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Resumo

Este artigo descreve um método simples para preparar pequenos cérebros de animais para a imagem latente de micro-CT, nas quais as lesões podem ser quantificadas e eletrodos localizados com elevada precisão no contexto do cérebro inteiro.

Resumo

Verificação de localização de lesão e eletrodo são, tradicionalmente, feito através de exame histológico de fatias de cérebro coradas, um procedimento demorado que requer avaliação manual. Aqui, descrevemos um método simples, direto para quantificar as lesões e localização de eletrodos no cérebro que é menos trabalhoso e gera resultados mais detalhados. Todo cérebro é manchado com tetróxido de ósmio, em resina e fotografado com um scanner de micro-CT. Os exames resultam em 3D Digitas volumes dos cérebros com resoluções e espessuras de seção virtual dependentes do tamanho da amostra (12 – 15 e 5-6 µm por voxel para rato e zebra finch cérebros, respectivamente). Lesões superficiais e profundas podem ser caracterizadas e único tetrodes, matrizes tetrode, lesões eletrolíticos, e sondas de silicone também podem ser localizadas. Software livre e proprietário permite experimentadores examinar o volume da amostra de qualquer avião e segmento o volume manualmente ou automaticamente. Porque esse método gera volume todo cerebral, lesões e eletrodos podem ser quantificados para um grau muito maior do que nos métodos atuais, que vai ajudar a padronizar as comparações dentro e através de estudos.

Introdução

Os neurocientistas têm confiado em lesões por um longo tempo para entender a relação entre função e localização no cérebro. Por exemplo, nosso entendimento de como sendo indispensável para a aprendizagem e memória hipocampo e do córtex pré-frontal como sendo a chave para controlar os impulsos eram ambos os produtos de lesões acidentais em seres humanos1,2. O uso de modelos animais, no entanto, permitiu que os neurocientistas aproveitar o poder das lesões, indo além da serendipidade, e a função de inúmeras áreas do cérebro tem sido elucidada através de estudos sistemáticos das relações estrutura-função através lesões de3,4.

Para atribuir corretamente a função para uma estrutura, no entanto, estudos de lesão exigem procedimentos de quantificação exacta, que é uma área que tem faltado. O atual padrão de ouro para quantificar as lesões é a seção, montagem e cérebros de imagem com um microscópio de luz. As fatias de imagens são então combinadas para as seções mais próximas em um atlas, e as coordenadas aproximadas das lesões através de assuntos são relatadas indiretamente, muitas vezes através do uso de imagens de camera lucida ou exemplo histológica fatias3,4 ,5,6,7,8,9,10.

Além a imprecisão dos procedimentos de quantificação de lesão atual, estas técnicas são demorado e sujeito a falhas. Pequenas mudanças na temperatura, nitidez da lâmina e rigidez do cérebro pode levar a seções fracassadas, entortadas ou rasgadas. As seções também podem manchar de forma desigual e impropriamente ser fotografadas por causa de bolhas no meio de montagem. Importante, após o corte, o contexto tridimensional da localização da lesão no cérebro é perdido, fazendo reconstrução 3D precisa da lesão em desafiar o cérebro.

Outra aplicação comum para lesões tem sido para determinar a localização do único e várias gravações de eletrodos no cérebro. No final da sessão de gravação final, pesquisadores induzem pequenas lesões eletrolíticos na ponta do eletrodo e processam o cérebro histologicamente como feito em um experimento de lesão convencional11. Esta técnica sofre as mesmas desvantagens descritas acima, com problemas adicionais, sendo que as lesões eletrolíticos são geralmente maiores que os eléctrodos costumávamos fazê-las, mas são geralmente muito pequenas que eles são um desafio para encontrar histologicamente. Quando vários eletrodos são inseridos, como no caso de uma matriz de tetrode verificação através de lesões eletrolíticos é ainda mais desafiador. Uma alternativa para lesões eletrolíticos é o uso de um corante no eléctrodo para depois verificar histologicamente12, mas esta técnica sofre os mesmos inconvenientes que vêm com histologia convencional.

Aqui, descrevemos em profundidade um método descrito recentemente13 baseado na coloração das técnicas de microscopia eletrônica (EM) e radiografia computadorizada (micro-CT) que quantifica a lesões e localiza eletrodos no cérebro de animais pequeno melhor que corrente métodos. Micro-CT é uma técnica de imagem em que raios-x são um tiro uma amostra que é girada 360°, enquanto um cintilador coleta os raios-x não é desviados pela amostra. O resultado é uma reconstrução 3D digital de alta resolução da amostra que pode ser visualizada em qualquer orientação e quantificar precisamente. Muitas instituições acadêmicas tem micro-CT scanners, que também estão disponíveis comercialmente.

Protocolo

Todo cuidado e manipulação experimental de animais foram revistos e aprovados pelo Comitê de utilização e cuidados Animal institucionais de Harvard. A perfusão descrito aqui é específico para ratos, mas o procedimento é aplicável a todos os animais com cérebros menores ou similarmente feito sob medidos.

1. perfusão

  1. Prepare 1 x tampão fosfato salino (PBS). Para um rato (idade: 0,5-1,5 anos de idade, peso: 250-600 g), 800 – 1.000 mL deve ser suficiente. Use 400 mL para perfundir o animal e um adicional de 400 mL para diluir o fixador.
  2. Prepare o fixador consistindo de 2% (p/v) paraformaldeído (PFA) e 2,5% (p/v) de glutaraldeído (GA) em PBS 1x. Para um rato, 400 mL é suficiente. Salve 50 mL em um tubo cônico de 50 mL para pós-fixação do cérebro após a perfusão.
  3. Anestesia o rato com 4 – 5% de gás de isoflurano (a 0,8 L/min O2 1,0 bar a 21 ° C) por 15 min.
  4. Injetar uma dose letal de pentobarbital de sódio intraperitonealmente (180 mg/kg).
  5. Teste para a perda de reflexo no animal através da realização de um exame de reflexo de dedo-pinch. Espere para começar a perfusão, até que o animal perdeu sua resposta reflexa.
  6. Siga o descrito anteriormente intracardíaca perfusão e cérebro extração protocolo14 com as seguintes soluções: perfundir o animal com 400 mL de 1X PBS a 125 mm Hg para remover o sangue. Uma vez que todo o sangue foi removido e substituído com 1X PBS, começa perfusing com 400 mL de uma solução de 2%, PFA e 2,5% GA dissolvido em 1X PBS em 125 mm Hg.
    Nota: Se o procedimento está sendo realizado em um animal que não é um rato, os componentes apenas importantes do processo de perfusão são o uso de 1X PBS e 2% PFA, GA de 2,5% em PBS 1x. Os volumes de solução e pressão de perfusão podem ser ajustados de acordo com a espécie.

2. pós-fixação

  1. Coloque o cérebro extraído em 2% PFA, GA de 2,5% em 1 x solução de PBS (mesma solução usada para perfundir o animal anteriormente). Certifique-se de que o volume de solução é pelo menos 10x o volume do cérebro. Para os ratos, coloca o cérebro em um tubo cónico de 50 mL com 50 mL de solução. Armazenar a amostra no pós-fixação por 2 – 3 dias, agitando levemente a 4 ° C.
    Nota: Se a amostra for em um tubo cónico de 50 mL, colocando-o horizontalmente em um agitador orbital irá garantir os melhores resultados.
  2. Depois que a amostra foi pós-fixada por muito tempo suficiente, lavar a amostra em água bidestilada (ddH2O), água deionizada (diH2O) ou água ultrapura (ver Tabela de materiais) quatro vezes para as seguintes durações: 1, 1, 1 e 15 min.
    Nota: Para este protocolo, ddH2O, diH2O ou água ultrapura deve ser intercambiável. Para simplificar, ddH2O será usado para se referir a água purificada de agora em diante.

3. coloração

Atenção: Para esta etapa, realizar todas as preparações de solução debaixo de um carro enquanto estiver usando luvas.

  1. Prepare pelo menos 10x o volume do cérebro de coloração de solução. Cérebro de rato, preparar 50 mL de tetróxido de ósmio de 2% (p/v) (OsO4) em ddH2O combinando-se 25 mL de solução 4% OsO4 e 25 mL de DDQ2O.
    Cuidado: tetróxido de ósmio é volátil e pode causar cegueira temporária e problemas respiratórios se não tratada adequadamente. Descarte todos os materiais que entre em contato com o tetróxido de ósmio em um recipiente apropriado risco químico dentro de um recipiente secundário.
  2. Coloque o cérebro em um novo tubo cónico de 50 mL e adicionar a solução de4 OsO. O cérebro deve começar a virar marrom como OsO4 reage com lipídios no tecido.
  3. Fechar o tubo e selá-lo completamente com parafina de cinema (ver Tabela de materiais) para garantir que ela não vaza durante a incubação.
    Nota: O ósmio é volátil e reagirá levemente com o plástico do tubo, então o tubo a isolar correctamente é muito importante. O tubo pode ser embrulhado com papel de alumínio para proteção adicional.
  4. Armazene o tubo fechado a 4 ° C, agitando levemente em um agitador orbital a 50 rpm por 2 semanas. Coloca o tubo na horizontal para assegurar a melhor mistura. Certifique-se de que a amostra é totalmente submersa na solução, agitando.
    Nota: Se o ósmio não é permitido a circulação continuamente, ele pode não totalmente penetrar a amostra, pelo posicionamento horizontal no agitador é muito importante.

4. incorporação

  1. Depois que a amostra tem sido incubada no OsO4 por 2 semanas, lave-o com o ddH2O 5 vezes à temperatura ambiente (RT) para as seguintes durações: 1, 1, 1, 15 e 60 min para remover todos os desvinculado de OsO4 na amostra.
    Nota: As múltiplas trocas, incluindo a última troca de 60 min, são necessárias para permitir que todo o ósmio no sistema circulatório de difundir para fora.
  2. Lavar a amostra com o ddH2O por 30 min a 4 ° C.
    Nota: Ósmio pode continuar a difundir-se fora da amostra, mas sua quantidade deve ser muito reduzida da etapa anterior.
  3. Desidrate a amostra com etanol para eventualmente infiltrar com resina. Para desidratar, substitua o ddH2O 10-20 mL das seguintes diluições de etanol (por 30 min cada a 4 ° C): 20% (v/v) de etanol e 80% (v/v) ddH2O; etanol a 50% (v/v) e 50% (v/v) ddH2O; etanol a 70% (v/v) e 30% (v/v) ddH2O; etanol a 90% (v/v) e 10% (v/v) ddH2O; 100% de etanol.
  4. Prepare as diluições de acetona/resina como segue.
    1. Prepare 100 mL da resina para incorporação (ver Tabela de materiais) conforme as instruções do fabricante.
    2. Para tornar a 33% (v/v) da resina - 67% solução de acetona, despeje 15 mL de resina em um tubo cónico de 50 mL e adicionar 30 mL de acetona de vidro-destilada 100%.
    3. Para tornar a acetona de resina - 50% de 50% (v/v), despeje 22,5 mL de resina em um tubo cónico de 50 mL e adicionar 22,5 mL de acetona de vidro-destilada 100%.
    4. Para tornar a 67% (v/v) da resina - 33% solução de acetona, despeje 30 mL de resina em um tubo cónico de 50 mL e adicionar 15 mL de acetona de vidro-destilada 100%.
    5. Use o restante 32,5 mL de resina como a primeira solução de resina 100% abaixo.
  5. Iniciar o processo de infiltração de resina, deslocando a amostra através de 10-20 mL de acetona e acetona/resina seguintes diluições: acetona 100% por 30 min a 4 ° C; acetona 100% por 30 min a 4 ° C; e 100% de acetona por 30 min à temperatura ambiente (RT).
    Nota: O resto do processo de infiltração terá lugar no RT
  6. Mergulhar a amostra em 33% (v/v) acetona de 67% de resina para 3h no RT e, em seguida, 50% (v/v) da resina - 50% de acetona para 3h no RT, acetona de 33% 67% (v/v) de resina para 3h no RT e 100% de resina para 12 horas a RT
  7. Fazer um lote de fresco 50 mL de resina, seguindo as instruções na embalagem. Transferir a amostra para o recipiente em que vai ser curado (ex., os moldes descartáveis, descritos na Tabela de materiais). Infundir a amostra com resina fresca de 100% por 4 horas no RT
    Nota: Se não for usada a resina fresca, feita no dia anterior a resina vai começar a endurecer-se prematuramente, e a amostra será difícil de manipular.
  8. Degas a amostra em um forno a vácuo para 15 min a 45 ° C.
    Nota: Este passo irá ajudar a remover quaisquer bolhas de ar aprisionado dentro da amostra, mas é não-essenciais e não afetará a qualidade dos dados.
  9. Finalmente, curar a amostra em um forno por 48 h a 60 ° C.

5. micro-CT

  1. Uma vez que a amostra foi curada, Descole o molde descartável e digitalizá-lo com a máquina de micro-CT.
    Nota: Dependendo da máquina usada, as configurações será diferentes. Para o scanner utilizado pelos autores constantes da Tabela de materiais, as configurações recomendadas são 130 kV, 135 µA com um filtro de 0,1 mm de cobre e uma fonte de molibdênio, uma exposição de 1 segundo e uma média de 4 quadros por projeção. No entanto, experimentadores devem calibrar o scanner individualmente, como muitos fatores afetará as configurações ideais durante uma determinada sessão.
  2. Uma vez que a varredura for concluída, reconstrua a amostra com os parâmetros recomendados para a combinação de software do scanner do experimentador em um computador com o software do scanner.
  3. Finalmente, Visualizar e analisar o volume digital reconstruído usando o software do experimentador de escolha (consulte Tabela de materiais para exemplos).

Resultados

Tradicionalmente, cérebros são seccionados e manchados para quantificar as lesões e localizar os eléctrodos, mas esse método é propenso, trabalhoso e normalmente requer a estimativa dos resultados. Preparando o cérebro inteiro para a imagem latente de micro-CT, a probabilidade de danificar as amostras é muito reduzida, características de interesse podem ser analisadas no contexto do cérebro inteiro e o método presta-se para processamento paralelo de muitas amostras, considerave...

Discussão

A seguir, são passos críticos para o protocolo: em primeiro lugar, o uso de uma combinação de PFA e GA para perfundir o animal e posteriormente fixar o cérebro foi fundamental para alcançar penetração consistente ósmio total do tecido. Embora não podemos testar isso explicitamente, uma explicação plausível é que a fixação de PFA é reversível15, Considerando que a fixação de GA não é reversível16,17. Porque uma incuba...

Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Os autores agradecer Greg Lin e Arthur McClelland seus conhecimentos com o micro-CT máquina, David Richmond Hunter Elliott na imagem e núcleo de análise de dados (IDAC) na Harvard Medical School para seu conselhos de processamento de imagem e William Liberti em Boston Universidade para graciosamente, fornecendo um cérebro zebra finch. Este trabalho foi realizado em parte no centro para sistemas de nanoescala (CNS), um membro do nacional nanotecnologia coordenada infra-estrutura de rede (NNCI), que é apoiado pela Fundação Nacional de ciência sob prêmio NSF n º 1541959. CNS é uma parte da Universidade de Harvard. Este trabalho foi apoiado pelo Richard e Susan Smith Family Foundation e IARPA (contrato #D16PC00002). S.B.E.W. foi apoiado por bolsas do programa de ciência de fronteira humana (HFSP; LT000514/2014) e a Organização Europeia de Biologia Molecular (EMBO; ALTF1561-2013). G.G. foi apoiado pela National Science Foundation (NSF) pós-graduação pesquisa Fellowship programa (GRFP).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Paraformaldehyde (PFA)Electron Microscopy Sciences (EMS)157102% (w/v/) in 1X PBS
Glutaraldehyde (GA)EMS162202.5% (w/v) GA in 1x PBS
OsO4EMS19190Work in fume hood
EthanolDecon LabsKoptec140, 190, 200 proof
AcetoneEMS10015Glass-distilled
Durcupan ACM resinSigma-Aldrich44610A, B, C and D components, resin for embedding
Disposable moldsTed Pella27114Suggested
milliQ water (ultrapure water)Millipore SigmaQGARD00R1 (or related purifier)Suggested
Parafilm (paraffin film)Millipore SigmaP7793Suggested paraffin film
Micro-CT scannerNikon Metrology Ltd., Tring, UKX-Tek HMS ST 225Used by authors
Software for visualizing and analyzing micro-CT scans:
Volume GraphicsVG Studio MaxUsed by authors
FEI / Thermo ScientificAvizoUsed by authors
FEI / Thermo ScientificAmiraSimilar to Avizo
Mark Sutton & Russell GarwoodSpiersFree, http://spiers-software.org/
Pixmeo SarlOsirix LiteFree, https://www.osirix-viewer.com/
Open SourceFIJIFree, https://fiji.sc/
AdobePhotoshopGood for analyzing one slice at a time

Referências

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