Une méthode à base de Micro-CT pour caractériser les lésions et la localisation des électrodes dans le cerveau Animal petit

Résumé

Cet article décrit une méthode simple pour préparer des petits cerveaux animaux pour l’imagerie micro-CT, dont les lésions peuvent être quantifiées et électrodes situés avec une grande précision dans le cadre de tout le cerveau.

Résumé

Lésion et électrode de vérification d’emplacement sont traditionnellement fait par l’examen histologique des tranches de cerveau tachées, une procédure longue nécessitant manuelle estimation. Nous décrivons ici une méthode simple et directe pour quantifier les lésions et la localisation des électrodes dans le cerveau qui est moins laborieux et donne des résultats plus détaillés. Cerveau entier est colorées au tétroxyde d’osmium, incorporé en résine et photographié avec un micro-tomodensitomètre. Les scans entraînent des volumes 3D numériques des cerveaux avec des résolutions et des épaisseurs de section virtuel dépendantes de la taille de l’échantillon (12 – 15 et 5 – 6 µm par voxel pour rat et zebra finch brains, respectivement). Les lésions superficielles et profondes peuvent être caractérisées et seul tétrodes, baies de tétrode, lésions électrolytiques, et silicium sondes peuvent également être localisées. Logiciels libres et propriétaires permet aux expérimentateurs d’examiner le volume de l’échantillon de n’importe quel avion et segment le volume manuellement ou automatiquement. Parce que cette méthode génère le volume du cerveau, des lésions et des électrodes peuvent être quantifiées à une beaucoup plus grande que les méthodes actuelles, qui aidera à normaliser les comparaisons au sein et entre les études.

Introduction

Les neuroscientifiques ont compté sur les lésions pendant une longue période afin de comprendre la relation entre la fonction et l’emplacement dans le cerveau. Par exemple, notre compréhension de l’hippocampe comme étant indispensable pour l’apprentissage et la mémoire et du cortex préfrontal comme étant la clé pour le contrôle des impulsions était les deux produits de lésions fortuites dans les humains^1,2. L’utilisation de modèles animaux, cependant, a permis des neuroscientifiques d’exploiter la puissance des lésions en allant au-delà des serendipity, et la fonction de nombreuses zones du cerveau a été élucidée par le biais des études systématiques des relations structure-fonction à travers lésions^3,4.

Pour affecter correctement fonction vers une structure, cependant, les études de lésion exigent des procédures de quantification précise, qui est une région qui a fait défaut. L’étalon-or pour quantifier les lésions actuel est de section, Mont et cerveaux d’image avec un microscope optique. Les tranches imagés sont ensuite mis en correspondance avec les sections plus proche de vous sur un atlas, et les coordonnées approximatives des lésions dans l’ensemble des sujets sont rapportées indirectement, souvent grâce à l’utilisation des images de caméra lucida ou exemple histologique tranches^{3,4 ,5,6,7,8,9,10}.

Au-delà de l’imprécision des procédures de quantification des lésions actuelles, ces techniques sont fastidieuses et sujettes à l’échec. Petits changements dans la rigidité du cerveau, netteté de la lame et la température peut conduire aux sections bâclées, déformées ou déchirées. Les sections peuvent tacher aussi inégalement et être mal photographiées à cause des bulles d’air dans le milieu de montage. Ce qui est important, à la découpe, le contexte en trois dimensions de l’emplacement de la lésion dans le cerveau est perdu, faire une reconstruction 3D précise de la lésion dans le cerveau des difficiles.

Une autre application courante pour des lésions a été de déterminer l’emplacement des simples et multiples enregistrements d’électrodes dans le cerveau. À la fin de la séance d’enregistrement final, chercheurs provoquent des petites lésions électrolytiques à l’extrémité de l’électrode et processus du cerveau histologiquement comme fait dans une expérience de lésion classique¹¹. Cette technique souffre les mêmes inconvénients décrits ci-dessus, avec des problèmes supplémentaires étant que les lésions électrolytiques sont généralement plus grandes que les électrodes utilisées pour les rendre, mais sont généralement assez petites qu’ils sont difficiles à trouver sur le plan histologique. Lorsque plusieurs électrodes sont insérés, comme dans le cas d’un tableau de la tétrode, vérification par le biais de lésions électrolytiques est encore plus difficile. Une alternative aux lésions électrolytiques est l’utilisation d’un colorant sur l’électrode pour plus tard vérifier histologiquement¹², mais cette technique souffre des mêmes inconvénients qui viennent avec l’histologie conventionnelle.

Nous décrivons ici approfondie une méthode décrite récemment¹³ basé sur la coloration des techniques de microscopie électronique (me) et la radiographie tomodensitométrie (micro-CT) qui quantifie les lésions et localise les électrodes dans le cerveau animal petit mieux que courant Méthodes. Micro-CT est une technique d’imagerie dans lequel les rayons x est tournés en un échantillon qui est orientable à 360° pendant qu’un scintillateur recueille les rayons x n’a ne pas déviés de l’échantillon. Il en résulte une reconstruction 3D numérique à haute résolution de l’échantillon qui peut être visualisée dans n’importe quelle orientation et quantifié précisément. De nombreux établissements universitaires ont micro-tomodensitomètres, qui sont également disponibles dans le commerce.

Protocole

Tous les soins et la manipulation expérimentale d’animaux ont été examinées et approuvées par la Harvard Institutional Animal Care et utilisation. La perfusion décrite ici est spécifique pour les rats, mais la procédure est applicable à tous les animaux avec des cerveaux plus petits ou de taille similaire.

1. la perfusion

1. Préparer 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Pour un rat (âge : 0,5 – 1,5 ans, poids : 250 à 600 g), 800 – 1000 mL devrait suffire. 400 mL permet de perfuse l’animal et une autre 400 mL à diluer le fixateur.
2. Préparer le fixateur consistant de paraformaldéhyde à 2 % (p/v) (PFA) et de 2,5 % (p/v) de glutaraldéhyde (GA) dans du PBS 1 x. Pour un rat, 400 mL est suffisante. Économisez 50 mL dans un tube conique de 50 mL pour après fixation du cerveau après la perfusion.
3. Anesthésier le rat avec 4 à 5 % isoflurane gaz (à 0,8 L/min O₂ à 1,0 bar à 21 ° C) pendant 15 min.
4. Injecter une dose létale de pentobarbital de sodium par voie intrapéritonéale (180 mg/kg).
5. Test pour la perte de réflexe chez l’animal en procédant à un examen de réflexe orteil-pincée. Attendre pour commencer la perfusion jusqu'à ce que l’animal a perdu sa réponse réflexe.
6. Suivez l’intracardial décrite précédemment la perfusion et le cerveau extraction protocole¹⁴ avec les solutions suivantes : perfuse l’animal avec 400 mL de PBS 1 x 125 mm Hg pour enlever le sang. Une fois que tout le sang a été supprimé et remplacé par 1 x PBS, commencer perfusant avec 400 mL d’une solution de 2 %, PFA et 2,5 % GA dissous dans la solution de 1 PBS x 125 mm Hg.
   Remarque : Si la procédure est menée à un animal qui n’est pas un rat, les composants seulement importants de la procédure de perfusion sont l’utilisation de 1 x PBS et 2 % PFA, GA de 2,5 % dans du PBS 1 x. Les volumes de la solution et la pression de perfusion peuvent être réglés selon les espèces.

2. après fixation

1. Placer le cerveau extrait chez 2 % PFA, 2,5 % GA dans 1 x solution de PBS (même solution utilisée pour perfuse l’animal précédemment). Assurez-vous que le volume de la solution est au moins 10 x le volume du cerveau. Pour les rats, placer le cerveau dans un tube conique de 50 mL avec 50 mL de solution. Conserver l’échantillon dans après fixation pendant 2 – 3 jours, en secouant légèrement à 4 ° C.
   Remarque : Si l’échantillon est dans un tube conique de 50 mL, le placer horizontalement dans un agitateur orbital assurera les meilleurs résultats.
2. Après que l’échantillon a été post fixé pour longtemps assez, laver l’échantillon dans l’eau bidistillée (ddH₂O), de l’eau désionisée (diH₂O) ou l’eau ultrapure (voir Table des matières) de quatre fois les durées suivantes : 1, 1, 1 et 15 min.
   Remarque : Pour ce protocole, ddH₂O, diH₂O ou eau ultrapure devrait être interchangeable. Pour plus de simplicité, ddH₂O servira pour désigner désormais l’eau purifiée.

3. coloration

ATTENTION : Pour cette étape, procéder à toutes les préparations de solution sous un capot tout en utilisant des gants.

1. Préparer au moins 10 x le volume du cerveau de la solution de coloration. Cerveau de rat, préparer 50 mL de 2 % (p/v) le tétroxyde d’osmium (OsO₄) FD₂O en combinant 25 mL de solution mère de₄ OsO de 4 % et de 25 mL de ddH₂O.
   ATTENTION : tétroxyde d’Osmium est volatile et peut provoquer une cécité temporaire et des problèmes respiratoires si n’est pas manipulé convenablement. Jeter tous les matériaux qui en contact avec le tétroxyde d’osmium dans un récipient approprié risque chimique dans un conteneur secondaire.
2. Placer le cerveau dans un nouveau tube conique de 50 mL et ajouter la solution de₄ OsO. Le cerveau devrait commencer à virer au brun comme OsO₄ réagit avec des lipides dans les tissus.
3. Fermer le tube et sceller soigneusement avec paraffine film (voir Table des matières) pour s’assurer qu’il ne fuit pas durant l’incubation.
   Remarque : L’osmium est volatile et réagira légèrement avec le plastique du tube, le tube d’étanchéité correctement est donc très important. Les tubes peuvent être enroulées avec du papier d’aluminium pour une protection supplémentaire.
4. Rangez le tuyau fermé à 4 ° C, secouant légèrement dans un agitateur orbital à 50 tr/min pendant 2 semaines. Placer le tube horizontalement pour assurer le meilleur mélange. S’assurer que l’échantillon est entièrement immergée dans la solution et en agitant.
   Remarque : Si l’osmium n’est pas autorisé à circuler en permanence, il ne peut pas pleinement pénétrer l’échantillon, positionnement horizontal sur le shaker est donc très important.

4. incorporation

1. Après que l’échantillon a été incubé à l’OsO₄ pendant 2 semaines, lavez-le avec FD₂O 5 fois à température ambiante (RT) pour les durées suivantes : 1, 1, 1, 15 et 60 min pour enlever tous les indépendant OsO₄ dans l’échantillon.
   Remarque : Les échanges multiples, y compris le dernier échange de 60 min, sont nécessaires pour permettre à tous de l’osmium dans le système circulatoire à diffuser sur.
2. Laver l’échantillon avec les ddH₂O pendant 30 min à 4 ° C.
   NOTE : Osmium peut continuer à diffuser de l’échantillon, mais sa quantité devrait être considérablement réduite à l’étape précédente.
3. Déshydrater l’échantillon avec de l’éthanol pour finalement il infiltrer avec de la résine. Pour déshydrater, remplacer la ddH₂O avec 10 à 20 mL de dilutions suivantes d’éthanol (de 30 min chacun à 4 ° C) : 20 % (v/v) d’éthanol et de 80 % (v/v) FD₂O ; éthanol à 50 % (v/v) et 50 % (v/v) FD₂O ; l’éthanol à 70 % (v/v) et 30 % (v/v) FD₂O ; éthanol à 90 % (v/v) et 10 % (v/v) FD₂O ; 100 % d’éthanol.
4. Préparer des dilutions de l’acétone/résine comme suit.
   1. Préparer 100 mL de la résine pour l’enrobage (voir Table des matières) selon les instructions du fabricant.
   2. Pour rendre la résine 33 % (v/v) - 67 % solution d’acétone, versez 15 mL de résine dans un tube conique de 50 mL et ajouter 30 mL d’acétone distillée à verre de 100 %.
   3. Pour rendre l’acétone de résine - 50 % 50 % (v/v), verser 22,5 mL de résine dans un tube conique de 50 mL et ajouter 22,5 mL d’acétone distillée à verre de 100 %.
   4. Pour rendre la résine 67 % (v/v) - 33 % solution d’acétone, verser 30 mL de résine dans un tube conique de 50 mL et ajouter 15 mL d’acétone distillée à verre de 100 %.
   5. Utiliser le mL 32,5 restant de résine pour la première solution de résine 100 % ci-dessous.
5. Commencer le processus d’infiltration de résine en déplaçant l’échantillon dans 10-20 mL d’acétone et l’acétone/résine dilutions suivantes : acétone 100 % pendant 30 min à 4 ° C ; acétone à 100 % pendant 30 min à 4 ° C ; et l’acétone à 100 % pendant 30 min à température ambiante (RT).
   NOTE : Le reste du processus d’infiltration aura lieu à température ambiante.
6. Immergez l’échantillon à 33 % (v/v) 67 % de résine acétone pendant 3 h à RT, puis acétone résine - 50 % 50 % (v/v) pendant 3 h à RT, acétone 33 % 67 % (v/v) de résine pendant 3 h à RT et 100 % de résine pendant 12 h à température ambiante.
7. Faire un lot de frais 50 mL de résine en suivant les instructions sur la bouteille. Transférer l’échantillon dans le récipient dans lequel il sera guéri (e.g., les moules jetables décrits dans la Table des matières). Faire infuser l’échantillon avec une résine 100 % frais pendant 4 heures à température ambiante.
   Remarque : Si la résine fraîche n’est pas utilisée, la résine faite le jour précédent commencera à durcir prématurément, et l’échantillon sera difficile à manipuler.
8. Une solution contenant l’échantillon dans une étuve à vide pendant 15 min à 45 ° C.
   Remarque : Cette étape permettra d’éliminer les bulles d’air piégées dans l’échantillon, mais il n’est pas essentiel et n’affectera pas la qualité des données.
9. Enfin, guérir l’échantillon dans un four pendant 48 h à 60 ° C.

5. micro-CT

1. Une fois que l’échantillon a été guérie, décoller le moule jetable et Scannez-le avec la machine de micro-CT.
   Remarque : Selon l’appareil utilisé, les réglages seront différents. Pour le scanner utilisé par les auteurs énumérés dans la Table des matières, les paramètres recommandés sont 130 kV, µA 135 avec un filtre de 0,1 mm en cuivre et une source de molybdène, une exposition de 1 seconde et une moyenne de 4 images par projection. Cependant, expérimentateurs doivent étalonner le scanner individuellement, car de nombreux facteurs affectera les réglages optimaux au cours d’une session particulière.
2. Une fois le scan terminé, reconstruire l’échantillon avec les paramètres recommandés pour combinaison scanner/logiciels de l’expérimentateur sur un ordinateur avec le logiciel du scanner.
3. Enfin, visualiser et analyser le volume numérique reconstitué à l’aide du logiciel de l’expérimentateur de choix (voir Table des matières par exemple).

Résultats

Traditionnellement, les cerveaux est sectionnés et colorés pour quantifier les lésions et de localiser les électrodes, mais cette méthode est sujette aux erreurs, il y a beaucoup de travail et nécessite généralement l’estimation des résultats. En préparant toute cervelle d’imagerie micro-CT, la probabilité d’endommager les échantillons est considérablement réduite, caractéristiques d’intérêt peuvent être analysées dans le contexte de l’ensemble du cerveau, et ...

Discussion

Voici les étapes critiques du protocole : tout d’abord, l’utilisation d’une combinaison de PFA et GA perfuse l’animal et ensuite fixer le cerveau a été primordiale à la réalisation de pénétration d’osmium pleinement cohérente du tissu. Bien que nous n’ai pas tester cela explicitement, une explication plausible est que la fixation de la PFA est réversible¹⁵, alors que la fixation GA n’est pas réversible^16,17. Parce ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Paraformaldehyde (PFA)	Electron Microscopy Sciences (EMS)	15710	2% (w/v/) in 1X PBS
Glutaraldehyde (GA)	EMS	16220	2.5% (w/v) GA in 1x PBS
OsO4	EMS	19190	Work in fume hood
Ethanol	Decon Labs	Koptec	140, 190, 200 proof
Acetone	EMS	10015	Glass-distilled
Durcupan ACM resin	Sigma-Aldrich	44610	A, B, C and D components, resin for embedding
Disposable molds	Ted Pella	27114	Suggested
milliQ water (ultrapure water)	Millipore Sigma	QGARD00R1 (or related purifier)	Suggested
Parafilm (paraffin film)	Millipore Sigma	P7793	Suggested paraffin film
Micro-CT scanner	Nikon Metrology Ltd., Tring, UK	X-Tek HMS ST 225	Used by authors
Software for visualizing and analyzing micro-CT scans:
	Volume Graphics	VG Studio Max	Used by authors
	FEI / Thermo Scientific	Avizo	Used by authors
	FEI / Thermo Scientific	Amira	Similar to Avizo
	Mark Sutton & Russell Garwood	Spiers	Free, http://spiers-software.org/
	Pixmeo Sarl	Osirix Lite	Free, https://www.osirix-viewer.com/
	Open Source	FIJI	Free, https://fiji.sc/
	Adobe	Photoshop	Good for analyzing one slice at a time