병 변 특성화 및 작은 동물 두뇌에 전극을 위치에 대 한 마이크로-CT 기반 방법

요약

이 문서에서는 마이크로-CT 영상, 어떤 병 변 양이 정해질 수 있다와 전극 전체 뇌의 맥락에서 높은 정밀도와 위치에 대 한 작은 동물 두뇌를 준비 하는 간단한 방법을 설명 합니다.

초록

병 변 및 전극 위치 확인은 전통적으로 통해 조직학 검사 스테인드 뇌 조각의 수동 추정을 요구 하는 시간이 걸리는 절차 다. 여기, 우리는 장애를 측정 하 고 덜 힘 드는 이며 더 자세한 결과 뇌의 전극 위치에 대 한 간단 하 고, 간단한 방법을 설명 합니다. 전체 두뇌 오스뮴 tetroxide 물, 수 지에 포함 되며 마이크로 CT 스캐너로 촬영. 검사 결과 해상도와 가상 섹션 두께 샘플 크기에 따라 두뇌의 3D 디지털 볼륨 (쥐와 얼룩말 피리 새 류 대 한 복 당 12-15와 5-6 µ m 머리, 각각). 표면과 깊은 병 변 특징 하실 수 있습니다 및 단일 tetrodes, tetrode 배열, 전해질 장애, 그리고 실리콘 프로브도 지역화할 수 있습니다. 무료 및 독점 소프트웨어는 수동 또는 자동으로 모든 비행기와 세그먼트 볼륨에서 샘플 볼륨을 검사 하는 경험이 있습니다. 이 방법은 뇌 볼륨을 생성 하기 때문에 병 변 및 전극 비교 시간과 연구에 걸쳐 표준화 하는 데 도움이 됩니다 현재 방법에 보다 훨씬 더 높은 학위를 측정할 수 수 있습니다.

서문

신경 기능 및 뇌의 위치 사이의 관계를 이해 하기 위해서는 오랜 시간에 대 한 장애에 의존 했습니다. 예를 들어 우리의 이해 학습 및 메모리 불가결 되 고 마 키 충 동 제어에 대 한 것으로 전 두 엽 피 질 인간^1,2serendipitous 변의 두 제품을 했다. 그러나 동물 모델,,를 사용 하 여 세 렌, 저쪽에 하 여 병 변의 힘을 활용 하는 신경 수 있다 그리고 수많은 뇌 영역의 기능을 통해 구조-기능 관계의 체계적인 연구를 통해 해명 되었습니다 했습니다. 병 변^3,4.

그러나 올바르게 구조에 함수를 할당,, 병 변 연구는 부족 했던 지역 이다 정확한 정량화 절차 필요 합니다. 장애를 측정을 위한 현재 골드 표준 섹션, 마운트, 및 가벼운 현미경 이미지 두뇌입니다. 이미지 분할 영역 다음 아틀라스에 가장 가까운 부분에 일치와 과목에 걸쳐 변의 대략적인 좌표는 직접 보고, 종종 카메라 루시 다 이미지 또는 예제 조직학 조각^{3,4 사용 ,5,6,7,8,,910}.

현재 병 변 부 량 절차의 부정확성을 넘어 이러한 기술은 시간과 실패 하는 경향이 있습니다. 뇌 경직, 블레이드 선명도, 및 온도에 작은 변화는 어설픈, 뒤틀린, 또는 찢어진 섹션으로 이어질 수 있습니다. 섹션 수 있습니다 또한 얼룩 하지 균등 하 게 하 고 설치 매체에 거품 때문에 몇 군데 잘못 될. 중요 한 것은, 단면, 시 뇌의 병 변의 위치의 3 차원 컨텍스트 손실, 두뇌 도전 병 변의 정확한 3D 개조를 만들기 됩니다.

병 변에 대 한 또 다른 일반적인 응용 단일 및 다중 전극 녹음 뇌에서의 위치 결정 되었습니다. 마지막 녹음 세션의 끝에, 연구팀은 전극 끝에 작은 전해질 병 변 유발 하 고 두뇌 조직학 기존 병 변 실험¹¹에서 처리. 조직학 찾을 수 도전 되는 전해질 병 변 일반적으로 그들을 확인 하는 데 사용 하는 전극 보다 큰 하지만 충분히 작은 일반적으로 추가 문제, 위에서 설명한 동일한 단점에서 겪고 있다이 기술. Tetrode 배열의 경우 여러 전극 삽입 되 면 전해 병 변 통해 확인은 훨씬 더 도전. 대신 전해 병 변은 나중에¹², 조직학 확인 전극에 염료를 사용 하 여 하지만이 기술은 전통적인 조직학와 함께 제공 되는 동일한 단점이 있습니다 겪고 있다.

여기, 우리는 깊이 있는 설명 얼룩 전자 현미경 (EM) 및 x-선 기법에 따라 최근 설명된 방법¹³ 컴퓨터 단층 촬영 (마이크로 CT) 병 변 단정 하 고 전류 보다 작은 동물 두뇌에서 전극을 찾습니다 방법입니다. 마이크로-CT는 엑스레이 선과 하지 샘플에서 반사 하는 엑스레이 수집 하는 동안 360 ° 회전 하는 샘플에서 촬영 하는 이미징 기법입니다. 결과 어떤 방향으로 시각화 하 고 정확 하 게 측정할 수 있는 샘플의 고해상도 디지털 3D 재구성. 많은 교육 기관 있다 마이크로 CT 스캐너, 상업적으로 사용할 수 있습니다.

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프로토콜

모든 관심과 동물의 실험적인 조작 검토 하 고 하버드 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 했다. 여기에 설명 된 관류 쥐에 대 한 특정 하지만 작거나 비슷한 크기 두뇌를 가진 어떤 동물 든 지에 적용 되는 절차.

1입니다. 관류

1. 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 1을 준비 합니다. 쥐에 대 한 (나이: 0.5-1.5 세, 무게: 250-600 g), 800-1000 mL 충분 해야 한다. 400 mL를 사용 하 여 동물과 정착 액을 희석 하는 추가적인 400 mL perfuse.
2. 정착 액 2% (w/v) paraformaldehyde (PFA) 및 1 x PBS에 2.5% (w/v)도 (GA)으로 구성 된 준비. 쥐, 400 mL 충분 하다입니다. 재 관류 후 뇌의 후 고정을 위한 50 mL 원뿔 튜브에 50ml를 저장 합니다.
3. 4-5 %isoflurane 가스 (0.8 L/min O₂ 21 ° C에서 1.0 바에서)에서 15 분 동안 쥐 anesthetize
4. Intraperitoneally 나트륨 pentobarbital의 치명적인 복용량을 주사 (180 mg/kg).
5. 발가락-핀치 반사 시험을 실시 하 여 동물에 반사 손실에 대 한 테스트. 동물의 반사 응답 잃은 때까지 관류를 시작을 기다립니다.
6. 앞에서 설명한 intracardial 관류와 뇌 추출 프로토콜¹⁴ 다음 솔루션에 따라: 1 x 125 mm Hg 피 제거 하에서 PBS의 400 mL와 함께 동물을 perfuse. 일단 모든 혈액 제거 되었으며 1 x PBS로 대체, PFA와 2.5%가 125 mm Hg에 1 x PBS에 용 해 2%의 솔루션의 400 mL와 함께 perfusing 시작 합니다.
   참고: 경우에 절차는 쥐를 동물에 실시 되 고, 관류 절차만 중요 한 구성 요소는 PBS와 2% x 1 사용 하 여 PFA, 1 x PBS에 2.5%가. 솔루션 볼륨 및 관류 압력은 종에 따라 조정할 수 있다.

2입니다. 포스트 고정

1. 2%에서 추출한 뇌를 배치 PFA, 2.5%가 PBS 솔루션 (이전 동물을 perfuse 하는 데 사용 하는 동일한 솔루션) x 1에서. 솔루션 볼륨 적어도 10 배는 두뇌의 볼륨 인지 확인 합니다. 쥐를 위해 솔루션 50 mL 50 mL 원뿔 튜브에 두뇌를 놓습니다. 2-3 일, 4 ° c.에 가볍게 흔들어 후 고정 샘플 저장
   주: 샘플 50 mL 원뿔 튜브에 경우에, 궤도 통에 가로로 배치 됩니다 확인 최상의 결과.
2. 샘플 후 수정 되었습니다 오랫동안 충분히, 후 씻어 두 번 증 류 물 (ddH₂O), 드 이온된 수 (diH₂O), 또는 초순 샘플 4 다음 기간에 대 한 시간 ( 재료의 표참조): 1, 1, 1, 및 15 분.
   참고:이 프로토콜 ddH₂O, diH₂O, 또는 초순 이어야 한다 상호 교환. 편의상, ddH₂O 이제부터 물 정화를 참조 하 사용 됩니다.

3. 얼룩

주의:이 단계에 대 한 장갑을 사용 하는 동안 모든 솔루션 준비는 후드 아래를 수행 합니다.

1. 적어도 10 배 솔루션 얼룩의 두뇌 볼륨을 준비 합니다. 쥐 두뇌, 2% (w/v) 오스뮴 tetroxide (OsO₄) 50 mL에에서 준비 ddH₂O 주식 4% OsO₄ 솔루션의 25 mL 및 ddH₂오의 25 mL
   주의: 오스뮴 tetroxide 휘발성 및 임시 실명 및 호흡기 문제를 일으킬 수 있습니다 하지 않을 경우 적절 하 게 처리. 보조 컨테이너 내에서 적절 한 화학 위험 컨테이너에서 오스뮴 tetroxide를 문의 하는 모든 자료를 삭제 합니다.
2. 새로운 50 mL 원뿔 튜브에 두뇌를 놓고 OsO₄ 솔루션을 추가 합니다. 두뇌는 OsO₄ 조직에서 지질과 반응으로 갈색을 시작 한다.
3. 튜브를 닫고 파라핀과 그것을 철저 하 게 봉인 외피 동안 누설 하지 않습니다 있도록 ( 재료의 표참조) 영화.
   참고:는 오스뮴 휘발성 이며 반응할지 가벼운 튜브, 플라스틱 튜브를 제대로 밀봉 하는 것은 무척 중요 하다. 튜브 추가 보호를 위해 알루미늄 호 일 포장 될 수 있습니다.
4. 2 주 동안 50 rpm에서 궤도 셰이 커에 가볍게 흔들어 4 ° C에서 밀봉 된 튜브를 저장 합니다. 가로로 최고의 혼합 되도록 튜브를 놓습니다. 샘플 흔들어 동안 솔루션에 완전히 빠져들은 확인 합니다.
   참고: 지속적으로 순환 하는 오스뮴은 허용 되지 않습니다, 만약 그것 수 있습니다 완전히 침투 하지 샘플, 그래서 뿌리에 수평 배치는 매우 중요 하다.

4. 포함

1. 샘플은 2 주 동안 OsO₄ incubated 되어, 후에 그것을 세척 ddH₂O 5 시간 실 온 (RT)에서 다음 기간에 대 한: 1, 1, 1, 15, 및 모든 언바운드 OsO₄ 샘플에서 제거 60 분.
   참고: 지난 60 분 교환를 포함 하 여 여러 교류는 밖으로 확산에 순환 시스템에서 모든 오스뮴을 허용 하는 데 필요한.
2. 4 ° c.에서 ddH₂O 30 분 샘플을 씻어
   참고: 오스뮴 샘플, 밖으로 확산 계속 수 있습니다 하지만 그 수량을 크게 이전 단계에서 감소 한다.
3. 결국 수 지로 침투 하는 에탄올과 샘플을 탈수. 탈수, 바꿉니다 ddH₂O (30 분 각 4 ° C에서)에 대 한 다음 에탄올 희석의 10-20 mL: 20% (v/v) 에탄올과 80% (v/v) ddH₂O; 50% (v/v) 에탄올과 50% (v/v) ddH₂O; 70% (v/v) 에탄올 및 30% (v/v) ddH₂O; 90% (v/v) 에탄올과 10% (v/v) ddH₂O; 100%의 에탄올
4. 다음과 같이 아세톤 또는 수 지 희석을 준비 합니다.
   1. ( 재료의 표참조)을 포함 하기 위한 제조업체의 지침에 따라 수 지의 100 mL를 준비 합니다.
   2. 33% (v/v) 수 지-67% 아세톤 솔루션으로 만들기 위해 50 mL 원뿔 튜브에 수 지의 15 mL를 붓고 하 고 100% 유리 증 류 아세톤의 30 mL를 추가 합니다.
   3. 50% (v/v) 수 지-50% 아세톤, 수 지의 22.5 mL 50 mL 원뿔 튜브로 부 어와 100% 유리 증 류 아세톤의 22.5 mL을 추가.
   4. 67% (v/v) 수 지-33% 아세톤 솔루션으로 만들기 위해 수 지의 30 mL 50 mL 원뿔 관에 부 어 하 고 100% 유리 증 류 아세톤의 15 mL를 추가 합니다.
   5. 수 지의 잔여 32.5 mL를 사용 하 여 100% 수 지 아래의 첫 번째 솔루션으로.
5. 수 지 침투 과정 다음 아세톤 및 아세톤 또는 수 지 희석의 10-20 mL를 통해 샘플을 이동 하 여 시작: 4 ° C에서 30 분 동안 100% 아세톤 4 ° C에서 30 분 동안 100% 아세톤 그리고 실 온 (RT)에서 30 분 동안 100% 아세톤.
   참고: 침투 과정의 나머지 부분에서 열린다 실시간
6. 33% (v/v) 수 지 67% 아세톤 3 h RT에 RT, RT에서 3 h 67% (v/v) 수 지 33% 아세톤 및 실시간에 12 h에 대 한 100% 수 지에서 3 h에 대 한 50% (v/v) 수 지-50% 아세톤에 샘플을 담가
7. 병에는 지침에 따라 수 지의 신선한 50 mL 배치를 확인 합니다. 그것은 치료 하실 것입니다 컨테이너에 샘플을 전송 (예., 일회용 금형 재료의 테이블에서에서 설명). 실시간에서 4 시간 동안 신선한 100% 수 지와 함께 샘플을 고취
   참고: 신선한 수 지를 사용 하지 않으면 전날 만든 수 지 성급 하 게, 강화에 시작 되 고 샘플 조작 하기 어려울 것입니다.
8. 45 ° c.에 15 분 동안 진공 오븐에서 샘플을 드
   참고:이 단계는 샘플 내에서 어떤 덫을 놓은 공기 거품을 제거 도움이 될 것입니다 하지만 그것은 중요 하지 않은 데이터의 품질에는 영향을 미치지 것입니다.
9. 마지막으로, 60 ° c.에서 48 h에 대 한 오븐에 샘플을 치료

5입니다. 마이크로-CT

1. 일단 샘플을 치료 껍질 일회용 형을 하 고 마이크로-CT 기계와 스캔.
   참고: 사용 되는 기계에 따라 설정이 달라 집니다. 재료의 테이블에에서 나열 된 저자에 의해 사용 되는 스캐너에 대 한 권장 설정이 130 kV, 0.1 m m 구리 필터 및 몰 리브 덴 소스, 1 초 노출, 프로젝션 4 프레임의 평균 135 µ A. 그러나, 경험 한다 보정 스캐너 개별적으로, 많은 요인 특정 세션 동안 최적의 설정에 영향을 미칠 것입니다.
2. 검사가 완료 되 면, 스캐너 소프트웨어와 함께 컴퓨터에 실험의 스캐너/소프트웨어 조합에 대 한 권장 매개 변수 샘플을 재구성 합니다.
3. 마지막으로, 시각화 하 고 분석 하는 선택의 실험의 소프트웨어를 사용 하 여 복원된 디지털 볼륨 (예제 테이블의 자료 를 참조).

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결과

전통적으로, 두뇌는 구분 병 변 계량 하 고 전극, 찾을 스테인드 하지만이 방법은 오류 발생, 노동 집약, 일반적으로 결과의 추정을 필요 합니다. 마이크로-CT 영상에 대 한 전체 두뇌를 준비 하 여 샘플을 손상의 가능성이 크게 감소, 관심의 기능, 전체 뇌의 맥락에서 분석 될 수 있습니다 및 방법을 빌려준다 많은 샘플의 병렬 처리를 상당히 샘플 준비를 과속.

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토론

다음은 프로토콜에 중요 한 단계: 첫째, PFA와 조지아 동물 perfuse 이후 두뇌를 수정 후의 조합의 사용 했다 조직의 일관 된 전체 오스뮴 침투를 달성 하는 최고. 우리가 테스트 하지 않 았 명시적으로, 비록 그럴듯한 설명이입니다 PFA 고정 가역¹⁵, 반면 조지아 고정은 가역^16,17. 오스뮴 tetroxide에서 2 주간 배양 조직의 전체 침투에 대 한 필?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Paraformaldehyde (PFA)	Electron Microscopy Sciences (EMS)	15710	2% (w/v/) in 1X PBS
Glutaraldehyde (GA)	EMS	16220	2.5% (w/v) GA in 1x PBS
OsO4	EMS	19190	Work in fume hood
Ethanol	Decon Labs	Koptec	140, 190, 200 proof
Acetone	EMS	10015	Glass-distilled
Durcupan ACM resin	Sigma-Aldrich	44610	A, B, C and D components, resin for embedding
Disposable molds	Ted Pella	27114	Suggested
milliQ water (ultrapure water)	Millipore Sigma	QGARD00R1 (or related purifier)	Suggested
Parafilm (paraffin film)	Millipore Sigma	P7793	Suggested paraffin film
Micro-CT scanner	Nikon Metrology Ltd., Tring, UK	X-Tek HMS ST 225	Used by authors
Software for visualizing and analyzing micro-CT scans:
	Volume Graphics	VG Studio Max	Used by authors
	FEI / Thermo Scientific	Avizo	Used by authors
	FEI / Thermo Scientific	Amira	Similar to Avizo
	Mark Sutton & Russell Garwood	Spiers	Free, http://spiers-software.org/
	Pixmeo Sarl	Osirix Lite	Free, https://www.osirix-viewer.com/
	Open Source	FIJI	Free, https://fiji.sc/
	Adobe	Photoshop	Good for analyzing one slice at a time