마우스 비장에서 불변 자연 살해 T 세포를 분리하고 확장을위한 최적화 방법

요약

Here we present an adapted protocol that can be used to generate a large number of murine invariant natural killer T cells from mouse spleen. The protocol outlines an approach by which splenic iNKT cells can be enriched for, isolated and expanded in vitro using a limited number of animals and reagents.

초록

급속 자극시 사이토 카인을 분비하는 능력은 불변성 자연 살해 T (하여 iNKT) 세포 계보의 기능적 특성이다. 하여 iNKT 세포 따라서 면역 반응을 활성화시키고 스티어링 적응 가능한 타고난 T 세포군으로 특징 지어진다. 뮤린하여 iNKT 세포의 배양 및 확장을위한 개선 된 기술의 개발은 시험 관내 및 생체 내 모델 시스템 인 iNKT 세포 생물학 연구를 용이하게한다. 여기에서 우리는 고립과 쥐의 비장하여 iNKT 세포의 확장을위한 최적화 된 절차를 설명합니다.

C57BL / 6 마​​우스로부터 비장을 제거하고 해부 변형하고, 생성 된 세포 현탁액을 밀도 구배 매체를 통해 적층된다. 원심 분리 후, 비장 단핵 세포 (다국적)를 수집 및 CD5 양성 (CD5 ⁺⁾ 림프구는 자성 비드를 사용하는 농축된다. CD5 ^{+ 분획} 내의하여 iNKT 세포는 계속해서 ^ 묻5; CD1d 테트라을 GalCer는로드 및 형광 활성 세포 정렬 (FACS)로 정제. FACS는 뮤린 재조합 IL-7의 존재 하에서 확장되기 전에, 재조합 쥐 사이토 플레이트 - 결합 T 세포 수용체 (TCR) 자극의 조합을 사용하여 iNKT 세포는 처음에 다음 체외 배양 정렬. 약 ¹⁰⁸ 인 iNKT 세포들은 시험 관내 기능 분석을위한, 또는 마우스 생체 내 전달 실험에 사용할 수있는 배양 후 18-20 일 내에 발생 될 수있는이 기술을 사용.

서문

쥐 불변 자연 살해 T (인 iNKT) 세포는 CD1d 발현 대뇌 피질의 흉선 세포 ^{1, 2에} 의해 흉선에서 선택한 타고난 T 림프구의 뚜렷한 인구입니다. 하여 iNKT 세포 Vβ8, Vβ7 또는 CD1d의 컨텍스트에서 내인성뿐만 아니라 외국인 지질 항원을 인식 할 수있다 Vβ2 TCR도 ³ 중 하나와 짝을 불변 Vα14-Jα18 TCR 사슬로 구성된 T 세포 수용체 (TCR)를 표현한다. 예를 들어, 뮤린하여 iNKT 세포를 인식하고 내인성 지질 항원이라는 isoglobotrihexosylceramide (iGb3) ^4뿐만 아니라, α - 갈 락토 실 (αGalCer) ^5,6- 해양 해면에서 분리 된 당지질에 의해 활성화된다. TCR은 종속 <하여 iNKT 세포의 활성화는 적응성 면역 반응의 프라이밍을 조장하고, 결과적으로하여 iNKT 세포는 류마티스 성 질환 ^(7)와 암을 포함하여 병변의 범위의 경감 또는 개발에 기능적으로 관여하는 것으로 밝혀졌다SUP> 8. 현재, 합성하여 iNKT 세포 리간드는 immunopathological 다수의 조건을 조절 할 수있다 유망한 새로운 백신 보조제를 구성한다.

이것은 이전하여 iNKT 세포 그러나 마우스 조직으로부터 분리 다음 시험 관내에서 생성 될 수 있음을 입증되었다; 이러한 연구의 많은 주요 항원 제시 세포 (APC를) 및 / 또는 세포주 ^(9)의 사용을 채택 Vα14 TCR 트랜스 제닉 (Tg)가 인 iNKT 세포 유래 하이 브리 도마 ^{(11, 12)의} 생성을위한 마우스 ^(10), 또는 흉선종. 또한, 마우스의 큰 숫자는 같은 αGalCer로드 CD1d 이량 체, 및 긴 배양 배 시약의 높은 볼륨이 일부 공개 프로토콜 덜 윤리적, 경제적으로 ^{9, 13을} 호소합니다.

이 보고서에서 우리는 고립과 마우스의 비장에서하여 iNKT 세포의 체외 확장에 적응하는 방법을 설명합니다. 구체적으로는, 프로토콜이 방법을 기술FACS 셀 소팅에 필요한 마우스, 시약 및 시간을 감소시키고, 비장 체외로 정렬하여 iNKT 세포의 확장을위한 최적화 방식이 제안 마우스 비장하여 iNKT 세포를 풍부하게.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

프로토콜

본 연구에서는 성인 (6-8 주) 여성 C57BL / 6 마​​우스를 사용 하였다. 마우스는 겐트 대학 동식물 사육장의 지침에 따라 보관 및 사육되었다. 모든 동물의 절차는 기관 동물 관리 및 윤리위원회에 의해 승인되었다.

마우스 비장에서 단핵 세포 (다국적 기업) 1. 준비

1. 자궁 전위에 의해 마우스를 희생.
2. 다시 아래로 해부 보드에 마우스를 놓고 핀 뒷다리와 앞다리를 해결.
3. 70 %로 피부 표면을 소독 (부피 / 부피) 에탄올 / H ₂ O.
4. 흉부에 복부​​ 정중선을 따라 피부를 잘라 무균 수술 도구를 사용하여 비장을 노출.
5. 주변의 지방 조직을 트리밍 한 후, 실온에서 1 ㎖의 1X 인산염 완충 식염수 (PBS)를 포함하는 24 웰 플레이트에 비장을 배치합니다.
6. 멸균 메스를 사용하여 비장을 해부하고 50 ㎖ 욕조 내에 배치 70 μm의 나일론 필터로 조각을 전송전자.
7. 2 ML의 주사기 플런저를 사용하여 부드럽게 셀 스트레이너를 통해 비장 조각 매쉬와 PBS 1X 5 ㎖로 세척한다.
8. 15 ㎖의 튜브에 피콜 - 페이크 3 ㎖를 첨가하고 5 ml의 세포 현탁액과 밀도 구배 매체를 오버레이.
9. 브레이크없이 실온에서 20 분 동안 400 XG에 원심 분리기.
10. 신선한 15 ML 튜브에 계면 이동 4 ℃에서 10 분 동안 300 XG에 10 ml의 차가운 1X PBS와 원심 분리기를 추가합니다.
11. 0.5 % 소 혈청 알부민 (BSA) 및 1mM의 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) (FACS 완충액)을 함유하는 PBS 1X 2 ml의 세포를 재현 탁. 전사 작은 튜브에 세포 현탁액 10 ㎕를 0.4 %의 10 μL와 혼합

2. 농축 검색, 마우스 인 iNKT 세포의 정화

1. 마우스 비장 CD5positive (CD5 ⁺⁾ 림프구의 농축.
   1. (선택 사항) 얼룩 10 ⁵ 세포 FITC - 복합 안티 CD5 (4 μL 1시 반 희석 / 10 ⁶ 세포)어둠 속에서 4 ° C에서 30 분, 200 μL FACS 버퍼 (500)에 재현 탁 외과 버퍼 μL 씻어. 1X PBS로 4 ', 6-diamidino -2- 페닐 인돌 (DAPI)의 20 μM 용액을 제조 작업, FACS 완충액 μL 이들에 ¹⁰⁵ 세포를 1을 추가 5 분 동안 RT에서 배양한다. 흐름 cytometer에 ¹⁰⁴ 미리 농축 세포를 취득.
      1. FCS-H와 FCS-W, 세포는 이중 집계 (그림 1A)를 제외 FSC-W ^{싸다 세포에} 전자 게이트를 사용하여. 그런 다음 전자 게이트 밖으로 DAPI ⁺ (죽은) FSC-W ^LO 인구 (그림 1B) 내에서 세포 및 전자적 크기 (그림 1C)에 의해 림프구 인구를 선택 SSC-A와 FCS-A를 사용합니다.
      2. 림프구 게이트 내의 세포를 사용하여, 대 CD5-SSC 플롯도 1D에 도시 된 바와 같이 전자적으로 게이트 CD5 ⁺ 림프구. 사이토 흐름 예비 농축 샘플의 나머지를 획득.
   2. FACS 버퍼 90 μL 당 10 ⁷ 세포에 세포 수를 조정하고 10 μL 안티 CD5 마이크로 비드를 추가합니다.
   3. 4 ML의 외과 차가운 외과 버퍼를 버퍼에 resuspend 500 μL로 한 번 씻어 15 분 동안 4 ºC에서 품어. 자기 세포 분리 (MACS)를 사용하여 CD5 ⁺ 림프구 제조업체의 권장 사항에 따라 열에 대한 풍부.
   4. FITC - 복합 안티 CD5와 선택 사항) 얼룩은 10 ⁵ 세포 (2.1.1에서와 같이 1시 반 희석 / 10 ⁶ 세포) 및 DAPI의 4 μL. 흐름 (10) ⁴ 농축 림프구 세포 계수기 획득하고 전자 게이트 2.1.1에서 만든 확인합니다. 풍부한 세포 부분에서 CD5 ⁺ 림프구를 선택합니다. 사이토 흐름에 ¹⁰⁵ 세포를 획득하고도 1E에 도시 한 바와 같이 농축 된 분획에 본 CD5 ⁺ 림프구 백분율을 분석 - H를.
2. 탐지 및 마우스 인 iNKT CE의 분리FACS로 재편.
   1. 항 CD16 / CD32을 함유하는 FACS 완충액 약 ¹⁰⁶ 개 셀 (20) 당 μL 및 PE 공역 αGalCer (1시 50분 희석 / ¹⁰⁶ 세포의 4 μL)의 농도로 농축 CD5 ⁺ 림프구를 재현 탁 / CD1d 테트라 머 (1 μg의 / 10 ⁶ 세포).
   2. 어둠 속에서 실온에서 30 분 동안 품어.
   3. 의 마우스 항체 (단클론 항체) 항 CD3ε V500 (1시 20분 희석의 4 μL / 10 ⁶ 세포), 항 CD19의 E450 (1시 50분 희석의 4 μL / 10 ⁶ 세포) 및 안티 CD8α의 E450 (4 μl를 희석 FACS 완충액 1:50 희석 / ¹⁰⁶ 개 세포), CD5 ⁺ 림프구에 추가하고 어두운 곳에서 39 ° C에서 30 분 동안 배양한다.
   4. ¹⁰⁷ 세포 / ml의 최종 농도 4 ㎖의 FACS 완충액을 4 ° C에서 10 분 동안 300 XG에 재현 탁하고 원심 분리하여 1 ML의 FACS 완충액으로 세포를 세척 하였다.
   5. 30 μm의 셀 스트레이너를 통해 세포를 필터링 및 얼음에 세포를 배치합니다.
   6. 제조업체의 권장 사항 ^{14, 15에} 따라 정렬 셀 흐름 cytometer를 보정합니다.
      주 : 셀 정렬하기위한 플로우 사이토 교정 훈련을 필요로하고 숙련 된 오퍼레이터, 또는 숙련 된 기술자에 의해 수행 될 수있다.
   7. 10 ⁶ 세포 당 DAPI의 20 μm의 작업 용액 10 μl를 추가하고 5 분 동안 실온에서 품어. 흐름 cytometer에 약 10 ⁴ 농축 CD5 ⁺ 림프구를 취득. FSC-W ^{싸다 세포에} 대한 전자적 게이트 세포는 이중 집계 (그림 2A)를 제외합니다. 그런 다음 전자 게이트 밖으로 DAPI ⁺ CD8 ⁺ FSC-W ^LO 인구 (그림 2B) 내에서 CD19 ⁺ 세포 (덤프 채널) 및 2.1.1.1에 기술 된 바와 같이 전자 림프구 (그림 2C)를 선택 SSC-A와 FCS-A를 사용 .
      1. CD3ε 및 전자 게이트 αGalCer / CD1d에 의해 플롯 αGalCer / CD1d 테트라도 2D에 도시 된 바와 같이 테트라 ^{+ +} CD3ε하여 iNKT 세포. 풍부한 세포 부분에 존재하는 비율 αGalCer를 결정하기 위해 더 이상 ⁵ 10 × 2보다 CD5 ⁺ 풍부한 림프구를 취득 / CD1d 테트라 ⁺ CD3ε ^+하여 iNKT 세포.
   8. 2.2.7에서 작성한 전자 게이트를 사용. '1.5'의 유량으로 70 ㎛의 노즐을 이용하여 70 psi에서 사이토 흐름, FACS 분류 αGalCer / CD1d 테트라 머 ^{+ +} CD3ε하여 iNKT 세포. 1 ml의 100 % FCS를 함유하는 FACS 튜브 정렬하여 iNKT 세포를 수집한다. 이어서 10 ㎖ RMPI 1640 배지 원심 4 ° C에서 10 분 동안 300 XG에 세포를 이용한 FACS 튜브의 측면에서 분류하여 iNKT 세포를 헹군다.
   9. 재현 탁은 RPMI 1640 배지 1 ㎖에 인 iNKT 세포를 분류하고 정렬하여 iNKT 세포의 순도를 평가하기 위해 유세포에 이의 40 μL를 획득. 림프구 ^- FSC-W ^LO DAPI를 선택S 2.2.7에 기술 된 바와 같이. 전자 및 게이트 αGalCer / 그림 하반기 같이 CD1d 사량 ⁺ CD3ε ^+하여 iNKT 세포 - (G 그림 2E).

3. 문화와 마우스 인 iNKT 세포의 확장

날 0

1. 코트 실온에서 1 시간 동안 잘 당 정제 방지 CD3ε (3 μg의 / ㎖)와 평평한 바닥 96 웰 플레이트. 200 μL PBS 1X 한 번 200 μL 전체 RPMI 1640 배지 (10 % 부피 /의 부피 FCS, 100 U / ml의 페니실린 - 스트렙토 마이신, 5.5 μm의 β - 머 캅토 에탄올)와 함께 두 번 씻으십시오.
2. 1.11에서 0.4 % 혈구를 이용 가능한 정렬하여 iNKT 세포 (단계 2.2.8)의 개수를 카운트. 완전 RPMI 1640 배지에서 5 × ¹⁰⁵ 세포 / ml로 4 ℃에서 10 분 동안 300 XG에서 원심 분리하고 재현 탁 재조합 쥣과 IL-2 (10 NG / ㎖), 뮤린 재조합 IL-12 (1 NG / ㎖) 및 항 - 마우스 가용성 CD28 (5 μg의 / ㎖)을 함유. 플레이트의안티 CD3ε 코팅 된 플레이트 웰에서 ¹⁰⁵ 세포 /로하여 iNKT 세포 orted 2 일 동안 CO2 _{인큐베이터에서} 37 ℃에서 배양한다.

2 일

3. 2 일 동안 CO2 _{인큐베이터에서} 37 ℃에서 완전 RPMI 1640 배지에서 신선한 무지 평저 96 웰 배양 접시에 휴식 조건 하에서 세포를 세포를 옮긴다.

4 일

4. 부드러운 피펫 팅에 의해 판에서 셀을 제거하고 새로운 15 ML 튜브에 세포를 전송합니다. 플랫 -에 ¹⁰⁵ 세포 / 웰로 4 ℃, 재조합 쥣과 IL-7 (5 NG / ㎖)을 함유하는 완전 RPMI 1640 배지에서 5 × ¹⁰⁵ 세포 / ml로 재현 탁하고, 플레이트에서 10 분 동안 300 XG에 원심 CO2 _{인큐베이터에서} 37 ℃에서 4 일 동안 96 웰 플레이트를 바닥.

8 일

5. 300 X에서 새로운 튜브에 세포를 수집, 원심 분리기수용성 항 CD28 (5 μg의 / ㎖)을 함유하는 완전 RPMI 1640 배지에서 5 × ¹⁰⁵ 세포 / ml에서 10 ℃에서 4 분, 재현 탁 대 g.
6. 코트는 물론 당 정제 방지 CD3ε (3 μg의 / ㎖)와 평평한 바닥 96 웰 플레이트와는 3.1로 씻는다. (10) ⁵ 세포 / 웰의 안티 CD3ε 코팅 플레이트와 하루 11까지 CO ₂ 배양기에서 37 ° C에서 품어.

일 11-18

7. 반복 3.4-3.6 단계를 반복합니다.

하루 19 ~ 20

8. 완전한 RPMI 1640 배지에서 5 × ¹⁰⁵ 세포 / ml로 재현 탁하고 300 XG에서 신선한 15ml의 튜브, 원심 분리기에 세포를 옮긴다.
9. 플레이트 ¹⁰⁵ 세포에서 세포 / 웰 평저 96 웰 플레이트 허용 세포 실험에 사용하기 전에 CO2 _{인큐베이터에서} 37 ℃에서 2 일 동안 휴식한다.

4. 사이토 카인 생산 CD1d 플랫을 사용하여 마우스 인 iNKT 세포에 의해전자 결합 분석

1. 코트 평평한 바닥 96 웰 아니라 당 재조합 쥐 CD1d 100 ㎕ (1X PBS에서 10 ㎍ / ㎖)와 플레이트는 37 ℃에서 1 시간 동안 배양한다.
2. , PBS 1X 200 μL로 4 회 씻어 잘 당 1X PBS (차단 솔루션)에 2 % FCS 200 μl를 추가하고 37 ℃에서 2 시간 동안 품어.
3. 블로킹 용액을 제거 αGalCer 웰 당 200 μL의 (5 NG / μL)을 추가하고, 16 시간 동안 37 ℃에서 플레이트 배양. [αGalCer 용액의 조제를 들어, 차량이 96 ㎎ / ㎖ 자당, 10 ㎎ / ㎖ 나트륨 데 옥시 콜레이트, 5 ㎎ / ㎖ 트윈 20을 포함에 용해 αGalCer 55 μg의에 1,085 μ 1X PBS를 추가].
4. 배양 후, αGalCer 솔루션을 무시하고 200 μL 전체 RPMI 1640 배지 다음 PBS 1X 200 μL로 잘 두 번 씻는다.
5. 전체 R에 원심 분리기 세포 300 XG에 10 분 동안 4 ℃에서 재현 탁하고, 21 일에 체외 확장하여 iNKT 세포를 수집0.5 × ¹⁰⁶ 세포 / ml의 농도로 PMI 1640 배지.
6. 물론 당하여 iNKT 세포의 재 부유 200 μl를 추가하고 CO ₂ 배양기에서 37 ℃에서 72 시간 동안 배양한다.
7. 제조 업체의 프로토콜에 따라 효소 연결 immunosorbant 분석 (ELISA)에 의해 관심의 상층 액과 측정 사이토 카인을 수집합니다.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

결과

밀도 구배를 사용하여 비장 단핵 세포의 분리는 약 1 시간 소요 적혈구 (적혈구)을 용해시키기 위해 요구되는 시약의 사용을 제거한다. 생존 세포의 높은 수율이 제거되고 기관의 긴장 중에 생성 방법 및이 파편을 사용하여 얻어진다. 일반적으로, 비장 림프구 풀 내하여 iNKT 세포의 주파수 사용이 동물의 연령, 성별, 건강 상태에 따라 달라질 수 있으나 전체 T 림프구의 1 % 내지 5의 범위이다. 약

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

토론

현재 프로토콜의 중요한 단계는 분리 및 CD5 ⁺ 림프구 (제 1 & 2)의 후속 농축, FACS 정렬 (섹션 3)하여 iNKT 세포의 초기 도금 (4 절)를 포함한다. 섹션 1에서 수행 된 단계 신중 별개 셀룰러 상간 원심 다음 생성되도록 밀도 구배 매질을 통해 비장 세포 현탁액을 층에 기억한다. 자기 세포 분리 (제 2 항)에 의해 CD5 ⁺ 림프구의 후속 농축은 얼룩에 필요한 시약 및 시간을 최소화 및 증가하...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material
recombinant murine IL-2	eBiosciences	14-8021
recombinant murine IL-12	eBiosciences	39-8122-65
recombinant murine IL-7	eBiosciences	14-8071
purified anti-mouse CD3e (145-2C11)	eBiosciences	16-0032-86
purified anti-mouse CD28 (37.51)	eBiosciences	16-0281-85
e450-conjugated anti-mouse CD19 (eBio1D3)	eBiosciences	48-0193-82
e450-conjugated anti-mouse CD8α (53-6.7)	eBiosciences	48-0081-82
FITC-conjugated anti-mouse CD5 (53-7.3)	eBiosciences	11-0051-81
V500-conjugated anti-mouse CD3ε (500A2)	BD biosciences	560771
anti-mouse CD5 (Ly-1) microbeads	Macs Miltenyi Biotec	130-049-301
purified anti-mouse CD16/32 (2.4G2)	Macs Miltenyi Biotec	130-092-575
MACS MS Columns	Macs Miltenyi Biotec	130-042-201
Trypan Blue, 0.4% (wt/vol)	Gibco	15250-061
RPMI 1640 medium	Gibco	12633-020
1x PBS	Gibco	10010-056	[Ca2+/Mg2+ - free]
Fetal calf serum	Gibco	10270
L-Glutamine	Gibco	25030-123
Penicillin-streptomycin	Sigma-Aldrich	P4458-100ML
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A7906-100MG
β-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma-Aldrich	EDS-1KG
Ficoll-Paque plus	GE Healthcare	71-7167-00 AF
Equipment
96-well plate F-bottom	Greiner-bio one	657-160
24-well plate	Greiner-bio one	665-180
6-well plate	Greiner-bio one	655-180
15 ml falcon tube	Greiner-bio one	188-271
50 ml falcon tube	Greiner-bio one	227-261
70 µm filter	Greiner-bio one	542-070
30 µm filter	Millipore	SVGP01050
MiniMACS separator	Macs Miltenyi Biotec	130-042-102
MS Columns	Macs Miltenyi Biotec	130-042-201
Water-jacketed CO2 incubator	VWR
Hemocytometer	VWR
Dissection Kit	VWR
BD FACSAria III	BD Biosciences