JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Эта статья описывает простой метод для подготовки мелких животных мозги микро-КТ, в котором поражения могут быть количественно и электродов, расположенных с высокой точностью в контексте всего мозга.

Аннотация

Поражения и электродом расположение проверки являются традиционно делается через гистологическом окрашенных мозга срезов, длительная процедура, которая требует ручной оценки. Здесь мы опишем простой, простой метод количественной оценки поражения и размещения электродов в мозг, который является менее трудоемким и более подробные результаты. Весь мозг окрашенных с осмия тетраоксид, встроенные в смоле и образ с микро КТ-сканера. Сканирует привести объемов 3D цифровой мозг с резолюциями и толщины виртуального раздела зависит от размера выборки (12 – 15 и 5 – 6 мкм за voxel для крыс и зебры Финч мозги, соответственно). Поверхностные и глубокие поражения можно охарактеризовать и одна tetrodes, тетрод массивы, электролитическое поражений, и кремния зонды также могут быть локализованы. Свободные и несвободные программное обеспечение позволяет экспериментаторов для изучения объем образца от любой плоскости и сегмент громкость вручную или автоматически. Потому что этот метод создает объем всего мозга, поражений и электроды могут быть количественно гораздо более высокой степени, чем в нынешних методов, который поможет стандартизировать сопоставлений в рамках исследования и.

Введение

Неврологи полагались на поражения долгое время для того, чтобы понять связь между функцией и местоположение в головном мозге. Например наше понимание гиппокамп как необходимым для обучения и памяти и префронтальной коры как ключ для импульсного управления были оба продукта счастливое поражения людей1,2. Использование животных моделей, однако, позволило неврологи использовать всю мощь поражений, выходя за рамки serendipity, и функция бесчисленных областях мозга были выяснены путем систематического исследования структуры функция отношений через поражения3,4.

Однако, чтобы правильно назначить функцию к структуре, поражения исследования требуют точную количественную оценку процедур, что является областью, которая отсутствует. Текущий золотой стандарт для количественной оценки поражения является Секция, горе и изображения мозги с световой микроскоп. Фотосъемка кусочки затем сопоставляются в ближайший разделы на Атлас, и приблизительные координаты поражения по предметам косвенно сообщается, часто с помощью камеры lucida изображения или пример Гистологические срезы3,4 ,5,6,,78,9,10.

За пределами неточностей текущей поражения количественной оценки процедур эти методы являются длительным и склонны к провалу. Небольшие изменения в мозг жесткость, лезвие резкость и температуры может привести к неудачной, деформированные или порванные секций. Разделы также может испачкать неравномерно и быть неправильно imaged вследствие пузыри в средне-и монтажа. Важно отметить, что при резании, трехмерный контекст место поражения головного мозга теряется, делать точные 3D-реконструкции поражения в мозге трудные.

Другое общее приложение для поражения был для определения местоположения одного и нескольких записей электрода в головном мозге. В конце сессии окончательного звукозаписи исследователи побудить малые электролитический поражения на электрода и гистологически, как это сделано в обычных поражения эксперимент11процесса мозга. Эта техника страдает от же недостатки, описанные выше, с дополнительными проблемами, что электролитические поражений обычно больше, чем электроды, используемый для сделать их, но обычно достаточно малы, что они бросают вызов, чтобы найти гистологически. При вставке нескольких электродов, как и в случае массива тетрод, проверка через электролитический поражения является еще более сложной. Альтернативой электролитический поражения является использование красителя на электроде позже проверить гистологически12, но эта техника страдает от же недостатки, которые приходят с обычными гистологии.

Здесь мы описываем углубленного недавно описан метод13 , основанный на пятная методы электронной микроскопии (ЭМ) и рентгеновского компьютерная томография (микро CT), который дает количественную оценку повреждений и находит электродов в небольших животных мозги лучше, чем текущий методы. Микро-CT является Тепловизионная техника в котором рентген снимаются на образец, который поворачивается на 360° в то время как сцинтиллятора собирает рентген не отклоняются в образце. Результатом является высоким разрешением цифровой 3D-реконструкции образца, могут быть визуализированы в любой ориентации и количественно точно. Многие академические институты имеют микро КТ-сканеры, которые также доступны коммерчески.

протокол

Все уход и экспериментальных манипуляций животных были рассмотрели и утвердили Гарвардского институциональный уход за животными и использования Комитетом. Перфузии, описанные здесь специфически для крыс, но процедура применима к любой животных с меньшим или аналогичных размеров мозги.

1. перфузии

  1. Подготовка 1 x фосфат амортизированное saline (PBS). Для крысы (возраст: 0,5 – 1,5 лет, вес: 250-600 g), 800-1000 мл должно быть достаточно. Используйте 400 мл для perfuse животных и еще 400 мл для разбавления фиксатором.
  2. Подготовьте фиксатором, состоящий из 2% (w/v) параформальдегида (PFA) и глутаровый (GA) 2,5% (w/v) в однократном ПБС. Для крыс 400 мл достаточно. Сэкономить 50 мл в 50 мл Конические трубки после фиксации после перфузии мозга.
  3. Анестезировать Крыса с 4 – 5% изофлюрановая газа (0,8 Л/мин O2 1.0 бар при температуре 21 ° C) для 15 мин.
  4. Придать смертельной дозы Пентобарбитал натрия внутрибрюшинно (180 мг/кг).
  5. Тест для рефлекторной потери в животное, проводя мыс щепотка рефлекторной экзаменов. Ждать, чтобы начать перфузии, до тех пор, пока животное потеряло свою рефлекторной реакции.
  6. Следовать ранее описанных intracardial перфузии и мозг извлечения протокола14 с следующие решения: perfuse животное с 400 мл 1 x PBS на 125 мм Hg для удаления крови. После того, как вся кровь были удалены и заменены ПБС, начните perfusing с 400 мл 2% раствора PFA и 2,5% GA, растворенных в 1 x PBS на 125 мм ртутного столба.
    Примечание: Если процедура проводится в животное, которое не является крыса, только важными компонентами перфузии процедуры являются использование 1 x PBS и 2% PFA, 2,5% га в однократном ПБС. Решение томов и перфузионного давления может быть скорректирована в зависимости от вида.

2. После фиксации

  1. Поместить извлеченные мозга в 2% PFA, GA 2,5% в 1 x PBS раствор (же используется для perfuse животное ранее). Убедитесь, что объем раствора по крайней мере 10 x размер мозга. Для крыс место мозга в 50 мл Конические трубки с 50 мл раствора. Магазин образец в после фиксации для 2-3 дня, тряски слегка на 4 ° C.
    Примечание: Если образец в 50 мл Конические трубки, поместив его горизонтально на орбитальный шейкер обеспечит наилучшие результаты.
  2. После того, как образец пост исправлена для длиной достаточно, мыть образца в двойной дистиллированной воды (ddH2O), деионизированной воды (diH2O) или ультрачистая вода (см. Таблицу материалы) четыре раза за следующим: 1, 1, 1 и 15 мин.
    Примечание: Для этого протокола, ddH2O, diH2O или ультрачистая вода должна быть взаимозаменяемыми. Для простоты ddH2O будет использоваться для обозначения очищенной воды впредь.

3. Окрашивание

Предупреждение: Для этого шага, проводить все приготовления раствора под капотом при использовании перчатки.

  1. Подготовьте по крайней мере 10 x объем мозга окрашивания раствора. Для крыс мозги Подготовьте 50 мл 2% (w/v) осмия тетраоксид (4OsO) ddH2O, объединяя 25 мл 4% раствор OsO4 и 25 мл ddH2O.
    Предупреждение: осмия тетраоксид неустойчивой и может вызвать временную слепоту и респираторные проблемы если не обрабатываются надлежащим образом. Отменить все материалы, которые связаться осмия тетраоксид в контейнере соответствующей химической опасности в рамках вторичного контейнера.
  2. Мозг в новой 50 мл Конические трубки и добавить решение4 OsO. Мозг должен начать становятся коричневыми как OsO4 реагирует с липидов в ткани.
  3. Закройте трубку и запечатать его тщательно с парафином фильм (см. Таблицу материалы) для обеспечения, что он не протекает во время инкубации.
    Примечание: Осмий летучих и будет реагировать мягко с пластиковой трубки, поэтому уплотнения трубка правильно очень важно. Трубка может быть обернуты алюминиевой фольгой для дополнительной защиты.
  4. Храните запечатанный пробки на 4 ° C, слегка покачивая на орбитальный шейкер на 50 об/мин в течение 2 недель. Положите трубку горизонтально, чтобы обеспечить лучшее смешивание. Убедитесь, что образец полностью погружен в раствор при встряхивании.
    Примечание: Если осмий не разрешается непрерывно приводиться в движение, она может не проникает полностью образца, поэтому горизонтальное размещение на шейкер является очень важным.

4. Встраивание

  1. После того, как образец был инкубировали в OsO4 за 2 недели, промойте его с ddH2O 5 раз при комнатной температуре (RT) для следующей продолжительности: 1, 1, 1, 15 и 60 мин, чтобы удалить все непривязанные OsO4 в образце.
    Примечание: Несколько обменов, включая последний обмен 60 мин, необходимо разрешить все осмий в кровеносной системе для диффузного вне.
  2. Вымойте образца с ddH2O 30 мин при 4 ° C.
    Примечание: Осмий может продолжать распространять из выборки, но ее количество должно быть значительно сокращено с предыдущего шага.
  3. Обезвоживает образца с этанолом в конечном итоге проникнуть его смолой. К обезвоживанию, замените ddH2O 10 – 20 мл следующих растворов этанола (за 30 мин при температуре 4 ° C): 20% (v/v) этанола и 80% (v/v) ddH2O; 50% (v/v) этанола и 50% (v/v) ddH2O; 70% (v/v) этанола и 30% (v/v) ddH2O; 90% (v/v) этанола и 10% (v/v) ddH2O; 100% этанола.
  4. Готовят ацетон/смолы разведений следующим образом.
    1. Подготовка 100 мл смолы для встраивания (см. Таблицу материалы) в соответствии с инструкциями производителя.
    2. Чтобы сделать 33% (v/v) смолы - 67% раствор ацетона, налейте в 50 мл Конические трубки 15 мл смолы и добавьте 30 мл ацетона стекла дистиллированной 100%.
    3. Чтобы сделать ацетон смолы - 50% 50% (v/v), Налейте 50 мл Конические трубки 22,5 мл смолы и добавьте 22,5 мл ацетона стекла дистиллированной 100%.
    4. Чтобы сделать 67% (v/v) смолы - 33% раствор ацетона, залить 30 мл смолы в 50 мл Конические трубки и добавить 15 мл ацетона стекла дистиллированной 100%.
    5. Используйте остальные 32.5 мл смолы как первое решение ниже 100% смолы.
  5. Начать процесс проникновения смолы, перемещая образца через 10-20 мл следующих разведений ацетон и ацетон/смолы: 100% ацетона для 30 мин при температуре 4 ° C; 100% ацетона для 30 мин при температуре 4 ° C; и 100% ацетона для 30 мин при комнатной температуре (RT).
    Примечание: Остальная часть процесс проникновения будет проходить на RT.
  6. Погрузить образец в 33% (v/v) смолы 67% ацетона для 3 h на RT, а затем 50% (v/v) смолы - 50% ацетона для 3 h на RT, 67% (v/v) смолы 33% ацетона для 3 h на RT и 100% смолы для 12 h на RT.
  7. Сделайте свежий 50 мл партию смолы после инструкции на бутылке. Передача образца в контейнер, в котором он будет лечиться (например., одноразовые формы, описанные в Таблица материалов). Наполнить образца с свежими 100% смолы 4 часа на RT.
    Примечание: Если свежие смола не используется, смолы, сделал в предыдущий день начнется затвердеть преждевременно, и образец будет трудно манипулировать.
  8. Дега образца в вакуумной печи для 15 мин при температуре 45 ° C.
    Примечание: Этот шаг поможет снять любые пузыри воздуха в образце, но это не является необходимым и не влияет на качество данных.
  9. Наконец вылечить образец в духовке в течение 48 часов при температуре 60 ° C.

5. микро CT

  1. После того, как образец был вылечен, шелушиться одноразовые формы и его проверки с микро CT машиной.
    Примечание: В зависимости от машины используется, параметры будут отличаться. Для сканера, используемые авторами, перечисленных в Таблице материалы, Рекомендуемые параметры являются 130 кв, 135 МКА с фильтр 0,1 мм медь и молибден источник, 1-секундной экспозицией и в среднем 4 кадров в проекции. Однако экспериментаторов следует калибровки сканера индивидуально, как многие факторы будут влиять на оптимальные настройки для конкретной сессии.
  2. После завершения сканирования, реконструировать образца с рекомендованные параметры для комбинации экспериментатора сканера и программного обеспечения на компьютере с помощью программного обеспечения сканера.
  3. Наконец, визуализировать и анализировать реконструированный цифровой тома, с помощью программного обеспечения экспериментатора выбора (см. Таблицу материалы для примеров).

Результаты

Традиционно, мозги секционного и витражи с целью количественного определения поражений и найдите электродов, но этот метод ошибкам, трудоемкий и обычно требует оценки результатов. Подготовив все мозги для микро-КТ, значительно снижается вероятность повреждения обра?...

Обсуждение

Ниже приводятся важнейшие шаги к протоколу: во-первых, использование сочетания PFA и GA perfuse животное и впоследствии пост исправить мозг имеет первостепенное значение для достижения последовательного полного осмий проникновения ткани. Хотя мы не проверить это явно, правдоподобное объяс?...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Авторы благодарят Грег Лин и Артур Макклеланд за их опыт с микро КТ машина, Дэвид Ричмонд и Эллиотт охотник на изображение и данных анализа Core (IDAC) при Гарвардской медицинской школе для их обработки советы изображений и Уильям Liberti в Бостон Университет за любезное предоставление зебры Финч мозга. Эта работа была выполнена частично в центре для наноразмерных систем (ЦНС), членом из национального нанотехнологии скоординированной инфраструктуры сети (NNCI), который поддерживается Национальный научный фонд под NSF премии № 1541959. CNS является частью Гарвардского университета. Эта работа была поддержана Ричард и Фонда семьи Сьюзан Смит и IARPA (Договор #D16PC00002). S.B.E.W. была поддержана стипендии от человека пограничной науки программы (HFSP; LT000514/2014) и организация европейских молекулярной биологии (EMBO; ALTF1561-2013). Г.г. была поддержана, программа стипендий аспирантов исследований (GRFP) Национальный фонд науки (NSF).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Paraformaldehyde (PFA)Electron Microscopy Sciences (EMS)157102% (w/v/) in 1X PBS
Glutaraldehyde (GA)EMS162202.5% (w/v) GA in 1x PBS
OsO4EMS19190Work in fume hood
EthanolDecon LabsKoptec140, 190, 200 proof
AcetoneEMS10015Glass-distilled
Durcupan ACM resinSigma-Aldrich44610A, B, C and D components, resin for embedding
Disposable moldsTed Pella27114Suggested
milliQ water (ultrapure water)Millipore SigmaQGARD00R1 (or related purifier)Suggested
Parafilm (paraffin film)Millipore SigmaP7793Suggested paraffin film
Micro-CT scannerNikon Metrology Ltd., Tring, UKX-Tek HMS ST 225Used by authors
Software for visualizing and analyzing micro-CT scans:
Volume GraphicsVG Studio MaxUsed by authors
FEI / Thermo ScientificAvizoUsed by authors
FEI / Thermo ScientificAmiraSimilar to Avizo
Mark Sutton & Russell GarwoodSpiersFree, http://spiers-software.org/
Pixmeo SarlOsirix LiteFree, https://www.osirix-viewer.com/
Open SourceFIJIFree, https://fiji.sc/
AdobePhotoshopGood for analyzing one slice at a time

Ссылки

  1. Scoville, W., Milner, B. Loss of recent memory after bilateral hippocampal lesions. Journal of Neuropsychiatry and Clinical Neuroscience. 12, 103-113 (2000).
  2. Damasio, H., Grabowski, T., Frank, R., Galaburda, A. M., Damasio, A. R. The return of Phineas Gage: clues about the brain from the skull of a famous patient. Science. 264 (5162), 1102-1105 (1994).
  3. Kawai, R., et al. Motor cortex is required for learning but not for executing a motor skill. Neuron. 86, 800-812 (2015).
  4. Otchy, T., et al. Acute off-target effects of neural circuit manipulations. Nature. 528, 358-363 (2015).
  5. Wright, N., Vann, S., Aggleton, J., Nelson, A. A critical role for the anterior thalamus in directing attention to task-relevant stimuli. Journal of Neuroscience. 35, 5480-5488 (2015).
  6. Kapgal, V., Prem, N., Hegde, P., Laxmi, T., Kutty, B. Long term exposure to combination paradigm of environmental enrichment, physical exercise and diet reverses the spatial memory deficits and restores hippocampal neurogenesis in ventral subicular lesioned rats. Neurobiology of Learning and Memory. 130, 61-70 (2016).
  7. Hosseini, N., Alaei, H., Reisi, P., Radahmadi, M. The effects of NBM- lesion on synaptic plasticity in rats. Brain Research. 1655, 122-127 (2017).
  8. Palagina, G., Meyer, J., Smirnakis, S. Complex visual motion representation in mouse area V1. Journal of Neuroscience. 37, 164-183 (2017).
  9. Ranjbar, H., Radahmadi, M., Reisi, P., Alaei, H. Effects of electrical lesion of basolateral amygdala nucleus on rat anxiety-like behavior under acute, sub-chronic, and chronic stresses. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. , (2017).
  10. Wood, R., et al. The honeycomb maze provides a novel test to study hippocampal-dependent spatial navigation. Nature. , (2018).
  11. Vermaercke, B., et al. Functional specialization in rat occipital and temporal visual cortex. Journal of Neurophysiology. 112, 1963-1983 (2014).
  12. Jun, J. J., et al. Fully integrated silicon probes for high-density recording of neural activity. Nature. 551, 232-236 (2017).
  13. Masís, J., et al. micro-CT-based method for quantitative brain lesion characterization and electrode localization. Scientific Reports. 8, 5184 (2018).
  14. Gage, G., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. 65, 3564 (2012).
  15. Helander, K. Kinetic studies of formaldehyde binding in tissue. Biotechnic & Histochemistry. , (1994).
  16. Paljärvi, L., Garcia, J., Kalimo, H. The efficiency of aldehyde fixation for electron microscopy: stabilization of rat brain tissue to withstand osmotic stress. Histochemical Journal. , (1979).
  17. Okuda, K., Urabe, I., Yamada, Y., Okada, H. Reaction of glutaraldehyde with amino and thiol compounds. Journal of Fermentation and Bioengineering. 71, (1991).
  18. Bahr, G. Osmium tetroxide and ruthenium tetroxide and their reactions with biologically important substances: electron stains III. Experimental Cell Research. , (1954).
  19. Khan, A. A., Riemersma, J. C., Booij, H. L. The reactions of osmium tetroxide with lipids and other compounds. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 9, 560-563 (1961).
  20. Riemersma, J. Osmium tetroxide fixation of lipids for electron microscopy a possible reaction mechanism. Biochimica et Biophysica Acta. 152, (1968).
  21. Mikula, S., Binding, J., Denk, W. Staining and embedding the whole mouse brain for electron microscopy. Nature Methods. 9, 1198-1201 (2012).
  22. Mikula, S., Denk, W. High-resolution whole-brain staining for electron microscopic circuit reconstruction. Nature Methods. 12, 541-546 (2015).
  23. Crespigny, A., et al. 3D micro-CT imaging of the postmortem brain. Journal of Neuroscience Methods. 171, 207-213 (2008).
  24. Anderson, R., Maga, A. A novel procedure for rapid imaging of adult mouse brains with MicroCT using Iodine-Based contrast. PLoS One. 10, 0142974 (2015).
  25. Zhou, Z., et al. Cerebral cavernous malformations arise from endothelial gain of MEKK3-KLF2/4 signalling. Nature. 532, 122-126 (2016).
  26. Choi, J., et al. Micro-CT imaging reveals mekk3 heterozygosity prevents cerebral cavernous malformations in Ccm2-Deficient mice. PloS One. 11, 0160833 (2016).
  27. Choi, J., Yang, X., Foley, M., Wang, X., Zheng, X. Induction and Micro-CT imaging of cerebral cavernous malformations in mouse model. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
  28. Benveniste, H., Kim, K., Zhang, L., Johnson, G. Magnetic resonance microscopy of the C57BL mouse brain. Neuroimage. 11, 601-611 (2000).
  29. Weninger, W. J., et al. High-resolution episcopic microscopy: a rapid technique for high detailed 3D analysis of gene activity in the context of tissue architecture and morphology. Anat Embryol. 211, 213-221 (2006).
  30. Schneider, J. E., et al. high-throughput magnetic paragraph sign resonance imaging of mouse embryonic paragraph sign anatomy using a fast gradient-echo sequence. MAGMA. 16, 43-51 (2003).
  31. Sharpe, J. Optical projection tomography. Annual Review of Biomedical Engineering. 6, 209-228 (2004).
  32. Cox, D. D., Papanastassiou, A., Oreper, D., Andken, B., James, D. High-Resolution Three-Dimensional microelectrode brain mapping using stereo microfocal x-ray imaging. Journal of Neurophysiology. 100, 2966-2976 (2008).
  33. Borg, J. S., et al. Localization of metal electrodes in the intact rat brain using registration of 3D microcomputed tomography images to a magnetic resonance histology atlas. eNeuro. 2, (2015).
  34. Fu, T. -. M., et al. Stable long-term chronic brain mapping at the single-neuron level. Nature Methods. 13, 875-882 (2016).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

141CT

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены