前臨床患者由来の腫瘍新規抗がん療法の調査のための異種移植モデルの開発とメンテナンス

要約

皮下前臨床モデルで患者由来の腫瘍を利用する新しい治療法、予測バイオマーカーの発見、および薬剤耐性経路の有効性を研究するための優れた方法です。このモデルは、薬物開発プロセスにおいて、臨床試験の前に、多くの新規抗癌療法の運命を決定する上で不可欠です。

要約

Patient derived tumor xenograft (PDTX) models provide a necessary platform in facilitating anti-cancer drug development prior to human trials. Human tumor pieces are injected subcutaneously into athymic nude mice (immunocompromised, T cell deficient) to create a bank of tumors and subsequently are passaged into different generations of mice in order to maintain these tumors from patients. Importantly, cellular heterogeneity of the original tumor is closely emulated in this model, which provides a more clinically relevant model for evaluation of drug efficacy studies (single agent and combination), biomarker analysis, resistant pathways and cancer stem cell biology. Some limitations of the PDTX model include the replacement of the human stroma with mouse stroma after the first generation in mice, inability to investigate treatment effects on metastasis due to the subcutaneous injections of the tumors, and the lack of evaluation of immunotherapies due to the use of immunocompromised mice. However, even with these limitations, the PDTX model provides a powerful preclinical platform in the drug discovery process.

概要

大腸癌（CRC）は、米国における癌死亡に多大な貢献です。 2015年には、49700人が死亡¹とCRCの推定132700新たな症例がありました。限局性疾患を有する患者における予後は良好であるが、進行した疾患を有する患者は、新しい治療法の開発に、この主要な優先順位を作り、予後不良を持っています。この疾患に対してデプロイされているケアの化学療法レジメンと新しい生物製剤の標準にもかかわらず、全体的な生存率の増分のみ増加しています。従って、この疾患における腫瘍増殖の促進に関与するドライバの経路を理解するのに多大な努力があります。 WNT、PI3キナーゼ（PI3K）、RAS、成長因子β（TGF-βの）とTP53 ^2を変換する：がんゲノムアトラスネットワークは最近、CRCの調節不全に関与し、含まれている多数の主な経路を特定しています。一緒に、OTを記述調査でCRCの成長を増強する彼女の経路は大きく、この患者集団^3-5の生存率の改善を目的とした新しい治療法の開発に火をつけています。腫瘍学の薬剤開発における利用前臨床モデルでは、これらの新規化合物の臨床活性を予測するには、このプロセスに不可欠でした。

種々の前臨床モデルは、薬物開発プロセスで利用されてきました。前臨床のトランスジェニック動物モデルおよび細胞株は、主としてヒト腫瘍の複雑さを反映することができないことに、新規な腫瘍治療薬の臨床活性を決定するのに成功していない不死化することを考慮すると、患者由来の腫瘍異種移植片（PDTX）モデルが確立されています。このモデルの最大の利点は、腫瘍の不均一性が損なわれないままと密接に元患者の腫瘍^6-9の分子特性およびクローン性を反映していることです。 PDTXモデルは、in vivoで優れを提供します新規な薬剤を研究するための前臨床プラットフォーム、薬剤耐性経路、組み合わせ戦略、がん幹細胞生物学^10。

PDTXプロセスの概要を図1に示されている。これは、その過剰な腫瘍組織のいくつかは、この研究のために使用することができるように患者の同意、診療所で始まります。次に、手術で腫瘍の作品は、病理学者によって儲けされ、研究員に輸送するメディアに入れました。その直後に、腫瘍の部分を小片に切断され、免疫不全マウスの皮下に移植します。腫瘍が成長すると、それは腫瘍^10を維持するために、マウスの異なる世代に継代されます。典型的には、F3世代後の腫瘍は、新規な化合物および/または組み合わせ治療が評価される処置試験に拡張することができます。利用次世代のSeq（ExomeのSeq、RNAのSeqおよびSNPアレイ）の潜在的な予測バイオマーカーが発見されています特定の治療から利益を得ることができる患者の選択を支援編。

1）単剤として、または組み合わせて新しい治療法の有効性を評価し、2）前臨床研究への感受性または耐性を予測するバイオマーカーを同定：PDTXモデルを使用しての包括的な目標はにあります。本稿では、我々は、CRC PDTXバンクの開始および維持における方法論を提供し、薬剤開発の発見で、このモデルの利点と限界を提供します。

CRC PDTXモデル議定書の 図1. 概要。患者由来の腫瘍は手術から受信し、すぐに皮下無胸腺ヌードマウスに注射されます。腫瘍が成長したら、それが次の世代へと拡大し、最終的には治療の研究のために拡張されます。治療RESPONSEが評価され、予測バイオマーカーは、患者の選択を助けることができることが確認されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

プロトコル

倫理文：患者由来の結腸直腸腺癌の腫瘍標本は、コロラド州の複数の治験審査委員会によって承認されたプロトコル（08から0439）に従ったコロラド大学病院で患者を同意から得ました。全ての動物作業はコロラド州デンバー施設内動物管理使用委員会（IACUC、プロトコル＃51412（06）1E及び96813（04）1E）の大学によって承認された動物プロトコルの下で行いました。

1.患者の血液を受信し、準備

1. 1集める2 - クエン酸ナトリウムを含む血液/細胞分離管中の血液のミリリットル（血漿、リンパ球および単球バンド、密度勾配液、ゲル障壁、ならびに赤血球および好中球が含まれるチューブ相です）。注意、血液または組織と血液由来病原体のガイドラインに従ってください。
   注：PBMCおよび血漿を含むことができる将来の研究のために使用することができる。circulaを単離し、腫瘍突然変異と生殖細胞系の遺伝的変化を比較することタンパク質およびマイクロRNAを調べる細胞遊離DNA（cfDNA）、 などを評価ティン腫瘍細胞、。
2. RTでブレーキなしで15分間、2500×gで遠心分離血液/細胞分離管。
3. 末梢血単核細胞（管のリンパ球および単球帯域でのPBMC）を収集し、1.5 mlのマイクロ遠心チューブに入れ（クリアオートクレーブ可能、DNアーゼ、RNアーゼ、および発熱物質を含まない）、および滅菌リン酸緩衝と管の上部に記入生理食塩水（PBS）。
   1. 室温で3分間、2,300×gで遠心分離管の底部でのPBMCのペレットを形成します。次に、上清を注意深く取り除きます。 30秒間3000×gでペレットと遠心分離機を洗浄した後、上清を除去するために、滅菌PBSの1ミリリットルを追加します。
4. 無菌極低温バイアル（DNアーゼおよびRNaseフリー、ノーヒトDNA、エンドトキシンを含まない）1.5ミリリットル中（チューブのプラズマ相に）血液/細胞分離管から血漿を収集するために、ピペットを使用し、中にPMBCのプラズマとペレットを入れます-80°C Fストレージ用reezer。

2.患者の腫瘍サンプルを受信し、準備

1. 準備RPMIまたはDMEM培地1で次のいずれかのペニシリン - ストレプトマイシンおよび非必須アミノ酸の100（10％）、1：1000（1％）Plasmocin、及び10％不活性化ウシ胎児血清（完全培地）と追加20から25腫瘍標本のための滅菌コレクションカップにミリリットル。
2. 氷の上で完全培地を含む無菌カップに腫瘍サンプルを取得するか、4℃で維持。
   注：腫瘍試料は、外科医によって除去病理学者によって処理され、完全なメディアとの無菌コレクションカップに配置され、過剰な患者の腫瘍組織の一部です。注意、血液または組織と血液由来病原体のガイドラインに従ってください。また、理想的には5匹のマウスを注入するために、腫瘍は約1cm³でなければなりません。
3. 免疫不全マウスに注入するための動物施設に腫瘍サンプルを持参してください。
   注：これは、できるだけ早く腫瘍サンプルを処理するのが最善です。
   1. 層流フードでは、腫瘍カップから滅菌プラスチック切削皿に腫瘍サンプルを配置します。ゼラチン状のタンパク質の混合液300μlで満たしたオートクレーブし1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに約12 3×3×3ミリメートル片と場所を - 10にカットするためにオートクレーブし、小さなハサミとピンセットを使用してください。チューブを氷上に保管してください。
   2. 優先順位としてはマウスに腫瘍を注入したが、残された腫瘍が、存在する場合、フラッシュ凍結バイアル（FF）、ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）カップ、および生存腫瘍バイアルを収集します。
   3. FFの場合、このようなタンパク質、RNA、またはDNAの単離などのさらなる分析のための無菌極低温バイアルから腫瘍組織の小片を収集します。 -80℃の冷凍庫で長期を置きFF直ちに液体窒素デュワーへと格納します。
   4. 十分な腫瘍がある場合、腫瘍は、少なくとも24時間ホルマリンでいったんFFPEのために、パラフィン包埋ブロックに10ミリリットル10％ホルマリンカップとプロセスに3小片を配置します。
      注：24時間が基づいています私たちの組織学コア・提案¹¹オフ。
   5. 最後に、極低温管に残っている腫瘍を配置します。メディアを完了するために、10％ジメチルスルホキシド（DMSO）を添加することによって実行可能なメディアを作ります。次に、極低温管に1ミリリットルを追加し、氷上で保存します。注意：長時間氷上に保管しないでください。
      1. 10腫瘍が将来的に5匹のマウスに注入するために理想的に十分でしょう小片に残った腫瘍をカット。それはイソプロピルアルコール冷凍コンテナ（ゆっくり時間に腫瘍1℃をフリーズ）に入れ、-80℃の冷凍庫に入れることができるようになるまで、その後、腫瘍は中に死亡しないことを確実にするために氷の上で生存腫瘍チューブを配置凍結プロセス。
         注：長期保存のために腫瘍が除去される（2の後 - 3日）と大きな液体窒素デュワーに入れました。マウスに注入するために取り出されている場合を除き実行可能なチューブが解凍させてはならないことに注意してください。

3。患者由来の腫瘍異種移植片の注射

1. 各個別の患者由来の腫瘍のために8週齢の雄および/または雌無胸腺ヌードマウス（欠損T細胞） - 5 6を使用してください。 10腫瘍（マウス当たり2回の注射）皮下（SQ）の合計を注入します。
   注：元のヒト腫瘍は、F0として指定され、その後、いったん次の世代がF1であるマウスに注射します。また、それぞれのユニークな外植オートクレーブ鉗子、はさみ、およびトロカールを使用します。
2. オートクレーブ処理12のGトロカールにゲル状のタンパク質の混合溶液からの腫瘍の負荷片とは、腫瘍が完全にトロカール内に押し込まれることを確認してください。
   1. 無菌層流フードでは、イソフルラン麻酔マシンに接続されている麻酔ボックスに5匹のマウスを置く（麻酔の維持のために3％イソフルラン - - 4％の酸素、および2 5％イソフルラン、3の初期速度で開始）そして、チャコールフィルター（過剰なガスを吸収します）。
      注：経験豊富な技術者が上の全体の手順を実行することができるはずです約5分間の合計（マウス当たり約30秒）内の5匹のマウスのケージ。そのため、追加の熱支援や目の潤滑が一般的に使用されていません。経験の少ない個人またはトレーニング中に、非常に個人が一度に少ない動物での手順を実行し、および/または動物が5分よりも長く麻酔される場合は手順の間に温暖化パッド/アイ・潤滑を使用することを推奨します。手順は、私たちの大学のIACUC基準に基づいています。
3. マウスはもはや応答であることを確認しないために、マウスのつま先をつまんで、その後、イソフルランボックスの外にマウスを取ります。腹部はオートクレーブ処理12のGトロカールに到達するまで、中央の背側頸部とダウン皮下トロカールをスライド上の腫瘍を注入するためにクリーンなフィールドの上にマウスを置きます。
   1. マウスの脇腹の各側に1つの腫瘍皮下を提供します。腫瘍が希望脇腹領域に留まることを確実にすること、トロカールを引き抜く際、腫瘍ピンチ。 GElatinousタンパク質混合物は、マウスの体温で硬化し、腫瘍の成長を助けるとSQ結合組織に固定するために約1週間腫瘍をカプセル化します。トロカールによって作られた病変は、4ミリメートルよりも大きくないとステープルで皮膚を閉鎖する必要はありません。
      注意：私たちの獣医師にはクロージャが病変の非常に小さなサイズ、迅速な治癒時間（ミドル背側ネック領域は、病変の任意の皮膚の張りやグルーミングを低下させる）、何の感染は認められなかっし、この期間中に動物の綿密なモニタリングに基づいて必要とされない決定。
4. マウスは、メロキシカムを2mg / kgのSQ（鎮痛剤）離れた腫瘍注射部位から完全に目を覚まして注入される前に。次に、ケージにマウスを置き、マウスが目を覚ましと移動されるまで監視します。
   注：完全に目を覚ましまで無人回復動物を放置しないでください。メロキシカムの投与量は、私たちの大学でIACUC基準に基づいています。
   1. 次に、4と同じ手順を繰り返しますマウスを残りと彼らの呼吸を監視します。
      注：これは非常に迅速な手順であるとマウスはメロキシカム注射後すぐに目を覚ますが、必要に応じてイソフルランを調整しますのでご注意ください。マウスが取り出されるたびに、イソフルランを断ります。メロキシカムは24時間持続し、トロカールからの病変は完全に1週間で治癒します。

患者由来の腫瘍異種移植片バンクの4メンテナンス

1. 少なくとも一週間に一度、マウスの成長と健康を監視します。腫瘍サイズ、腫瘍発生、腫瘍注射の日、マウスの健康状態を追跡するために、スプレッドシート（​​または他の追跡システム）を使用します。
   注：マウスは15元の体重％、低ボディコンディションスコア（≥2）を紛失した場合、腫瘍潰瘍、腫瘍が2000ミリメートル³または総腫瘍3000ミリメートル^3、または猫背（病弱であり、寒さ、無気力などに達しています。）どのような方法で、マウスは、CO₂を経由して安楽死させたりなどのように頸椎脱臼が続く麻酔しますecondary方法。腫瘍を収集し、それ以外のマウスはCO₂と頸椎脱臼を経由して安楽死させた場合、麻酔と頚椎脱臼を経由して安楽死させます。
2. 腫瘍は、上述した後、安楽死させるために頸椎脱臼を行うように、約1,500〜2,000 mm ³で^マウスを麻酔ある場合。
   1. マウスはハートビートを持っていないことを確認してください。オートクレーブ処理ハサミやピンセットでSQ腫瘍を切除。
      注：腫瘍が最大1年間の成長を許可すると全く腫瘍が見られない場合には、その後、CO _2を介してマウスを安楽死させる、二の方法として、頸椎脱臼が続きます。
   2. パッセージ（5匹のマウスの新しいセット別名 ）次の世代に最高の増殖する腫瘍。また、上記のように残りの腫瘍を収集し、次に渡すと、12の腫瘍 - 10を収集するために、上記の手順を使用してください。
      注：多数の実行可能なチューブを収集することは、早期の世代（F1 - F8）で非常に重要です。したがって、いくつかの実行可能なチューブ、FF管、およびgeneratあたり1 FFPEを収集イオン。
   3. マウスの新世代は、約300ミリメートル³の腫瘍増殖を有するまで残りのマウスを保管してください。残りのマウスは大きい腫瘍を有する場合、上記のように収集し続けます。
3. 通路腫瘍に進み、F15まで、各段階で収集します。この時点で、液体窒素のうちできるだけ早い世代の生存可能なチューブを取り、氷上で解凍してみましょうし、上記腫瘍注入の手順に従ってください。
   注：実行可能な管から成長する腫瘍は、世代から世代へ渡すと比べてマウスで成長に時間がかかるので、計画するとき心に留めておきます。特定のPDTXモデルはもはや通路で必要とされている場合は、安楽死させず、多数の実行可能なチューブは、将来の使用のために収集されることを保証するために、腫瘍を収集します。

患者由来の腫瘍異種移植片5.発達治療薬

F3世代のほとんどの腫瘍は良好な成長速度を持っている（より速く成長し、より多くの共同注意：nsistent）、したがって、PDTX薬効試験に進みます。

1. 希望の腫瘍が非常に大きい場合（1500 - 2000ミリメートル^3）、マウスの所望の量に展開するために、腫瘍を収集するために、上記の手順に従ってください。
   1. 仮説に応じて治療群ごとに必要な腫瘍の数を決定するテストされています。
      注：ゲル状のタンパク質混合物溶液1mlをマウスに注入するための約30フィット小さな腫瘍片（腫瘍の形態に応じて）することができます。
2. 腫瘍体積を決定するためにノギスで腫瘍を測定 - （300mm³約50〜）毎週、ほとんどの腫瘍が目に見えて小さい腫瘍を有するマウスを確認してください。腫瘍体積= [width²（最小測定）×長さ（最大測定値）] 0.52 xは。
   注：ゲル状のタンパク質混合物溶液を、1週間の腫瘍増殖が正確になり、その後の後、一週間注射した腫瘍片を取り囲みます。
3. 300mm³と - 50の間で腫瘍体積を使用しますnは左右の腫瘍を平均します。その後、お互いのいくつかの数字内のグループおよびグループあたり平均10腫瘍を治療群にランダム化します。次に、グループにマウスをソートし、所望の治療研究を開始。
4. 薬（薬物依存スケジュール）毎週二回、重さと対策（腫瘍）をマウスに投与量。研究の終了時に、麻酔及び頸椎脱臼を経由して、マウスを安楽死させると、ラボでの将来の薬力学的分析のために腫瘍を収集します。
   注：試験車両腫瘍サイズおよびマウスの健康状態に依存して30日間続きます。

PDTX銀行の6機関

1. 研究と動物の適切な使用の繰り返し防止するために、十分に立証された形をしてください。
   注：これは成功PDTXバンクへの鍵です。
   1. PDTXバンクのマウス、トリートメント、データに、診療所でヒト患者から腫瘍を追跡するためにスプレッドシートを使用し、何が収集されます。注：これは冷凍庫、液体窒素デュワーを含み、およびFFPEストレージとしても。

結果

CRC PDTXモデルで一般的な突然変異の類似点とTCGA

私たちは、CRC PDTXバンクにおける共通の変異（KRAS、NRAS、BRAF、PIK3CA、APC、CTNNB1およびTP53）の割合は、CRC患者集団で見られる変異頻度の代表であったかどうかを調べました。 図2A（TCGA）及びB（CRC PDTXバンク）に示すように、これら...

ディスカッション

PDTX創薬プラットフォームは、新規化合物の臨床活性を予測する際の信頼性が低い他の前臨床モデルの欠点を改良モデルを提供しています。重要なことは、このモデルにおける腫瘍は転移能を保持し、生物学的に安定しており、世代から世代へ同様の薬剤応答性を示します。このモデルでは、患者由来の腫瘍を、無胸腺ヌードマウスに注射継代し、続いて治療の評価に使用されます。含ま成?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI or DMEM	Corning	10-040-CV
Penicillin-Streptomycin	Corning	30-002-CI
Non-essential Amino Acids	Corning	25-025-CI
Fetal Bovine Serum	Corning	35-010-CV	Thaw in -4 °C, then activate for 30 min at 60 °C water bath
CPT blood tube	BD vacutainer	362761
Microcentrifuge tube	Surelock	A-7002
Phosphate-Buffered Saline	Corning	21-040-CV
Cyrogenic vials	Cyroking	C0732901
Plastic tumor cutting dish	Trueline	TR4001
Scissors	Roboz	RS-5881
Forceps	Roboz	RS-5135
Matrigel (gelatinous protein mixture)	Corning	354234	Store at -20 or -80 °C, then thaw on ice, do not leave at RT
10% Formalin cups	Protocol	032-059
Liquid Nitrogen Dewar Storage	Thermolyne	CY50900
Portable liquid nitrogen dewar	Nalgene	4150-2000
Dimethyl Sulfoxide	Fischer	67-68-5
Freezing container: Mr Frosty	Nalgene	5100-0001
Isopropyl Alcohol	Decon	64-17-5
Trocars	Innovative Research of America	MP-182
Anesthesia machine	Patterson Veterinary
Anesthesia box	Patterson Veterinary
Isoflurane	Vet one	1038005
F-Air Canister	Bickford Omnicon	80120
Meloxicam	Vet one	5182-90C
Calipers	Fowler	54-100-167
Weight scale	Ohaus	Scout Pro SP601