Ein Mikro-CT-basierte Verfahren zur Charakterisierung von Läsionen und Lokalisierung von Elektroden in kleinen tierischen Gehirnen

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt eine einfache Methode zur Vorbereitung von kleinen tierischen Gehirne für Mikro-CT-Bildgebung, in welche Läsionen quantifiziert werden können und Elektroden mit hoher Präzision im Kontext des gesamten Gehirns gelegen.

Zusammenfassung

Verifizierung der Läsion und Elektrode Lage erfolgt traditionell über histologische Untersuchung von gefärbten Gehirnscheiben ein zeitaufwändiges Verfahren, die manuelle Schätzung erfordert. Hier beschreiben wir eine einfache, unkomplizierte Methode zur Quantifizierung der Läsionen und Auffinden von Elektroden in das Gehirn, das ist weniger mühsam und liefert genauere Ergebnisse. Ganze Köpfe sind mit Osmium ausgefällt befleckt, in Harz eingebettet und abgebildet mit einem Mikro-CT-Scanner. Die Scans führen in 3D digital Bänden der Gehirne mit Auflösungen und virtuellen Bereich stärken abhängig von Größe der Stichprobe (12 – 15 und 5 – 6 µm pro Voxel für Ratte und Zebrafinken Gehirne, beziehungsweise). Oberflächlichen und tiefe Läsionen können charakterisiert werden und einzelne Tetroden, Tuberkuloseinfektion Arrays, elektrolytische Läsionen und Silizium-Sonden können auch lokalisiert werden. Freie und proprietäre Software kann Experimentatoren, das Probenvolumen von Flugzeug und Segment die Lautstärke manuell oder automatisch zu prüfen. Da diese Methode ganze Hirnvolumen generiert, können Läsionen und Elektroden in viel höherem Maße als in gängigen Methoden quantifiziert werden die helfen Vergleiche innerhalb und zwischen den Studien zu standardisieren.

Einleitung

Neurowissenschaftler haben auf Läsionen für eine lange Zeit verlassen, um die Beziehung zwischen Funktion und Position im Gehirn zu verstehen. Zum Beispiel wurden unser Verständnis des Hippocampus als unerlässlich für lernen und Gedächtnis und des präfrontalen Kortex als Schlüssel zur Impulskontrolle beide Produkte von glücklichen Zufälle Läsionen im Menschen^1,2. Die Verwendung von Tiermodellen, jedoch konnten Neurowissenschaftler um die Macht der Läsionen durch hinauszugehen, Serendipity, und hat die Funktion der unzähligen Hirnareale durch systematische Untersuchungen der Struktur-Funktions-Beziehungen durch aufgeklärt Läsionen^3,4.

Um richtig Funktion einer Struktur zuzuordnen, jedoch erfordern Läsion Studien präzise Quantifizierung Verfahren, die eine Fläche, die gefehlt hat. Der aktuelle Goldstandard zur Quantifizierung der Läsionen ist Abschnitt, Berg und Bild Gehirne mit einem Lichtmikroskop. Die abgebildeten Scheiben sind dann in den nächsten Abschnitten auf einer Atlas abgestimmt, und die ungefähren Koordinaten der Läsionen über Themen werden indirekt gemeldet, oft durch den Einsatz von Kamera Lucida Bilder oder Beispiel histologischen Scheiben^{3,4 ,5,6,7,8,9,10}.

Über die Ungenauigkeit der derzeitigen Läsion Quantifizierung Verfahren sind diese Verfahren zeitaufwändig und fehleranfällig. Kleine Veränderungen im Gehirn Steifigkeit, Klinge Schärfe und Temperatur kann zu verpfuschten, verzogene oder zerrissene Abschnitte führen. Abschnitte können auch ungleichmäßig beflecken und unsachgemäß wegen Luftblasen in das Eindeckmittel abgebildet werden. Wichtig ist, ist beim Schneiden, dreidimensionalen Rahmen der Ort der Läsion im Gehirn verloren, präzise 3D-Rekonstruktion der Läsion im Gehirn schwierig machen.

Eine weitere häufige Anwendung für Läsionen wurde zur Bestimmung der Position von Einzel- und mehrere Aufnahmen der Elektrode im Gehirn. Am Ende der letzten Aufnahmesession Forscher induzieren kleine elektrolytische Läsionen an der Elektrodenspitze und verarbeitet das Gehirn histologisch wie in einem konventionellen Läsion Experiment¹¹getan. Diese Technik leidet die gleichen Nachteile, die oben beschrieben, mit zusätzlichen Problemen ist, dass die elektrolytischen Läsionen meist größer als die Elektroden verwendet sind, um sie zu machen, aber sind in der Regel klein genug, die sie herausfordern, um histologisch zu finden. Wenn mehrere Elektroden, wie im Fall von einer Tuberkuloseinfektion Array eingesetzt werden ist eine Verifizierung durch elektrolytische Läsionen noch schwieriger. Eine Alternative zur elektrolytischen Läsionen ist die Verwendung eines Farbstoffes auf der Elektrode später histologisch¹²überprüfen, aber diese Technik leidet die gleichen Nachteile, die mit konventionellen Histologie kommen.

Hier beschreiben wir eingehende einer kürzlich beschriebenen Methode¹³ basierend auf Färbetechniken in Elektronenmikroskopie (EM) und Röntgen-Computertomographie (Mikro-CT), die quantifiziert Läsionen und sucht Elektroden in kleinen tierischen Gehirnen besser als Strom Methoden. Mikro-CT ist ein bildgebendes Verfahren, in dem Röntgenstrahlen an einer Probe geschossen werden, die 360 ° gedreht wird, während ein Szintillator die Röntgenstrahlen nicht abgelenkt durch die Probe sammelt. Das Ergebnis ist eine hochauflösende digitale 3D-Rekonstruktion der Probe, die visualisiert in beliebiger Orientierung und präzise quantifiziert werden kann. Viele Hochschulen haben Mikro-CT-Scannern, die auch im Handel erhältlich sind.

Protokoll

Alle Pflege und experimentelle Manipulation von Tieren wurden überprüft und durch die Harvard institutionelle Animal Care and Use Committee genehmigt. Die hier beschriebenen Perfusion ist spezifisch für Ratten, aber das Verfahren ist anwendbar auf alle Tiere mit kleineren oder ähnlich große Gehirne.

(1) perfusion

1. Bereiten Sie 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS). Für eine Ratte (Alter: 0,5 – 1,5 Jahre alt, Gewicht: 250-600 g), 800-1.000 mL sollte ausreichend sein. Verwenden Sie 400 mL, um das Tier und eine zusätzliche 400 mL verdünnen das Fixiermittel durchspülen.
2. Bereiten Sie das Fixiermittel, bestehend aus 2 % (w/V) Paraformaldehyd (PFA) und 2,5 % (w/V) Glutaraldehyd (GA) mit 1 X PBS-Puffer. Für eine Ratte ist 400 mL ausreichend. Sparen Sie 50 mL in einen 50 mL konische Rohr für Post-Fixierung des Gehirns nach Perfusion.
3. Die Ratte mit 4 – 5 % Isofluran Gas (bei 0,8 L/min O₂ bei 1,0 Bar bei 21 ° C) 15 Minuten lang zu betäuben.
4. Eine tödliche Dosis von Natrium-Pentobarbital intraperitoneale Injektion (180 mg/kg).
5. Test für reflex Verlust in das Tier durch die Durchführung einer Zehe-Prise reflex Prüfung. Warten Sie, um die Durchblutung zu beginnen, bis das Tier seinen Reflexe Antwort verloren hat.
6. Folgen Sie den zuvor beschriebenen Intracardial Perfusion und Gehirn Extraktion Protokoll Nr.¹⁴ mit den folgenden Lösungen: Durchspülen des Tieres mit 400 mL 1 X PBS bei 125 mm Hg, das Blut zu entfernen. Sobald alle Blut wurde entfernt und ersetzt mit 1 X PBS, beginnen Sie Vorrichtung mit 400 mL einer Lösung von 2 % PFA und 2,5 % GA aufgelöst in 1 X PBS bei 125 mm Hg.
   Hinweis: Wenn das Verfahren in ein Tier, die keine Ratte ist durchgeführt wird, sind die einzig wichtigen Komponenten des Verfahrens Perfusion der Verwendung von 1 x PBS und 2 % PFA, 2,5 % GA mit 1 X PBS-Puffer. Die Lösung-Bände und Perfusionsdruck können je nach Tierart angepasst werden.

(2) Post-Fixierung

1. Legen Sie die extrahierte Gehirn in 2 % PFA, 2,5 % GA 1 x PBS-Lösung (gleiche Lösung verwendet, um das Tier vorher durchspülen). Sicherstellen Sie, dass das Volumen der Lösung mindestens 10 x das Volumen des Gehirns ist. Legen Sie für Ratten das Gehirn in ein 50 mL konische Röhrchen mit 50 mL der Lösung. Speichern Sie die Probe in Post-Fixierung für 2 – 3 Tage, schütteln leicht bei 4 ° c
   Hinweis: Wenn die Probe in einem 50 mL konische Röhrchen ist, indem Sie sie horizontal auf einem Orbitalschüttler die besten Ergebnisse gewährleistet.
2. Nachdem die Probe für lange genug nach dem feststeht, waschen Sie die Probe in bidestilliertem Wasser (DdH₂O), deionisiertes Wasser (DiH₂O) oder Reinstwasser (siehe Tabelle der Materialien) viermal für die folgenden Laufzeiten: 1, 1, 1 und 15 Minuten.
   Hinweis: Für dieses Protokoll sollte DdH₂O, DiH₂O oder Reinstwasser austauschbar sein. Der Einfachheit halber wird DdH₂O fortan verweisen auf gereinigtes Wasser verwendet werden.

3. Färbung

Achtung: In diesem Schritt führen Sie alle Lösung Vorbereitungen unter einer Haube während der Verwendung von Handschuhen.

1. Bereiten Sie mindestens 10 x das Hirnvolumen der Färbelösung vor. Ratte Gehirn Vorbereitung 50 mL 2 % (w/V) Osmium ausgefällt (OsO₄) DdH₂O durch die Kombination von 25 mL Stammlösung 4 % OsO₄ und 25 mL DdH₂O.
   Achtung: Osmium ausgefällt flüchtig und vorübergehende Blindheit und Atemprobleme verursachen kann wenn nicht angemessen behandelt. Entsorgen Sie alle Materialien, die die Osmium ausgefällt in einem entsprechenden Chemisches Risiko-Behälter in einem sekundären Container kontaktieren.
2. Das Gehirn in einem neuen 50 mL konische Röhrchen geben Sie und die OsO₄ Lösung. Das Gehirn sollte beginnen zu bräunen als OsO₄ mit Lipiden im Gewebe reagiert.
3. Das Röhrchen verschließen und versiegeln Sie es gründlich mit Paraffin film (siehe Tabelle der Materialien), um sicherzustellen, dass es nicht während der Inkubation leckt.
   Hinweis: Die Osmium ist flüchtig und reagiert leicht mit dem Kunststoff des Schlauchs, so dass das Rohr richtig Abdichtung sehr wichtig ist. Das Rohr kann mit Alu-Folie für zusätzlichen Schutz umwickelt werden.
4. Speichern der versiegelten Tube bei 4 ° C auf einem Orbitalschüttler bei 50 u/min für 2 Wochen leicht schütteln. Legen Sie das Rohr horizontal, um die beste Mischung zu gewährleisten. Sicherstellen Sie, dass die Probe unter Schütteln vollständig in die Lösung eingetaucht ist.
   Hinweis: Wenn die Osmium ständig zirkulieren nicht zulässig ist, kann es nicht vollständig die Probe eindringen so horizontale Platzierung auf den Shaker sehr wichtig.

4. einbetten

1. Nachdem die Probe OsO₄ für 2 Wochen inkubiert, waschen Sie ihn mit DdH₂O 5 Mal bei Raumtemperatur (RT) für die folgenden Laufzeiten: 1, 1, 1, 15 und 60 min., alle ungebundenen OsO-₄ in der Probe zu entfernen.
   Hinweis: Mehrere Börsen, einschließlich des letzten 60 Minuten Austauschs sind erforderlich, damit die Osmium in das zirkulierende System, heraus zu verbreiten.
2. Waschen Sie die Probe mit DdH₂O für 30 min bei 4 ° C.
   Hinweis: Osmium kann weiterhin aus der Probe zu verbreiten, aber die Menge sollte aus dem vorherigen Schritt stark reduziert werden.
3. Entwässern Sie die Probe mit Ethanol um schließlich mit Harz zu infiltrieren. Um zu entwässern, ersetzen die DdH₂O mit 10 – 20 mL der folgenden Ethanol-Verdünnungen (für jeweils 30 min. bei 4 ° C): 20 % (V/V) Ethanol und 80 % (V/V) DdH₂O; 50 % (V/V) Ethanol und 50 % (V/V) DdH₂O; 70 % (V/V) Ethanol und 30 % (V/V) DdH₂O; 90 % (V/V) Ethanol und 10 % (V/V) DdH₂O; 100 % Ethanol.
4. Aceton/Harz-Verdünnungen wie folgt vorbereiten.
   1. Bereiten Sie 100 mL des Harzes für das Einbetten (siehe Tabelle der Materialien), gemäß den Anweisungen des Herstellers.
   2. Um 33 % (V/V) Harz - 67 % Aceton-Lösung machen, Gießen Sie 15 mL Harz in ein 50 mL konische Röhrchen und 30 mL 100 % Glas destilliert Aceton.
   3. Um 50 % (V/V) Harz - 50 % Aceton machen, Gießen Sie 22,5 mL Harz in ein 50 mL konische Röhrchen und 22,5 mL 100 % Glas destilliert Aceton.
   4. Um 67 % (V/V) Harz - 33 % Aceton-Lösung machen, Gießen Sie 30 mL Harz in ein 50 mL konische Röhrchen und 15 mL 100 % Glas destilliert Aceton.
   5. Verwenden Sie die restliche 32,5 mL Harz, als die erste Lösung 100 % Harz unten.
5. Beginnen die Harz Infiltration durch Verschieben der Probe durch 10-20 mL der folgenden Aceton und Aceton/Harz Verdünnungen: 100 % Aceton für 30 min bei 4 ° C; 100 % Aceton für 30 min bei 4 ° C; und 100 % Aceton für 30 min bei Raumtemperatur (RT).
   Hinweis: Der Rest der Infiltrationsprozess wird bei RT stattfinden
6. Eintauchen der Probe in 33 % (V/V) Harz 67 % Aceton für 3 h bei RT, dann 50 % (V/V) Harz - 50 % Aceton für 3 h bei RT, 67 % (V/V) Harz 33 % Aceton für 3 h bei RT und 100 % Harz für 12 h bei RT
7. Machen Sie eine frische 50 mL Charge gemäß den Anweisungen auf der Flasche. Übertragen Sie die Probe auf den Container, in dem es geheilt werden (zB., die verfügbaren Formen beschrieben in Tabelle der Materialien). Infusion die Probe mit frischen 100 % Harz für 4 Stunden bei RT
   Hinweis: Wenn frisches Harz nicht verwendet wird, das Harz am Vortag startet vorzeitig aushärten lassen, und die Probe werden schwer zu manipulieren.
8. Degas die Probe in einem Vakuumofen für 15 min bei 45 ° C.
   Hinweis: Dieser Schritt hilft eingeschlossene Luftblasen innerhalb der Probe zu entfernen, aber es ist unwesentlich und hat keine Auswirkungen auf die Qualität der Daten.
9. Zu guter Letzt heilen Sie die Probe in einem Ofen für 48 h bei 60 ° C.

5. Micro-CT

1. Sobald die Probe geheilt hat, abziehen der Einweg-Form und Scannen Sie es mit der Mikro-CT-Maschine.
   Hinweis: Abhängig von der Maschine verwendet, werden die Einstellungen unterschiedlich sein. Für den Scanner verwendet von den Autoren, die in der Tabelle der Materialienaufgeführt, die empfohlenen Einstellungen sind 130 kV, 135 µA mit 0,1 mm Kupfer Filter und einer Molybdän-Quelle, eine 1-Sekunden-Belichtung und einen Durchschnitt von 4 Frames pro Projektion. Jedoch sollten Experimentatoren den Scanner einzeln, kalibrieren, wie optimale Einstellungen während einer bestimmten Sitzung durch viele Faktoren beeinflusst werden.
2. Sobald der Scan abgeschlossen ist, die Probe mit den empfohlenen Parametern für den Experimentator Scanner/Software-Kombination auf einem Computer mit der Scannersoftware zu rekonstruieren.
3. Zu guter Letzt visualisieren und analysieren die rekonstruierte digitale Lautstärke mit der Experimentator Software der Wahl (siehe Tabelle der Materialien für Beispiele).

Ergebnisse

Traditionell, Gehirne sind geschnitten und gefärbt um Läsionen zu quantifizieren und Elektroden zu finden, aber diese Methode ist fehleranfällig, arbeitsintensiv, und erfordert in der Regel eine Einschätzung der Ergebnisse. Durch die ganze Gehirne für die Mikro-CT-Bildgebung Vorbereitung, die Wahrscheinlichkeit einer Beschädigung der Proben ist stark reduziert, Sehenswürdigkeiten im Kontext des gesamten Gehirns analysiert werden können und die Methode eignet sich für parallele Ve...

Diskussion

Folgende sind wichtige Schritte für das Protokoll: Erstens die Verwendung einer Kombination aus PFA und GA Durchspülen des Tieres und anschließend nach dem Beheben des Gehirns war ausschlaggebend für die konsequente voll Osmium Durchdringung des Gewebes zu erreichen. Obwohl wir dies nicht explizit testen, ist eine plausible Erklärung, dass PFA Fixierung reversible¹⁵, GA-Fixierung ist nicht reversibel^16,17. Da eine zweiwöchige Inkubat...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Paraformaldehyde (PFA)	Electron Microscopy Sciences (EMS)	15710	2% (w/v/) in 1X PBS
Glutaraldehyde (GA)	EMS	16220	2.5% (w/v) GA in 1x PBS
OsO4	EMS	19190	Work in fume hood
Ethanol	Decon Labs	Koptec	140, 190, 200 proof
Acetone	EMS	10015	Glass-distilled
Durcupan ACM resin	Sigma-Aldrich	44610	A, B, C and D components, resin for embedding
Disposable molds	Ted Pella	27114	Suggested
milliQ water (ultrapure water)	Millipore Sigma	QGARD00R1 (or related purifier)	Suggested
Parafilm (paraffin film)	Millipore Sigma	P7793	Suggested paraffin film
Micro-CT scanner	Nikon Metrology Ltd., Tring, UK	X-Tek HMS ST 225	Used by authors
Software for visualizing and analyzing micro-CT scans:
	Volume Graphics	VG Studio Max	Used by authors
	FEI / Thermo Scientific	Avizo	Used by authors
	FEI / Thermo Scientific	Amira	Similar to Avizo
	Mark Sutton & Russell Garwood	Spiers	Free, http://spiers-software.org/
	Pixmeo Sarl	Osirix Lite	Free, https://www.osirix-viewer.com/
	Open Source	FIJI	Free, https://fiji.sc/
	Adobe	Photoshop	Good for analyzing one slice at a time