Un metodo ottimizzato per l'isolamento ed espansione invariante Natural Killer cellule T da Spleen mouse

Riepilogo

Here we present an adapted protocol that can be used to generate a large number of murine invariant natural killer T cells from mouse spleen. The protocol outlines an approach by which splenic iNKT cells can be enriched for, isolated and expanded in vitro using a limited number of animals and reagents.

Abstract

La capacità di secernere rapidamente citochine dopo stimolazione è una caratteristica funzionale del invariante natural killer T (iNKT) linea cellulare. iNKT cellule sono quindi caratterizzati da una popolazione di cellule T innata capace di attivare e sterzo adattivo risposte immunitarie. Lo sviluppo di tecniche migliorate per la coltura e l'espansione di cellule murine iNKT facilita lo studio della biologia cellulare iNKT in vitro ed in sistemi modello in vivo. Qui si descrive un procedimento ottimizzato per l'isolamento e l'espansione di cellule spleniche iNKT murine.

Milza di topi C57BL / 6 vengono rimossi, sezionati e tese e la sospensione cellulare risultante è stratificato su supporti gradiente di densità. Dopo la centrifugazione, le cellule mononucleate spleniche (MNC) sono raccolti e CD5 positivi (CD5 ⁺⁾ linfociti sono arricchiti per l'utilizzo di sfere magnetiche. cellule iNKT all'interno della frazione CD5 ⁺ sono successivamente colorate con ^5; GalCer-caricato CD1d tetramero e purificata mediante la fluorescenza delle cellule attivate (FACS). FACS ordinati cellule iNKT sono quindi inizialmente coltivate in vitro utilizzando una combinazione di citochine ricombinanti murine e recettore delle cellule T piastriforme bound (TCR) stimoli prima di essere espanso in presenza di IL-7 murina ricombinante. Utilizzando questa tecnica, di circa 10 ⁸ cellule iNKT possono essere generati entro 18-20 giorni di coltura, dopo di che possono essere utilizzate per saggi funzionali in vitro o in vivo per esperimenti di trasferimento nei topi.

Introduzione

Murino invarianti natural killer T (iNKT), le cellule sono una popolazione distinta di linfociti T innate selezionati nel timo by-CD1d esprimendo timociti corticali ^1,2. iNKT cellule esprimono un recettore delle cellule T (TCR) costituito da una catena invariante Vα14-Jα18 TCR accoppiato con entrambi Vβ8, Vβ7 o Vβ2 TCR ^{3, che è} in grado di riconoscere endogena così come antigeni estranei lipidi nel contesto CD1d. Per esempio, le cellule murine iNKT riconoscono e sono attivati ​​da un antigene chiamato isoglobotrihexosylceramide lipidica endogena (iGb3) ^4, nonché α-galactosylceramide (αGalCer) ^5,6, un glicolipide isolato da spugne marine. TCR-dipendente attivazione delle cellule iNKT promuove il priming delle risposte immunitarie adattative, e come risultato, le cellule iNKT hanno dimostrato di essere funzionalmente coinvolti nel miglioramento o lo sviluppo di una serie di patologie comprese malattia reumatica ⁷ e cancro ^{8. Attualmente, ligandi di cellule iNKT sintetiche costituiscono promettenti nuovi coadiuvanti che possono essere in grado di regolare una serie di condizioni immunopatologiche.}

È stato precedentemente dimostrato che le cellule iNKT possono essere generati in vitro dopo isolamento dal tessuto del mouse tuttavia; molti di questi studi impiegano l'uso di cellule primarie presentanti l'antigene (APC) e / o linee cellulari ^9, Vα14 TCR transgenici (Tg) topi ^10, timomi o per la generazione di cellule derivate iNKT ibridomi ^11,12. Inoltre, un gran numero di topi, elevati volumi di reagenti, quali dimeri CD1d αGalCer-caricati, e tempi lunghi di cultura fanno alcuni protocolli pubblicati meno eticamente ed economicamente accattivante ^9,13.

In questo rapporto si descrive un metodo adatto per l'isolamento e l'espansione delle cellule iNKT vitro da topo milza. Più specificamente, il protocollo descrive un metodoper arricchire le cellule iNKT da milza del mouse che riduce i topi, i reagenti e il tempo richiesto per l'ordinamento delle cellule FACS, e propone un approccio ottimizzato per espandere le cellule iNKT milza ordinati in vitro.

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Protocollo

In questo studio, sono stati utilizzati per adulti (6-8 settimane) femmina C57BL / 6 topi. I topi sono stati ospitati e allevati secondo le linee guida del vivaio Università di Gand. Tutte le procedure di animali sono stati approvati dalla cura degli animali e Comitato Etico Istituzionale.

1. Preparazione di cellule mononucleate (MNC) da Spleen mouse

1. Sacrifica il mouse per dislocazione cervicale.
2. Posizionare il mouse verso il basso sul tavolo di dissezione e fissare la cerva e zampe anteriori con perni.
3. Sterilizzare la pelle-superficie con il 70% (v / v) di etanolo / H ₂ O.
4. Tagliare la pelle lungo la linea mediana addominale al torace ed esporre la milza con strumenti chirurgici sterili.
5. Dopo il taglio dei tessuti grassi circostanti, posizionare la milza in una piastra da 24 pozzetti contenenti 1 ml di 1x tampone fosfato salino (PBS) a temperatura ambiente.
6. Sezionare la milza con un bisturi sterile e trasferire i pezzi in un filtro di nylon 70 micron collocato all'interno di una vasca 50 mle.
7. Usando una 2 ml stantuffo della siringa, schiacciare delicatamente i pezzi milza attraverso il filtro delle cellule e lavare con 5 ml di PBS 1X.
8. Aggiungere 3 ml di Ficoll-Paque in una provetta da 15 ml e sovrapporre il mezzo gradiente di densità con la sospensione cellulare 5 ml.
9. Centrifugare a 400 xg per 20 min a temperatura ambiente senza freno.
10. Trasferire il interfase a un nuovo tubo da 15 ml, aggiungere 10 ml di freddo PBS 1X e centrifugare a 300 xg per 10 minuti a 4 ° C.
11. Risospendere le cellule in 2 ml di PBS 1x contenente 0,5% di albumina di siero bovino (BSA) e 1 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) (tampone FACS). Trasferire 10 ml di sospensione cellulare in un piccolo tubo, mescolare con 10 ml di 0,4%

2. Arricchimento, rilevamento e purificazione delle cellule del mouse iNKT

1. Arricchimento di topo milza CD5positive (CD5 ⁺⁾ linfociti.
   1. (Opzionale) Stain 10 ⁵ cellule con FITC-coniugato anti-CD5 (4 ml di 1:30 diluizione / 10 ⁶ celle)per 30 minuti a 4 ° C al buio, lavare con 200 ml FACS buffer e risospendere in 500 microlitri di buffer FACS. Preparare una soluzione di lavoro 20 mM di 4 ', 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) in PBS 1x, aggiungere 1 ml della stessa a 10 ⁵ cellule in tampone FACS e incubare a temperatura ambiente per 5 min. Acquisire 10 ⁴ cellule pre-arricchito sul citofluorimetro.
      1. Utilizzando FCS-H e FCS-W, cancello elettronico su cellule ^Lo FSC W di escludere doppietti cellulari e aggregati (Figura 1A). Allora cancello elettronico fuori DAPI ⁺ (morti), le cellule all'interno del FSC W ^lo popolazione (Figura 1B), e utilizzano SSC-A e FCS-A per selezionare elettronicamente la popolazione linfocitaria per dimensione (Figura 1C).
      2. Utilizzando cellule all'interno del gate linfocitario, tracciare SSC-A contro CD5 e elettronicamente cancello CD5 ⁺ linfociti come mostrato nella Figura 1D. Acquisire il resto del campione pre-arricchito sul citometro a flusso.
   2. Regolare conta delle cellule a 10 ⁷ cellule per 90 microlitri di buffer di FACS e aggiungere 10 microlitri anti-CD5 microsfere.
   3. Incubare a 4 ° C per 15 minuti, lavare una volta con 4 ml FACS tampone e risospendere in 500 microlitri di buffer FACS freddo. Arricchisci per CD5 ⁺ linfociti con separazione delle cellule magnetico (MACS) colonne secondo le raccomandazioni del fabbricante.
   4. Opzionale) Macchia 10 ⁵ cellule con FITC-coniugato anti-CD5 (4 l di diluizione 1:30 / 10 ⁶ celle) e DAPI come in 2.1.1. Acquisire 10 ⁴ linfociti arricchite sul citofluorimetro e verificare che i varchi elettronici creati al punto 2.1.1. selezionare CD5 ⁺ linfociti nel frazione cellulare arricchito. Acquisire 10 ⁵ cellule sul citometro a flusso e analizzare la percentuale CD5 ⁺ linfociti presenti nella frazione arricchita come mostrato nella Figura 1E - H.
2. Rilevamento e isolamento di topo iNKT cells di FACS.
   1. Risospendere CD5 ⁺ linfociti arricchiti ad una concentrazione di circa 10 ⁶ cellule per 20 microlitri tampone FACS contenente in anti-CD16 / CD32 (4 ml di diluizione 1:50 / 10 ^{6 cellule)} e αGalCer PE-coniugato / CD1d tetramero (1 mg / 10 ^{6 cellule).}
   2. Incubare per 30 minuti a RT al buio.
   3. Diluire anticorpi murini (mAbs) anti-CD3ε V500 (4 ml di 1:20 diluizione / 10 ⁶ celle), anti-CD19 E450 (4 l di diluizione 1:50 / 10 ⁶ celle) e anti-CD8α E450 (4 ml di 1:50 / 10 ^{6 cellule)} in tampone FACS, aggiungi CD5 ⁺ linfociti e incubare per 30 min a 4 ° C al buio.
   4. Lavare le cellule con 1 ml tampone FACS per centrifugazione a 300 xg per 10 min a 4 ° C e risospendere in 4 ml di tampone FACS ad una concentrazione finale di 10 ⁷ cellule / ml.
   5. Filtrare le cellule attraverso un colino cella 30 micron e posizionare le cellule in ghiaccio.
   6. Calibrare il citofluorimetro per la cella di smistamento secondo le raccomandazioni del costruttore ^14,15.
      Nota: Calibrazione di un citometro di flusso per l'ordinamento delle cellule richiede una formazione e può essere eseguita da un operatore esperto, o un tecnico specializzato.
   7. Aggiungere 10 ml di una soluzione di lavoro 20 pM di DAPI per 10 ^{6 cellule} e incubare a temperatura ambiente per 5 min. Acquisire circa ¹⁰ 4 CD5 ⁺ linfociti arricchito sul citofluorimetro. Elettronicamente cancello cellule ^Lo FSC-W escludere doppietti cellulari e aggregati (Figura 2A). Allora cancello elettronico fuori DAPI ⁺ CD8 ⁺ CD19 ⁺ cellule (canale di scarico) all'interno del FSC W ^lo popolazione (Figura 2B), e utilizzare SSC-A e FCS-A per selezionare elettronicamente linfociti (Figura 2C), come descritto nella 2.1.1.1 .
      1. Trama αGalCer / CD1d tetramero da CD3ε ed elettronicamente cancello αGalCer / CD1dcellule tetramero ⁺ CD3ε ⁺ iNKT come mostrato nella Figura 2D. Cellule presenti nella frazione cellulare arricchita acquistare più del 2 x 10 ⁵ CD5 ⁺ linfociti arricchiti per determinare la percentuale αGalCer / CD1d tetramero ⁺ CD3ε ⁺ iNKT.
   8. Utilizzando i varchi elettronici creati in 2.2.7., Le cellule FACS sorta αGalCer / CD1d tetramero ⁺ CD3ε ⁺ iNKT sul citofluorimetro a 70 psi utilizzando un ugello di 70 micron ad un flusso di '1.5'. Raccogliere le cellule iNKT ordinati in una provetta contenente 1 ml FACS 100% FCS. Successivamente lavare cellule iNKT filtrate dal lato del tubo FACS utilizzando 10 ml RMPI 1640 e centrifugare le cellule a 300 xg per 10 min a 4 ° C.
   9. Risospendere allineati cellule iNKT in 1 ml RPMI 1640 medium e acquisire 40 microlitri dello stesso su un citofluorimetro per valutare la purezza delle cellule iNKT ordinati. Selezionare FSC-W ^lo DAPI ^- linfocitis come descritto in 2.2.7. (Figura 2E - G) ed elettronicamente cancello αGalCer / CD1d cellule tetramero ⁺ CD3ε ⁺ iNKT come mostrato nella Figura 2H.

3. Cultura ed espansione di cellule iNKT mouse

Giorno 0

1. Cappotto una piastra da 96 pozzetti a fondo piatto con purificata anti-CD3ε (3 mg / ml) per pozzetto per 1 ora a temperatura ambiente. Lavare due volte con 200 microlitri di PBS 1x e una volta con 200 microlitri completa terreno RPMI 1640 (10% vol / vol FCS, 100 U / ml di penicillina-streptomicina, 5.5 mM β-mercaptoetanolo).
2. Contare il numero di cellule vitali filtrate iNKT (fase 2.2.8) utilizzando un emocitometro 0,4% come 1.11., Centrifugare a 300 xg per 10 min a 4 ° C e risospendere a 5 x 10 ⁵ cellule / ml in RPMI completo 1640 contenente ricombinante IL-2 murino (10 ng / ml), ricombinante murino IL-12 (1 ng / ml) e solubile CD28 anti-topo (5 mg / ml). Piastreorted cellule iNKT a 10 ⁵ cellule / pozzetto in piastre rivestite anti-CD3ε e incubare a 37 ° C in un incubatore CO ₂ per 2 giorni.

Giorno 2

3. Trasferire le cellule ad una non rivestito 96 pozzetti a fondo piatto fresco e coltura delle cellule in condizioni di riposo in completo RPMI 1640 medium a 37 ° C in un incubatore CO ₂ per 2 giorni.

Giorno 4

4. Rimuovere le cellule dalla piastra delicatamente pipettando e trasferire le cellule a una nuova provetta da 15 ml. Centrifugare a 300 xg per 10 min a 4 ° C, risospendere a 5 x 10 ⁵ cellule / ml in RPMI completo 1640 medium contenente ricombinante IL-7 murina (5 ng / ml), e la piastra 10 ⁵ cellule / pozzetto in una piatta fondo 96 pozzetti per 4 giorni a 37 ° C in un incubatore CO _2.

Giorno 8

5. Raccogliere le cellule in una nuova provetta, centrifugare a 300 xg per 10 min a 4 ° C e risospendere a 5 x 10 ⁵ cellule / ml in RPMI completo 1640 medium contenente solubile anti-CD28 (5 mg / ml).
6. Cappotto una piastra da 96 pozzetti a fondo piatto con purificata anti-CD3ε (3 mg / ml) per bene e lavare come in 3.1. Piatto 10 ⁵ cellule / pozzetto in piastre anti-CD3ε rivestiti e incubare a 37 ° C in un _incubatore CO 2 fino al giorno 11.

Giorno 11-18

7. Ripetere i passaggi 3,4-3,6.

Giorno 19-20

8. Trasferire le cellule ad un nuovo tubo 15 ml, centrifugare a 300 xg e risospendere a 5 x 10 ⁵ cellule / ml in RPMI 1640 medium completo.
9. Cellule piastra a 10 ⁵ cellule / pozzetto in una piastra da 96 pozzetti a fondo piatto e permettere alle cellule di riposare per 2 giorni a 37 ° C in un incubatore CO ₂ prima dell'uso in un esperimento.

4. citochine da parte delle cellule iNKT mouse usando una CD1d Plate-bound Assay

1. Cappotto una piastra da 96 pozzetti a fondo piatto con 100 ml di murino ricombinante CD1d (10 mg / ml in PBS 1x) per pozzetto e incubare per 1 ora a 37 ° C.
2. Lavare quattro volte con 200 microlitri di PBS 1x, aggiungere 200 ml di 2% FCS in PBS 1x (soluzione bloccante) per pozzetto ed incubare per 2 ore a 37 ° C.
3. Rimuovere la soluzione di saturazione, aggiungere 200 ml di αGalCer (5 ng / mL) per ogni bene, e incubare la piastra a 37 ° C per 16 ore. [Per la preparazione della soluzione αGalCer, aggiungere 1.085 μ 1x PBS a 55 mg di αGalCer sciolto in mezzo contenente 96 mg / ml di saccarosio, 10 mg / ml di sodio desossicolato e 5 mg / ml di Tween 20].
4. Dopo l'incubazione, scartare la soluzione αGalCer e lavare il ben due volte con 200 microlitri PBS 1x seguito da 200 ml completo RPMI 1640 medie.
5. Raccogliere le cellule iNKT espanse in vitro a giorno 21, centrifugare le cellule a 300 xg per 10 min a 4 ° C e risospendere in completa RPMI 1640 ad una concentrazione di 0,5 x 10 ⁶ cellule / ml.
6. Aggiungere 200 ml di risospensione delle cellule iNKT per pozzetto e incubare per 72 ore a 37 ° C in un incubatore CO _2.
7. Raccogliere il surnatante e misura citochine di interesse da parte di immunoassorbimento enzyme-linked assay (ELISA) secondo il protocollo del produttore.

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Risultati

L'isolamento delle cellule mononucleari spleniche mediante gradiente di densità richiede circa 1 ora ed elimina l'uso di reagenti necessari per la lisi dei globuli rossi (RBC). Un alto rendimento di cellule vitali è ottenuto utilizzando questo metodo e detriti generati durante sforzare dell'organo viene rimosso. Tipicamente, la frequenza di cellule iNKT nel pool di linfociti splenici compresa tra 1 e 5% del totale di linfociti T tuttavia, questo può variare a seconda dello stato età, il sesso e la salute...

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Discussione

Passaggi critici nel protocollo corrente comprendono l'isolamento e successivo arricchimento di linfociti CD5 ⁺ (Sezione 1 e 2), FACS ordinamento (sezione 3) e il fasciame iniziale di cellule iNKT (sezione 4). Dei provvedimenti nella Sezione 1, ricordarsi di strato con attenzione la sospensione cellulare milza nel medio gradiente di densità tale che un interfasica cellulare distinta viene generato dopo la centrifugazione. La successiva arricchimento per CD5 ⁺ linfociti di separazione cellulare...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material
recombinant murine IL-2	eBiosciences	14-8021
recombinant murine IL-12	eBiosciences	39-8122-65
recombinant murine IL-7	eBiosciences	14-8071
purified anti-mouse CD3e (145-2C11)	eBiosciences	16-0032-86
purified anti-mouse CD28 (37.51)	eBiosciences	16-0281-85
e450-conjugated anti-mouse CD19 (eBio1D3)	eBiosciences	48-0193-82
e450-conjugated anti-mouse CD8α (53-6.7)	eBiosciences	48-0081-82
FITC-conjugated anti-mouse CD5 (53-7.3)	eBiosciences	11-0051-81
V500-conjugated anti-mouse CD3ε (500A2)	BD biosciences	560771
anti-mouse CD5 (Ly-1) microbeads	Macs Miltenyi Biotec	130-049-301
purified anti-mouse CD16/32 (2.4G2)	Macs Miltenyi Biotec	130-092-575
MACS MS Columns	Macs Miltenyi Biotec	130-042-201
Trypan Blue, 0.4% (wt/vol)	Gibco	15250-061
RPMI 1640 medium	Gibco	12633-020
1x PBS	Gibco	10010-056	[Ca2+/Mg2+ - free]
Fetal calf serum	Gibco	10270
L-Glutamine	Gibco	25030-123
Penicillin-streptomycin	Sigma-Aldrich	P4458-100ML
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A7906-100MG
β-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma-Aldrich	EDS-1KG
Ficoll-Paque plus	GE Healthcare	71-7167-00 AF
Equipment
96-well plate F-bottom	Greiner-bio one	657-160
24-well plate	Greiner-bio one	665-180
6-well plate	Greiner-bio one	655-180
15 ml falcon tube	Greiner-bio one	188-271
50 ml falcon tube	Greiner-bio one	227-261
70 µm filter	Greiner-bio one	542-070
30 µm filter	Millipore	SVGP01050
MiniMACS separator	Macs Miltenyi Biotec	130-042-102
MS Columns	Macs Miltenyi Biotec	130-042-201
Water-jacketed CO2 incubator	VWR
Hemocytometer	VWR
Dissection Kit	VWR
BD FACSAria III	BD Biosciences