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要約

この資料では、マイクロ CT イメージング、どの病変を示すことができる、電極を脳全体のコンテキストで高精度に位置する小動物の脳を準備する簡単な方法について説明します。

要約

病変と電極の位置確認は伝統的を介して病理染色脳スライスの手動の推定を必要とする時間のかかる手順を行われています。ここでは、シンプルで簡単な病変を定量化し、少ない骨の折れるより詳細な結果は、脳に電極を検索法について述べる.頭脳全体は四酸化オスミウム染色、樹脂に埋め込まれている、マイクロ CT スキャナーで画像化します。スキャンの解像度・仮想セクション厚さサンプル サイズに依存して脳の 3 D デジタル ボリュームの結果 (ラット、キンカチョウの voxel あたり 12-15 および 5-6 μ m 脳、それぞれ)。表面・深部病変が特徴付けることができる単管四極管, ・ テトロード配列, 電解病変とシリコン プローブのローカライズすることができます。独占的なソフトウェアでは、実験者面とボリュームのセグメントからサンプル ボリュームを手動でまたは自動的に調べることができます。このメソッドでは、脳全体のボリュームを生成するため内および研究間での比較を標準化するため、現在の方法でよりもはるかに高い程度に病変と電極を定量化することができます。

概要

神経科学者は、機能と脳の位置関係を理解するために長い時間のための病変に頼ってきました。たとえば、我々 の理解は、学習と記憶に不可欠なものとして海馬と衝動の制御のためのキーであると前頭前野の人間1,2の偶然の病変の両方の製品であった。ただし、動物モデルの使用は、セレンディピティ、越えて行くことによって病変の力を利用する神経科学者を許可しているし、無数の脳領域の機能を介して構造-機能相関の体系的な研究を通じて解明されてきた病変3,4。

正しく関数を構造体に割り当て、ただし、病変の研究は必要正確な定量化プロシージャは、不足している領域です。病変を定量化するための現在のゴールド スタンダードは、セクション、マウント、および光顕によるイメージ脳することです。イメージのスライス、アトラスに最も近いセクションに一致し、科目間で病変のおおよその座標が間接的に報告される、多くの場合カメラ lucida 画像や例組織スライス3,4 を使用して ,5,6,7,8,9,10。

現在病変定量化手順の不正確さを超えてこれらのテクニックがかかり、故障しやすいです。脳剛性、刃の鋭さ、および温度の小さな変化は、しくじった、ワープ、または引き裂かれたセクションにつながることができます。セクションで均等にない染色もできるし、正しく取り付け中の泡のためイメージを作成します。重要なは、断面、時に脳の病変の位置の三次元のコンテキストが失われ、挑戦的な脳の病変の正確な 3 D 再構成を行います。

病変のもう一つの一般的なアプリケーションは、シングルと脳内の複数の電極レコーディングの場所を確認してきました。最後の記録セッションの終わりには、研究者は、電極先端部に小型の電解病変を誘発する、従来病変実験11で組織学的脳を処理します。この手法は, 組織学的検索に挑戦されている電解の病変は通常それらを行うための電極よりも大きいが、通常十分に小さいという別の問題と上記で説明した同じ欠点により苦しみます。・ テトロード配列の場合のように複数の電極を挿入する場合、電解病変による検証はさらに困難です。電解病変に代わるは12, 組織学的にことを確認後に電極上の染料の使用が、従来の組織に付属する同じ欠点に苦しんでいるこの手法。

ここでは、我々 が詳細に説明染色電子顕微鏡検査 (EM) や x 線技術に基づいて最近説明方法13 ct マイクロ-) 病変を定量化し、現在より小さな動物の脳に電極を検索メソッド。マイクロ CT は x 線がシンチレータを収集しないサンプルによって偏向 x 線 360 ° 回転したサンプル ショットは、イメージング手法です。結果は、任意の方向の可視化および正確に定量化できるサンプルの高解像度デジタル 3 D 再構成です。多くの学術機関があるマイクロ CT スキャナーも市販されています。

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プロトコル

すべてのケアと動物の実験操作の見直しにも承認されてハーバード大学施設動物ケアおよび使用委員会。ここで説明した灌流は、ラットの特定、手順はより小さいまたは同様に大きさで分類された頭脳を持つ任意の動物に適用されます。

1. 血流

  1. リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) × 1 を準備します。ラットの (年齢: 0.5-1.5 歳、重量: 250-600 g)、800-1,000 mL で十分なはず。動物と定着剤を希釈する追加 400 mL を灌流して 400 mL を使用します。
  2. 2% (w/v) パラホルムアルデヒド (PFA) および 1x PBS で 2.5% (w/v) グルタールアルデヒド (GA) から成る固定液を準備します。ラット、400 mL で十分です。灌流後の脳のポスト固定の 50 mL の円錐管に 50 mL を保存します。
  3. 15 分 (0.8 L/分 O2 1.0 バー 21 ° c) で 4-5% イソフルラン ガスでラットを麻酔します。
  4. ペントバルビ タール ナトリウムの致死量を腹腔内注入 (180 mg/kg)。
  5. つま先ピンチ反射試験を行うことにより動物の反射損失をテストします。動物は、その反射的な反応を失っているまで灌流を開始するを待ちます。
  6. 前述 intracardial 血流と脳抽出プロトコル14次のソリューションに従います: 400 ml の 1x PBS 125 mmhg 血液を取り除くために動物を灌流します。すべての血は削除されており 1x PBS に置き換え、PFA と 125 mm Hg に 1x PBS で溶解 2.5% GA 400 mL の 2% の溶液を灌を開始します。
    メモ: 手順は、ラットではない動物で行われているが場合、灌流プロシージャの唯一の重要なコンポーネントは 1 × PBS と 2% の使用 PFA、1 × PBS で 2.5% ジョージア。ソリューション ボリュームと灌流圧は、種に応じて調整する可能性があります。

2. ポスト固定

  1. 抽出した脳が、2 %pfa、PBS 溶液 (以前動物を灌流するために使用同じ溶液) x 1 2.5% ジョージア。ソリューション ボリュームが少なくとも脳のボリューム x 10 であることを確認します。ラット、溶液 50 mL と 50 mL の円錐管で脳を配置します。2-3 日間、4 ° C で軽く揺れポスト固定のサンプルを格納します。
    注: サンプルは 50 mL のコニカル チューブには、軌道のシェーカーに水平方向に配置する最良の結果確保されます。
  2. サンプル後、修正されています長い間十分な後洗って純水や脱イオン水 (式行先方向2O)、二重蒸留水 (ddH2O) のサンプル (材料の表を参照) を 4 回次の期間: 1、1、1、および 15 分。
    注: このプロトコルの ddH2O、式行先方向2O、または純水べき交換です。便宜上、ddH2O は精製水を今後参照するために使用されます。

3. 染色

注意: このステップでは、手袋を使用している間、フードの下ですべてのソリューションの準備を実施します。

  1. 少なくとも 10 x の染色液の脳の容積を準備します。ラット脳の ddH2O で 4% OsO4原液 25 mL と ddH2o. の 25 mL を組み合わせることによりの 2% (w/v) 四酸化オスミウム (OsO4) 50 mL を準備する.
    注意: 四酸化オスミウムは揮発性一時的な失明および呼吸器系の問題を引き起こす可能性がありますしないと適切に処理します。セカンダリ コンテナー内の適切な化学物質の危険コンテナーの四酸化オスミウムにお問い合わせくださいすべての資料を破棄します。
  2. 新しい 50 mL の円錐管で脳を置き、OsO4ソリューションを追加します。脳は、OsO4組織の脂質と反応として茶色を回すが開始されます。
  3. 管を閉じるし、はパラフィン徹底的に印鑑 (材料の表を参照) を映画には潜伏中に漏洩しないことを確認します。
    注: オスミウムは揮発性と正しくチューブをシールすることは非常に重要なので、チューブのプラスチックで穏やかに反応します。チューブは、追加の保護用アルミ箔で包まれるかもしれない。
  4. 4 ° c で 2 週間 50 回転軌道シェーカーで軽く揺れ封管を格納します。最高の混合をように水平方向にチューブを置きます。揺れながらサンプルを完全に水没のソリューションを確認します。
    注: オスミウムを継続的に循環する許可されていない場合、それが完全に浸透できませんサンプルでは、シェーカーの水平方向の配置は非常に重要ですので。

4. 埋め込み

  1. サンプルは、2 週間の OsO4で培養されてが後で洗って室温 (RT) で ddH2O 5 回次の期間: 1、1、1、15、およびサンプルのすべての非連結 OsO4を削除する 60 分。
    注: 最後の 60 分交換を含む複数の交換を拡散する循環システムですべてのオスミウムを許可する必要があります。
  2. 4 ° C で ddH2O 30 分のサンプルを洗う
    注: オスミウムをサンプルから拡散する続行可能性がありますが、その量は前の手順から大幅に削減する必要があります。
  3. 最終的に樹脂を浸透させるエタノールとサンプルを脱水します。10-20 mL (30 分間各で 4 ° C) 以下のエタノールの希釈液の脱水に置き換える ddH2O: エタノール 20% (v/v) と 80% (v/v) ddH2O;50% (v/v) エタノール、50% (v/v) ddH2O;70% (v/v) エタノールと 30% (v/v) ddH2O;90% (v/v) エタノールおよび 10% (v/v) ddH2O;100% エタノール。
  4. とおりアセトン/樹脂希釈液を準備します。
    1. 製造元の指示に従って (材料の表を参照) を埋め込むため樹脂の 100 mL を準備します。
    2. 33% (v/v) 樹脂-67% をアセトン溶液にするには、50 mL の円錐管に樹脂の 15 mL を注ぐし、100% ガラス蒸留アセトン 30 mL を加えます。
    3. 50% (v/v) 樹脂 50% アセトンをするためには、50 mL の円錐管に樹脂 22.5 mL を注ぎ、100% ガラス蒸留アセトンの 22.5 mL を追加します。
    4. 67% (v/v) 樹脂-33% アセトン溶液を作る、50 mL の円錐管に樹脂の 30 mL を注ぎ、100% ガラス蒸留アセトンの 15 ミリリットルを追加します。
    5. 100% 樹脂の下の最初の解決策として残りの 32.5 mL の樹脂を使用します。
  5. を介して次のアセトン ・ アセトン/樹脂希釈 10 〜 20 mL サンプルを移動することによって樹脂浸透過程を開始: 4 ° C で 30 分間 100% アセトン4 ° C で 30 分間 100% アセトン・室内温度 (RT) で 30 分間 100% アセトン。
    注: 残りの浸透プロセスで行われる RT。
  6. 常温では、3 h の 33% (v/v) 樹脂 67% アセトン、RT、RT で 3 h の 67% (v/v) ガレージ 33% アセトンと室温 12 h 100% 樹脂で 3 h の 50% (v/v) 樹脂 50% アセトンでサンプルを浸す
  7. 樹脂ボトルの指示に従っての 50 mL の新鮮なバッチを作る。サンプルが治癒されるコンテナーに転送 (e.g。、使い捨て金型材料の表に記載されている)。新鮮な 100% 樹脂でサンプルを室温 4 時間蒸らします
    メモ: は、前日に樹脂が途中で硬化を開始新鮮な樹脂を使用しない場合、サンプルを操作するは難しいでしょう。
  8. ドガ、45 ° C で 15 分間真空オーブン サンプル
    メモ: この手順、サンプル内で気泡を取り除くのに役立ちますが、必須ではない、データの品質は影響しません。
  9. 最後に、60 ° C で 48 時間オーブンでサンプルを治す

5. マイクロ CT

  1. サンプルが硬化されている一度使い捨て金型をはがし、マイクロ CT 機械でそれをスキャンします。
    注: 使用機械によっては設定が異なるがあります。材料の表に記載されている著者によって使用されるスキャナーの推奨設定は、130 kV、0.1 mm の銅フィルターとモリブデン ソース、1 秒露出と投影あたり 4 フレームの平均で 135 μ A。ただし、多くの要因が特定のセッション中に最適な設定に影響を与える、実験者で個別にスキャナーする必要があります調整します。
  2. スキャンが完了すると、スキャナー ソフトウェアをコンピューター上の実験者のスキャナー/ソフトウェアの組み合わせの推奨パラメーターとサンプルを再構成します。
  3. 最後に、視覚化し、実験者の好みのソフトウェアを使用して再建されたデジタル ボリュームを分析する (例は材料の表を参照)。

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結果

従来、脳の断面や病変を定量化し、電極を検索するために染色が、このメソッドは、エラーが発生しやすい、労働集約的で、通常、結果の推定を必要とします。マイクロ CT イメージングの頭脳全体を準備することによってサンプルの損傷の確率が大幅に減少、興味の機能は、脳全体のコンテキストで分析されるよう、メソッドは多数試料の並列処理にかなりそれ自身...

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ディスカッション

プロトコルへの重要なステップを次に示します: まず、動物を灌流し、その後脳を修正後に PFA と GA の組み合わせの使用された組織の一貫性のある完全オスミウム浸透を達成するために重要です。我々 は明示的にこれをテストしていない、もっともらしい説明が PFA 固定がという可逆15、GA 固定ではなく可逆16,17。四酸化オスミウ?...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

作者ありがとうグレッグ ・ リンとアーサー ・ マクレランドの専門知識のマイクロ CT 機、デビッド リッチモンドと、イメージでハンター エリオットとデータ解析コア (加) 画像処理のアドバイスのためのハーバード衛生学校、ボストンでウィリアム Liberti 付き優雅キンカチョウ脳を提供する大学。この作業を行った一部センターでナノスケール システム (CNS)、メンバーの国家ナノテクノロジー調整インフラストラクチャ ネットワーク (NNCI)、全米科学財団 NSF 賞第 1541959 の下でサポートされているため。中枢神経系は、ハーバード大学の一部です。この作品は、リチャードとスーザン ・ スミス ・ ファミリー基金と IARPA (契約 #D16PC00002) によって支えられました。S.B.E.W. は人間のフロンティア科学プログラム (HFSP; から奨学金によって支えられました。LT000514/2014)、欧州分子生物学機構 (エンボ;ALTF1561-2013)。G. g. で、国立科学財団 (NSF) 大学院研究奨学金プログラム (GRFP) に対応しました。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Paraformaldehyde (PFA)Electron Microscopy Sciences (EMS)157102% (w/v/) in 1X PBS
Glutaraldehyde (GA)EMS162202.5% (w/v) GA in 1x PBS
OsO4EMS19190Work in fume hood
EthanolDecon LabsKoptec140, 190, 200 proof
AcetoneEMS10015Glass-distilled
Durcupan ACM resinSigma-Aldrich44610A, B, C and D components, resin for embedding
Disposable moldsTed Pella27114Suggested
milliQ water (ultrapure water)Millipore SigmaQGARD00R1 (or related purifier)Suggested
Parafilm (paraffin film)Millipore SigmaP7793Suggested paraffin film
Micro-CT scannerNikon Metrology Ltd., Tring, UKX-Tek HMS ST 225Used by authors
Software for visualizing and analyzing micro-CT scans:
Volume GraphicsVG Studio MaxUsed by authors
FEI / Thermo ScientificAvizoUsed by authors
FEI / Thermo ScientificAmiraSimilar to Avizo
Mark Sutton & Russell GarwoodSpiersFree, http://spiers-software.org/
Pixmeo SarlOsirix LiteFree, https://www.osirix-viewer.com/
Open SourceFIJIFree, https://fiji.sc/
AdobePhotoshopGood for analyzing one slice at a time

参考文献

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