen an Reagenzien, wie αGalCer belasteten CD1d Dimere, und langwierige Kultur mal einige veröffentlichten Protokollen weniger ethisch und wirtschaftlich attraktiv ^9,13.

In diesem Bericht beschreiben wir ein angepasstes Verfahren zur Isolierung und in vitro-Expansion der iNKT Zellen aus der Milz der Maus. Genauer gesagt, das Protokoll beschreibt ein Verfahrenzur Anreicherung iNKT Zellen aus der Milz der Maus, die die Mäuse, Reagenzien und Zeit für FACS Zellsortierung erforderlich, reduziert, und schlägt vor, einen optimierten Ansatz für den Ausbau der sortierten Milz iNKT Zellen in vitro.

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Protokoll

In dieser Studie wurden erwachsene (6-8 Wochen) weiblichen C57BL / 6-Mäuse verwendet. Die Mäuse wurden nach den Richtlinien der Ghent University Vivarium gehalten und gezüchtet. Alle tierischen Verfahren wurden von der Institutional Animal Care und Ethik-Kommission genehmigt.

1. Herstellung von mononuklearen Zellen (MNC) aus Maus-Milz

1. Opfern Sie die Maus durch Genickbruch.
2. Platzieren Sie die Maus wieder auf den Seziertisch Platte und befestigen Sie die hinteren und Vorderbeine mit Stiften.
3. Sterilisieren der Haut-Oberfläche mit 70% (vol / vol) Ethanol / _H 2 O.
4. Schneiden Sie die Haut an der Bauchmittellinie, um den Brustkorb und setzen die Milz mit sterilen chirurgischen Instrumenten.
5. Nach dem Trimmen die umliegenden Fettgewebe, legen Sie die Milz in eine 24 Well-Platte mit 1 ml 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) bei RT.
6. Präparieren Sie die Milz mit einem sterilen Skalpell und übertragen Sie die Stücke in eine 70 & mgr; m Nylon-Filter in einem 50 ml Wanne platzierte.
7. Unter Verwendung eines 2 ml Spritzenkolben vorsichtig zerdrücken die Milz Stücke durch die Zelle Sieb und Waschen mit 5 ml 1x PBS.
8. 3 ml Ficoll-Paque in ein 15 ml-Röhrchen und überlagern das Dichtegradientenmedium mit 5 ml Zellsuspension.
9. Zentrifuge bei 400 × g für 20 min bei RT ohne Bremse.
10. Übertragen Sie die Interphase in ein frisches 15-ml-Tube, 10 ml kaltem 1x PBS und zentrifugieren bei 300 × g für 10 min bei 4 ° C.
11. Resuspendieren der Zellen in 2 ml 1x PBS, enthaltend 0,5% Rinderserumalbumin (BSA) und 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) (FACS-Puffer). Transfer 10 ul der Zellsuspension in ein kleines Röhrchen mit 10 ul 0,4% mischen

2. Anreicherung zur Erkennung und Reinigung von Maus iNKT Cells

1. Bereicherung der Maus Milz CD5positive (CD5 ⁺⁾ Lymphozyten.
   1. (Optional) Flecken ¹⁰ 5 Zellen mit FITC-konjugiertem anti-CD5 (4 ul von 1:30 Verdünnung / 10 ^{6 Zellen)}für 30 min bei 4 ° C im Dunkeln, Waschen mit 200 ul FACS-Puffer und resuspendieren in 500 & mgr; l FACS-Puffer. Vorbereitung einer 20 & mgr; M Arbeitslösung von 4 ', 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) in 1x PBS wird mit 1 & mgr; l davon auf ¹⁰ 5 Zellen in FACS-Puffer und Inkubation bei Raumtemperatur für 5 min. Erwerben Sie 10 ⁴ pre-angereicherten Zellen am Durchflusszytometer.
      1. Verwendung von FCS-H und FCS-W, elektronisch Tor auf FSC-W ^lo Zellen, Zell Dubletts und Zuschlagstoffen (1A) auszuschließen. Dann elektronisch Gate aus DAPI ^{+ (toten)} Zellen innerhalb des FSC-W ^lo Bevölkerung (1B), und verwenden Sie SSC-A und FCS-A elektronisch wählen Sie die Lymphozytenpopulation nach Größe (1C).
      2. Verwendung von Zellen in der Lymphocyten-Schranke, plotten SSC-A gegenüber CD5 und elektronisch Gate CD5 ⁺ Lymphozyten, wie in Figur 1D gezeigt. Erwerben den Rest der Pre-angereicherten Probe auf dem Durchflusszytometer.
   2. Passen Zellzahlen ^bis 10 7 Zellen pro 90 & mgr; l in FACS-Puffer und fügen Sie 10 ul anti-CD5 Mikroperlen.
   3. Inkubation bei 4 ° C für 15 Minuten, einmal mit 4 ml FACS-Puffer und resuspendieren in 500 ul kaltem FACS-Puffer waschen. Bereichern Sie für CD5 ⁺ Lymphozyten unter Verwendung von Magnetzellseparation (MACS) Spalten nach den Empfehlungen des Herstellers.
   4. Optional) Stain ¹⁰ 5 Zellen mit FITC-konjugiertem anti-CD5 (4 ul von 1:30 Verdünnung / 10 ⁶ Zellen) und DAPI, wie in 2.1.1. Erwerben Sie 10 ⁴ angereicherten Lymphozyten auf dem Durchflusszytometer und überprüfen, ob die elektronischen Tore in 2.1.1 erstellt. Wählen CD5 ⁺ Lymphozyten in der angereicherten Zellfraktion. Erwerben Sie ¹⁰ 5 Zellen am Durchflusszytometer und analysieren die Prozent CD5 ⁺ Lymphozyten in der angereicherten Fraktion vorhanden, wie in 1E gezeigt - H.
2. Nachweis und zur Isolierung von Maus iNKT cells durch FACS.
   1. Resuspendieren angereichert CD5 ⁺ Lymphozyten in einer Konzentration von ca. ¹⁰ 6 Zellen pro 20 ul in FACS-Puffer, enthaltend anti-CD16 / CD32 (4 & mgr; l 1:50 Verdünnung / 10 ^{6 Zellen)} und PE-konjugiertem αGalCer / CD1d Tetramer (1 ug / 10 ^{6 Zellen).}
   2. Inkubation für 30 min bei RT im Dunkeln.
   3. Verdünnte Maus-Antikörpern (mAbs) gegen CD3 & egr; V500 (4 & mgr; l 1:20 Verdünnung / 10 ^{6 Zellen),} Anti-CD19-E450 (4 & mgr; l 1:50 Verdünnung / 10 ^{6 Zellen)} und Anti-CD8a E450 (4 ul Verdünnung 1:50 / 10 ^{6 Zellen)} in FACS-Puffer, CD5 ⁺ Lymphozyten hinzuzufügen und Inkubation für 30 min bei 4 ° C im Dunkeln.
   4. Waschen der Zellen mit 1 ml FACS-Puffer durch Zentrifugation bei 300 × g für 10 min bei 4 ° C und resuspendieren in 4 ml FACS-Puffer bei einer Endkonzentration von ¹⁰ 7 Zellen / ml.
   5. Filtern Sie die Zellen durch ein 30 & mgr; m Zellsieb und legen Sie die Zellen auf Eis.
   6. Kalibrierung des Durchflusszytometers Zellsortierung nach den Empfehlungen des Herstellers ^14,15.
      Hinweis: Kalibrierung von einem Durchflusszytometer für Zellsortierung erfordert Training und kann von einem erfahrenen Bediener oder einen ausgebildeten Techniker durchgeführt werden.
   7. Zugabe von 10 ul einer 20 uM Lösung von Arbeits DAPI pro 10 ^{6 Zellen} und Inkubieren bei Raumtemperatur für 5 min. Erwerben ^etwa 10 4 angereichert CD5 ⁺ Lymphozyten auf dem Durchflusszytometer. Elektronisch Tor auf FSC-W ^lo Zellen, Zell Dubletts und Zuschlagstoffen (2A) auszuschließen. Dann elektronisch Gate aus DAPI ^{+ CD8} + CD19 ⁺ Zellen (Dump-Kanal) innerhalb des FSC-W ^lo Bevölkerung (2B), und verwenden Sie SSC-A und FCS-A elektronisch zu wählen Lymphozyten (2C), wie in 2.1.1.1 beschrieben, .
      1. Plot αGalCer / CD1d Tetramer von CD3 & egr; und elektronisch Gate αGalCer / CD1dTetramer ⁺ CD3 & egr; ⁺ iNKT Zellen, wie in 2D gezeigt. Erwerben nicht mehr als 2 x 10 ⁵ CD5 ⁺ Lymphozyten angereichert, um den Prozentsatz zu bestimmen αGalCer / CD1d Tetramer ⁺ CD3 & egr; ⁺ iNKT Zellen in der angereicherten Zellfraktion vorhanden ist.
   8. Verwendung der elektronischen Tore in 2.2.7 erstellt., FACS sortiert αGalCer / CD1d Tetramer ⁺ CD3 & egr; ⁺ iNKT Zellen am Durchflusszytometer bei 70 psi unter Verwendung eines 70 & mgr; m Düse bei einer Flussrate von "1,5". Sammeln sortierten iNKT Zellen in einem FACS-Röhrchen mit 1 ml 100% FCS. Anschließend Spülen sortiert iNKT Zellen von der Seite der FACS-Röhrchen mit 10 ml RPMI 1640-Medium und Zentrifugation der Zellen bei 300 g 10 min bei 4 ° C.
   9. Resuspendieren sortiert iNKT Zellen in 1 ml RPMI 1640-Medium und 40 & mgr; l davon zu erwerben mit einem Durchflusszytometer, um die Reinheit der sortierten iNKT Zellen beurteilen. Wählen FSC-W ^lo DAPI ^- Lymphozytens wie in 2.2.7 beschrieben. (2E - G) und elektronisch Gate αGalCer / CD1d Tetramer ⁺ CD3 & egr; ⁺ iNKT Zellen, wie in Figur 2H gezeigt ist.

3. Kultur und Ausbau der Maus iNKT Cells

Tag 0

1. Coat eine Flachboden-96-Well-Platte mit gereinigtem anti-CD3 & egr; (3 ug / ml) pro Vertiefung für 1 h bei RT. Wasche zweimal mit 200 ul 1x PBS und einmal mit 200 ul vollständigem RPMI 1640-Medium (10% vol / vol FCS, 100 U / ml Penicillin-Streptomycin, 5,5 & mgr; M β-Mercaptoethanol).
2. Zählen die Anzahl von lebensfähigen Zellen nach iNKT (Schritt 2.2.8) unter Verwendung von 0,4% einer Zählkammer nach 1.11., Bei 300 g zentrifugiert für 10 min bei 4 ° C und resuspendieren in 5 x ¹⁰ 5 Zellen / ml in komplettem RPMI 1640-Medium, die rekombinantes murines IL-2 (10 ng / ml), rekombinantem murinem IL-12 (1 ng / ml) und löslichen Anti-Maus-CD28 (5 & mgr; g / ml). Platte sorted iNKT Zellen bei ¹⁰ 5 Zellen / Vertiefung in anti-CD3 & egr beschichteten Platten und Inkubieren bei 37 ° C in _einem CO 2 -Inkubator für 2 Tage.

Tag 2

3. Übertragen Sie die Zellen in ein frisches unbeschichteten Flachboden-96-Well-Platte und die Kultur der Zellen unter Ruhebedingungen in vollständigem RPMI-1640-Medium bei 37 ° C in _einem CO 2 -Inkubator für 2 Tage.

Tag 4

4. Verdrängen die Zellen von der Platte durch vorsichtiges Pipettieren und übertragen Sie die Zellen in ein frisches 15-ml-Tube. Zentrifuge bei 300 g 10 min bei 4 ° C, resuspendieren in 5 x ¹⁰ 5 Zellen / ml in komplettem RPMI 1640-Medium mit rekombinantem murinem IL-7 (5 ng / ml), und die Platte ¹⁰ 5 Zellen / Vertiefung in einer Flach Boden 96-Well-Platte für 4 Tage bei 37 ° C in _einem CO 2 -Inkubator.

Tag 8

5. Sammeln der Zellen in ein frisches Röhrchen, Zentrifuge bei 300 xg für 10 min bei 4 ° C und resuspendieren in 5 x ¹⁰ 5 Zellen / ml in komplettem RPMI 1640-Medium, das lösliche anti-CD28 (5 & mgr; g / ml).
6. Coat eine Flachboden-96-Well-Platte mit gereinigtem anti-CD3 & egr; (3 ug / ml) pro Vertiefung und waschen wie in 3.1. Platte 10 ⁵ Zellen / Vertiefung in anti-CD3 & egr beschichteten Platten und Inkubieren bei 37 ° C in _einem CO 2 -Inkubator bis Tag 11.

Tag 11-18

7. Wiederholen Sie die Schritte 3,4 bis 3,6.

Tag 19-20

8. Übertragen der Zellen in ein frisches 15-ml-Röhrchen, bei 300 g zentrifugiert und resuspendieren in 5 x ¹⁰ 5 Zellen / ml in vollständigem RPMI-1640-Medium.
9. Platten Zellen bei ¹⁰ 5 Zellen / Vertiefung in eine Flachboden-96-Well-Platte und damit die Zellen für 2 Tage bei 37 ° C in _einem CO 2 -Inkubator vor dem Einsatz in einem Experiment zu verwenden ruhen.

4. Zytokinproduktion durch Maus iNKT Zellen unter Verwendung eines CD1d Plate-gebundenen Assay

1. Coat eine Flachboden-96-Well-Platte mit 100 & mgr; l an rekombinantem murinem CD1d (10 ug / ml in 1x PBS) pro Well und Inkubation für 1 h bei 37 ° C.
2. Mit 200 ul 1x PBS waschen viermal mit 200 ul 2% FCS in 1x PBS (Blocklösung) pro Vertiefung und Inkubation für 2 h bei 37 ° C.
3. Entfernen Sie die Blockierlösung, fügen Sie 200 ul αGalCer (5 ng / & mgr; l) pro Vertiefung und inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C für 16 Stunden. [Zur Herstellung des αGalCer Lösung werden 1,085 μ 1x PBS auf 55 & mgr; g αGalCer in Vehikel, das 96 mg / ml Saccharose, 10 mg / ml Natriumdesoxycholat und 5 mg / ml Tween 20 gelöst].
4. Nach der Inkubation, entsorgen Sie die αGalCer Lösung und waschen Sie das auch mal mit 200 ul 1x PBS, gefolgt von 200 ul vollständigem RPMI-1640-Medium.
5. Sammeln die in vitro expandiert iNKT Zellen am Tag 21, Zentrifugation der Zellen bei 300 g 10 min bei 4 ° C und resuspendieren in komplettem RPMI-1640-Medium in einer Konzentration von 0,5 x ¹⁰ 6 Zellen / ml.
6. Fügen Sie 200 ul der Zell iNKT Resuspension pro Well und Inkubation für 72 h bei 37 ° C in _einem CO 2 -Inkubator.
7. Die überstehende Flüssigkeit und messen Zytokine von Interesse durch Enzym-gebundenen Immunosorbent-Assay (ELISA) nach dem Protokoll des Herstellers.

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Ergebnisse

Isolierung von Milz mononukleären Zellen mit einem Dichtegradienten dauert etwa 1 Stunde und eliminiert die Verwendung von Reagenzien erforderlich ist, um rote Blutkörperchen (RBCs) lysiert. Eine hohe Ausbeute an lebensfähigen Zellen unter Verwendung dieses Verfahrens und Schmutz während des Pressen des Organs entfernt erzeugten erhalten. Typischerweise liegt die Frequenz der iNKT Zellen innerhalb der Milz-Lymphozyten-Pool im Bereich zwischen 1 und 5% der gesamten T-Lymphozyten kann dies jedoch je nach Alter, Geschl...

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Diskussion

Kritische Schritte in der aktuellen Protokoll gehören die Isolierung und anschließende Anreicherung von CD5 ⁺ Lymphozyten (Abschnitt 1 & 2), FACS-Sortierung (Abschnitt 3) und die anfängliche Plattierung iNKT Zellen (Abschnitt 4). Der Schritte in Abschnitt 1 durchgeführt wird, denken Sie daran, vorsichtig Schicht die Milz-Zellsuspension über das Dichtegradienten-Medium, so dass eine deutliche zelluläre Interphase wird nach der Zentrifugation generiert. Die anschließende Bereicherung für CD5 ^+<...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material
recombinant murine IL-2	eBiosciences	14-8021
recombinant murine IL-12	eBiosciences	39-8122-65
recombinant murine IL-7	eBiosciences	14-8071
purified anti-mouse CD3e (145-2C11)	eBiosciences	16-0032-86
purified anti-mouse CD28 (37.51)	eBiosciences	16-0281-85
e450-conjugated anti-mouse CD19 (eBio1D3)	eBiosciences	48-0193-82
e450-conjugated anti-mouse CD8α (53-6.7)	eBiosciences	48-0081-82
FITC-conjugated anti-mouse CD5 (53-7.3)	eBiosciences	11-0051-81
V500-conjugated anti-mouse CD3ε (500A2)	BD biosciences	560771
anti-mouse CD5 (Ly-1) microbeads	Macs Miltenyi Biotec	130-049-301
purified anti-mouse CD16/32 (2.4G2)	Macs Miltenyi Biotec	130-092-575
MACS MS Columns	Macs Miltenyi Biotec	130-042-201
Trypan Blue, 0.4% (wt/vol)	Gibco	15250-061
RPMI 1640 medium	Gibco	12633-020
1x PBS	Gibco	10010-056	[Ca2+/Mg2+ - free]
Fetal calf serum	Gibco	10270
L-Glutamine	Gibco	25030-123
Penicillin-streptomycin	Sigma-Aldrich	P4458-100ML
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A7906-100MG
β-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma-Aldrich	EDS-1KG
Ficoll-Paque plus	GE Healthcare	71-7167-00 AF
Equipment
96-well plate F-bottom	Greiner-bio one	657-160
24-well plate	Greiner-bio one	665-180
6-well plate	Greiner-bio one	655-180
15 ml falcon tube	Greiner-bio one	188-271
50 ml falcon tube	Greiner-bio one	227-261
70 µm filter	Greiner-bio one	542-070
30 µm filter	Millipore	SVGP01050
MiniMACS separator	Macs Miltenyi Biotec	130-042-102
MS Columns	Macs Miltenyi Biotec	130-042-201
Water-jacketed CO2 incubator	VWR
Hemocytometer	VWR
Dissection Kit	VWR
BD FACSAria III	BD Biosciences