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要約

In vitro における B 細胞を形質細胞分化モデルに報告多段階培養システムを使用して。

要約

形質細胞 (Pc) 抗体の大量分泌し、活性化されている B 細胞から発生します。Pc は骨髄や粘膜に位置する希少な細胞、体液性免疫を確保します。それらの低周波と場所のため Pc の研究が困難な人間に。我々 は PC に B を報告選択した生体内で発生した連続細胞分化を再現することができるサイトカインや活性化の分子の組み合わせを用いた in vitro 分化モデル。この in vitro モデル、メモリー B 細胞 (MBCs) が前の plasmablasts (prePBs) plasmablasts に (PBs)、早く Pc を区別するために、最終的に、長命に Pc、表現型を閉じる健常者.の対応するまた、オープン アクセス バイオインフォマティクス PC 分化に関連する GEP データから最も顕著な情報を分析するためのツールを建てた。PC 分化し現在の研究ではヒトの B を勉強するこれらのリソースを使用することができます、PC 分化ヒト B 中に後成の要因の遺伝子発現制御を検討しました。

概要

B 細胞の形質細胞 (Pc) への分化は、体液性免疫に欠かせない感染症1に対してホストを保護します。PC 分化する B 抗体の分泌に合わせて転写能力と代謝に大きな変化に関連付けられます。B を PC の分化を制御する転写因子が広く研究されているし、明らかに排他的なネットワーク B および PC 特異的転写因子 (TFs)2。B 細胞の PAX5、BCL6 および BACH2 TFs が B 細胞アイデンティティ2,3の保護者です。IRF4、 PRDM1エンコード BLIMP1 およびXBP1 PC TF の誘導が B 細胞遺伝子を消すし、調整された抗体分泌細胞転写プログラム3,4,5を誘発します。これら協調的な転写変更は膜結合型フォームから免疫グロブリン重鎖2,3,の分泌された形態への切り替えと Ig 遺伝子転写活性化に関連付けられています。4. PC 分化する B が小胞体に関与する遺伝子の誘導とリンクされ、ゴルジ装置関数の合成を収容し PC で重要な役割を再生する知られている小胞体ストレス応答 (UPR) アクティベーションを併用免疫グロブリンは、6、7を分泌します。TF XBP1 は、この細胞の適応8,9,10の主要な役割を果たしています。

B 細胞と Pc は、体液性免疫の主要選手です。生物学を理解する生産と通常のプラズマ細胞の生存効率的な免疫応答を確保し、自己免疫疾患や免疫不全を防止する必要がある治療上の介在の重要ですコントロールを処理します。PC は、完全生物学的特性、特に人間を妨げる解剖位置で行われる初期の分化段階で希少な細胞です。多段階培養システムを使用して、PC の差別化モデルに体外 B を報告した.このモデルを再現した連続細胞分化と成熟 vivo11,12,13.別の臓器に発生します。最初のステップでメモリー B 細胞は最初に 4 日間の CD40 リガンド、オリゴデオキシヌクレオチドおよびサイトカインの組み合わせによってアクティブ化され、preplasmablasts (PrePBs) に分化します。2 番目のステップでは、preplasmablasts plasmablasts (PBs) に分化する CD40L とオリゴデオキシヌクレオチド刺激の取り外しとサイトカインの組み合わせを変更することによって引き起こされます。3 番目のステップでは、plasmablasts は、初期 Pc にサイトカイン組み合わせ11,12を変更することによって区別するために引き起こされます。4 番目のステップは、培養骨髄間質細胞のエアコンの中でこれらの初期の Pc によって完全に成熟した Pc を取得する導入されたか、成長因子13を選択しました。これらの成熟した Pc 数ヶ月体外を生き残るため、免疫グロブリン (図 1) を大量に分泌します。興味深いことに、私たちの in vitro モデルを繰り返す、協調的な転写変更と検出された生体内で11,12,13,14 をすることができます PC の段階に別の B の表現型 ,15。Pc は、希少な細胞と in vitro 分化モデル PC 分化ヒト B を勉強することができます。

プロトコル

ヘルシンキ宣言と生物資源のモンペリエ大学病院センターの契約に基づきガイドラインをプロトコルに従います。

1. 培養正常形質細胞分化のモデルで

注:Pc は、4 つのステップ文化11,12,13を通じて生成されます。

  1. B 細胞の増幅と分化
    1. 記憶 B 細胞の浄化のための健常人末梢血細胞を使用します。
    2. RPMI 1640 媒体の 24.5 ml 血の 7.5 mL を希釈します。
    3. 部屋の温度密度勾配 (例えば、Ficoll) の 12.5 mL を滅菌 50 mL の円錐管に追加します。優しく 32 ml 希釈血液の密度勾配をオーバーレイします。2 段階の混合を最小限に抑えます。
    4. ブレーキ 500 x gで 20 分間遠心分離機のオフ。希薄プラズマ/密度勾配インターフェイスから、PBMCs を収集し滅菌 50 mL のチューブにセルを配置し、ハンクの平衡塩溶液と 45 mL に完了します。
    5. 500 × gで 5 分間細胞を遠心します。慎重に上澄みを除去し、ペレットを維持します。
    6. 500 x gで RPMI1640/10% 牛胎児血清 (FCS) の遠心 5 分 45 mL を加えます。慎重に上澄みを除去し、ペレットを維持します。PBS/2% FCS の 30 mL を追加します。
    7. CD2 + 抗 CD2 磁気ビーズを使用してセルを削除します。1 つのターゲット細胞の 4 ビーズを追加します。4 ° C で 30 分間加温します。
      1. 磁石を用いた細胞分離用非連結の細胞から別のビード区切セルです。非連結の細胞を収集し、抗 CD19 APC、CD27 PE 抗体抗と細胞ペレット 4 ° C (106細胞の抗体の 2 μ L) で 15 分間インキュベートします。
      2. PBS/10% ヤギ血清で 2 回洗います。
      3. FSC と SSC のプロットに汚染のイベントを削除します。FSC A 対 SSC、FSC H 対 SSC H プロットの残骸を削除し、選択総末梢血白血球ポピュレーションのシングレットをプロットします。CD19/CD27 と CD19 メモリー B 細胞を選択+CD27+。
      4. 95% の高純度で、セルソーターを用いた MBCs を浄化します。
    8. 50 mg/mL ヒト トランスフェリンと 5 ミリグラム/ml ヒトインスリンを添加した IMDM と 10 %fcs を使用してすべての文化手順に従います。
    9. プレート 6 ウェル培養皿に MBCs を精製した (1.5 x 105 5 mL/よく MBCs/mL)、IL-2 との 4 日間 (20 U/mL)、IL-10 (50 ng/mL) と IL 15 (10 ng/mL)。
      1. ホスホロチオエート CpG ODN 2006 年ヒスチジン付けられた遺伝子組換えひと可溶性 CD40L を追加 (sCD40L; 50 ng/mL) と反 polyhistidine mAb (5 mg/mL) MBCs 活性化 (図 1)。低い増幅12に同じサイトカイン カクテルだけで sCD40L または ODN による活性化をもたらします。最大数を鉛でここで説明されている活性化シグナルの組み合わせには、B 細胞と PrePBs11,12 (図 1) がアクティブ化されます。
      2. 遺伝子発現プロファイルの浄化 CD38/CD20-- PrePBs、日 4、セルソーター (図 2) を用いたします。
  2. :Hiv 細胞の生成
    1. 4 日目でのセルをカウントします。
    2. 2 mL の 105/mL × 2.5 で 12 ウェル培養皿の細胞をプレート/まあ。
    3. CpG オリゴヌクレオチドと sCD40L の取り外しと新しいサイトカイン カクテル IL-2 を含むと新しい培養液の添加による分化を誘導する (20 U/mL)、IL-6 (50 ng/mL)、IL-10 (50 ng/mL) と IL 15 (10 ng/mL) (図 1)。37 ° C で (日 4 日 7) から 3 日間の培養細胞
    4. 遺伝子発現プロファイルの浄化 CD38+/CD20- PBs、日 7、セルソーター (図 2) を用いたします。
  3. 初期のプラズマ細胞の生成
    1. 7 日のセルをカウントします。
    2. 2 mL に 5 × 105/mL で 12 ウェル培養皿の細胞をプレート/まあ。
    3. 新鮮な培養液を用いた IL 6 初期の Pc で PB を区別する (50 ng/mL)、IL 15 (10 ng/mL) とインターフェロン α (500 U/mL) 37 ° C で 3 日間遺伝子発現プロファイルの CD20 を浄化する-/CD38+/CD138+初期 Pc で 10 日、セルソーター (図 2) を用いたします。
  4. 長命の形質細胞世代
    1. 培養条件を変更することによって、長い間住んでいた Pc に初期 Pc を区別します。
    2. 2 mL に 5 × 105/mL で 12 ウェル培養皿の細胞の培養/よくまたは 1 mL/37 ° C で 24 ウェル培養皿で il-6, 間質細胞を使用してエアコン中と 4 月 (200 ng/mL)。
    3. 培地に 5 日間の間質細胞を培養によって間質細胞調節された媒体を取得します。間質細胞培養上清 (0.2 μ m) をフィルターし、フリーズします。
    4. 毎週更新で PC 文化に間質細胞調節されたメディアの 50% を追加します。生成された長寿命の Pc は、ヶ月13維持可能性があります。Pc の長期生存を報告された13としてのみ IL 6 と 4 月の取得でした。
    5. フローサイトメトリーからメジャー Ig 分泌には、Pc が並べ替えられます。
    6. 106セル/ml 24 時間 Pc を培養、培養上清を収穫します。IgG および IgA 人間酵素免疫測定法 (ELISA) キット11,12,13を使用して測定します。中央の IgG 分泌 10 pg/セル/日 10 〜 17 日 pg/セル/日 60 日目13時からであった。

2 PC 分化する B の分子のアトラス

注:我々 はバイオインフォマティクスのツールを抽出し、PC 分化 (GenomicScape)15に関連するアフィメトリクス GEP データから最も顕著な情報を視覚化する便利でオープン アクセスを構築しました。GEP は精製の MBCs、PrePBs、PBs および Epc を含む ArrayExpress データベース (http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/) から公開: E MTAB 1771、E MEXP 2360 E MEXP 3034 と BMPC E MEXP 236014,15。Genomicscape は、自由に利用できる webtool です。

  1. PC データセットに B の選択
    1. GenomicScape オープン アクセス bioinformatic ツール (http://www.genomicscape.com) でプラズマ細胞にヒト B 細胞と呼ばれるデータの参照メニューの PC データセット B を選択します。ユニークな遺伝子の遺伝子発現プロファイルまたは遺伝子のリストの可視化は、ホーム ページで利用可能な分析ツールで式共発現レポートツールを使用して利用可能です。
  2. チャイルド分析と主成分分析 (PCA)
    1. 選択解析ツール | webSAM SAM ツールをロードします。
    2. ヒト B 細胞のプラズマ細胞へのデータセットを選択し、比較するサンプルのグループを選択します。
    3. 興味のフィルタ リング オプションを適用する使用可能な別のフィルターを使用します。
    4. SAM ツールでの遺伝子発現プロファイルを比較するには、フォールドの変更を順列、虚偽の発見率と比較の種類の数を含むフィルターのオプションを変更します。GenomicScape は、分析を計算して、選択したグループの間発現遺伝子を提供します。
    5. 分析ツールメニューで主成分分析を選択して主成分分析を実行します。
    6. ヒト B 細胞のプラズマ細胞へのデータセットを選択し、対象のグループを選択します。
    7. 興味の遺伝子または遺伝子の差異によるとの一覧を貼り付けます。遺伝子のリストを貼り付け、選択遺伝子/ncRNAs のリストを分析するここをクリックして... Genomicscape 可視化およびダウンロードできる PCA が計算されます。

結果

生体外で通常 PC 分化の全体的な手順は、図 1で表されます。ここで提示されたプロトコルを使用して、ex vivo ひと試料で得られなかった細胞の十分な量を生成可能性があります。PC の分化に関与する転写因子の複雑なネットワークの役割を行ったキー PC 分化の転写ネットワークを規定しているメカニズムのあまり知られていないままです。細胞?...

ディスカッション

人間で PC は稀な細胞分化段階を完全に生物学的特性を妨げる解剖学的場所で行われています。体外 B 活性化分子とサイトカインのさまざまな組み合わせは、その後で発生した連続細胞分化を再現するために適用される多段階培養システムを用いた PC 分化モデルを開発した、異なる臓器・組織 vivo11,12,13。

開示事項

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謝辞

この作品はフランスのインカ (Institut 国立デュがん) からの助成金によって支えられた研究所 (PLBIO15-256)、ANR (ネクタイ スキップ)、機械がん (ミリ ・ TT)。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
anti-CD2 magnetic beadsInvitrogen11159D
Anti-CD138-APCBeckman-Coulter B49219
Anti-CD19-APCBD555415
Anti-CD20-PBBeckman-Coulter B49208
Anti-CD27-PEBD555441
Anti-CD38-PEBeckman-Coulter A07779
Anti-histidineR&D SystemsMAB050
CpG ODN(PT)SigmaT*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*
G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T
human TransferinSigma-AldrichT3309
IFN-αMerckIntron A
IMDMGibco31980-022
Recombinan Human CD40L-hiR&D Systems2706-CL
Recombinant Human APRILR&D Systems5860-AP-010
Recombinant Human IL-10R&D Systems217-IL-
Recombinant Human IL-15Peprotech200-15-10ug
Recombinant Human IL-2 ProteinR&D Systems202-IL-
Recombinant Human IL-6Peprotech200-06

参考文献

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